Determinação da atividade da succinato desidrogenase

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Determinação da atividade da succinato desidrogenase no tecido hepático 
(PROVA 4 - BIOQUÍMICA PRÁTICA) 
 
 
 
- O succinato é oxidado a fumarato pela succinato-desidrogenase. 
 
 
 
- Nos eucariotos, a succinato-desidrogenase está firmemente ligada à membrana 
mitocondrial interna. É a única enzima do ciclo do ácido cítrico ligada à membrana -> 
assim, funciona como o complexo II da cadeia transportadora de elétrons 
- FAD ----> FADH2 : o FAD está ligado covalentemente a succinato desidrogenase e é o 
aceptor final de elétrons, pois o poder redutor do succinato não é suficiente para reduzir 
o NAD+ 
- Heme b: nunca pega o elétron; não atua como centro redox nessa reação 
- O ​malonato​, um análogo do succinato, é um ​potente 
inibidor competitivo da succinato-desidrogenase​, logo é um 
bloqueador​ do ciclo do ácido cítrico. 
- A inibição da succinato desidrogenase quando na 
presença de ​malonato ​indica especificidade da reação medida. 
 
 
 
 
 
 
 
CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO:  
1. Descarboxilação oxidativa do piruvato 
2. Síntese do citrato a partir de acetil-CoA e oxaloacetato 
3. Isomerização do citrato 
4. Oxidação e descarboxilação do isocitrato 
5. Descarboxilação oxidativa do alfa-cetoglutarato 
6. Clivagem da succinil-CoA 
7. Oxidação do succinato 
8. Oxidação do malato 
 
 
OBSERVAÇÃO DO SUCCINATO NO CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO: 
 
 
 
FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA DO ADP
 
 
MODELO QUIMIOSMÓTICO PARA SÍNTESE DE ATP 
 
OBS1: ​​mitocôndrias supridas com succinato respiram e sintetizam ATP apenas quando o 
ADP e o Pi forem adicionados 
 
OBS2: ​​o transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa são processos fortemente 
acoplados, de modo que a inibição de um deles inibe o outro -> inibição fosforilação e 
inibição oxidação = controle respiratório 
 
  
- Para a medida da atividade da succinato desidrogenase pode ser utilizado um aceptor 
artificial de elétrons como um oxidante final, o qual possui potencial de óxido-redução 
capaz de reoxidar as flavoproteínas, contornando toda a sequência natural de 
transporte de elétrons na cadeia transportadora de elétrons 
 
- O 2,3,5-trifeniltetrazólio é o oxidante final. Em solução aquosa é amarelo pálido 
(oxidado) e se torna vermelho quando reduzido a diformazan. 
 
 
PRÁTICA 
Reagentes utilizados: 
 • Meio de extração: sacarose 0,32 M em tampão fosfato 0,02 M, pH 7,3 com 0,01 M de 
EDTA 
 • Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio 0,5% 
 • Succinato de sódio 1% (neutralizado com NaOH) 
 • Malonato de sódio 1% (neutralizado com NaOH) 
 • Tampão fosfato 0,02 M, pH 7,3 
 • Suspensão enriquecida de mitocôndrias, isoladas por centrifugação 
 
- Pesar 15 gramas de fígado de galinha e colocá-lo em gral contendo um pouco 
de meio de extração gelado (uma pequena alíquota dos 30 mL separados). 
- Antes de macerar, picotar rapidamente o fígado com tesoura para facilitar a 
homogeneização com pistilo, uma vez que o fígado é muito escorregadio. 
- Homogeneizar o máximo possível com gral e pistilo até que a preparação se 
transforme em uma pasta. Após, acrescentar o restante do meio extrator e 
homogeneizar. 
- Filtrar com o auxílio de um béquer e gaze apenas uma vez. 
 
 ​ ​​Técnica 1: 
- Homogeneizado 
- Transferir o conteúdo (2 15 mL) para dois tubos de centrífuga (15 mL). 
- Calibrar o peso dos tubos com auxílio de balança e de pipetas Pasteur utilizando o 
próprio homogeneizado. 
- Centrifugar o material por 10 minutos a 3000 rpm. 
- Após centrifugação, retirar o anel de gordura da parte superior dos tubos de 
ensaio com auxílio de papel higiênico e desprezar o sobrenadante em um 
béquer para não deixar mau cheiro na pia. Reservar o precipitado. 
 
- Como o precipitado contém outras frações celulares que não sejam mitocôndrias, não 
há necessidade de utilizá-lo por completo. 
 
Técnica 2: 
- preparar sete tubos de ensaio conforme a tabela abaixo 
 
- Ao preparar os tubos, obedecer a ordem de adição dos reagentes. 
 • Para desnaturar a enzima, ferver, por 3 minutos, 0,5 mL de suspensão 
mitocondrial em 1 mL de meio de extração (totalizando 1,5 mL). 
• Os tubos devem ser pré-incubados por 3-5 minutos antes da adição de 
succinato. 
 • Incubar todos os tubos ao mesmo tempo, em banho-maria a 37°C. 
 • Observar a mudança de cor após aprox. 10 minutos de incubação. 
 
 
Resultados 
 
 
 
 
INTERPRETAÇÃO 
Positivo = vermelho 
Negativo = não mudou a cor 
 
- Tubo 1: Não irá reagir. Falta suspensão mitocondrial. -> negativo 
- Tubo 2: Malonato e succinatos estão em mesma quantidade e irão competir. 
Momentaneamente o malonato ganhou a competição, mas pode ser que o succinato 
passe a ganhar com o tempo. -> negativo 
- Tubo 3: Não irá reagir. A mitocôndria foi fervida e isso desnaturou as pontes de 
hidrogênio e outras ligações. -> negativo 
- Tubo 4: Não há presença de substrato(succinato) -> negativo 
- Tubo 5: Reage. A presença de tetrazólio permite visualizar mudança de cor.-> positivo 
- Tubo 6: Não reage. Não há presença de substrato(succinato) e há presença de inibidor 
(malonato). -> negativo 
- Tubo 7: Reage. Não é possível visualizar mudança de cor pois não há tetrazólio. 
- Tubo 8: Reage. Há mais succinato que malonato e o succinato ganha a competição. -> 
positivo 
 
• Fazer relação do que dá para colocar em cada tubo para reagir e ser positiva a visualização 
de mudança de cor. 
- Tubo 1: Adicionar suspensão mitocondrial 
- Tubo 2: Adicionar succinato para que ele ganhe a competição contra malonato = 
- Tubo 3: Adicionar suspensão mitocondrial 
- Tubo 4: Adicionar succinato 
- Tubo 6: Adicionar succinato em quantidade maior que malonato 
- Tubo 7: Adicionar tetrazólio para visualizar a mudança de cor