HIV Patoclínicia

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HIV/AIDS
Disciplina de Patologia Clinica II
Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV
Definições
HIV = Vírus da imunodeficiência Humana
HIV é diferente de AIDS 
O indivíduos ser portador do HIV não necessariamente ele apresenta AIDS 
AIDS é uma doença secundária a infecção pelo vírus HIV
Segundo a CDC divide a três fases 
 Infecções assintomáticas agudas por HIV
 Distúrbios Sintomáticos não-classificáveis 
 AIDS 
Etiologia 
HIV – 1 / HIV-2 = retrovírus (família Retroviridae e gênero Lentivirus)
HIV-1 principal
RNA vírus
Agente etiológico 
HIV – Retrovírus humano 
Faz transcrição reversa (RNA DNA)
HIV-1 e HIV-2 * - é um tipo exclusivamente do continente Africano 
Icosaédrico, com espículas externas e antígenos remanescentes da célula parasitada 
Modo de transmissão (transmissão apresenta relação com a carga viral)
 Via relações sexuais 
É uma DST – via mais comum em países em desenvolvimento 
Presente em líquido seminal, com maior quantidade em situações de aumento de celularidade linfocítica local
 Principal determinante de transmissão: carga viral no plasma 
Risco em relações anais passiveis sem proteção 
Associação com sífilis, Herpes, ou infecções como Chlamydia, Gonorreia, Tricomoníase, entre outros. 
 Via sangue e hemocomponentes 
Via hemotransfusão, transplante de órgãos ou usuários de drogas que compartilham agulhas 
Mais de 90% dos casos em países pobres 
Impossível eliminar por completo o risco de transmissão via transfusões 
Primeiros 10 a 15 dias após infecção
Risco na reprodução assistida/inseminação artificial 
 Via acidente ocupacional 
Profissionais de saúde e técnicas de laboratório
Lesões percutâneas ou contato de mucosa ou pele lesada com material contaminado
 Via outros líquidos corporais 
Sem evidências de transmissão em saliva – fatores protetores inerentes (imunogloblulina HIV –específica)
Pode ocorrer por mordidas – raro
Sem evidências de transmissão por lágrimas, suor ou urina 
 Transmissão vertical/aleitamento materno 
Pode ocorrer durante gestação, parto ou AM
Transmissão pode ocorrer entre 1 e 2 trimestre da gestação 
 Mais comum no período perinatal 
Transmissão relacionada com alto índice de carga viral 
GENOMA 
As localizações relativas dos principais genes no genoma do HIV-1 estão indicadas, assim como as principais proteínas que cada gene codifica 
Gag (p55 p6, p9, p17 e p24)
Env (gp160 gp120 e gp41)
Pol (p66 e p51)
Gag – faz a síntese de glicoproteínas, que são elementos que compõe a membrana externa do vírus 
O capsídeo gera a proteína - P24 é um antígeno identificável em um dos exames para diagnostico (é dosado o antígeno p24)
Os principais componentes virais com utilidade diagnóstica incluem as proteínas do envelope viral ( gp 160, gp120, gp41), as proteínas codificadas pelo gene gag (gp55, p24 e p17) e as proteínas codificadas pelo gene pol(p66, p51 e p31)
- Patogenia 
 Receptores CXCR4 e CCR5 favorecem entrada do HIV nas células CD4+ 
O RNA adentra em uma célula do hospedeiro, e a transcriptase reversa do vírus, utilizando a maquinaria da célula hospedeira produzindo a molécula de DNA e outras proteínas que constituíram novos vírus que posteriormente serão lançados na corrente sanguínea do paciente e esses novos vírus vão reiniciar esse ciclo. 
HIV e Sistema Imune
A maioria das infecções pelo HIV-1 ocorre através das mucosas do trato genital ou retal durante a relação sexual. Nas primeiras horas após a infecção pela via sexual, o HIV e células infectadas atravessam a barreira da mucosa, permitindo que o vírus se estabeleça no local de entrada e continue infectando linfócitos T CD4+ além de macrófagos e células dendríticas
Após a transmissão do vírus, há um período de aproximadamente 10 dias, denominado fase de eclipse, antes que o RNA viral seja detectável no plasma. 
Estudos mostraram que, o inicio da infecção é iniciado por um único vírus dos quais o paciente foi infectado. Assim, em um único foco de linfócitos T CD4+ infectados na mucosa é iniciado todo o processo. A resposta imunológica inata que se estabelece nesse foco da infecção atrai uma quantidade adicional de células T para tentar combater o vírus e, essas células que foram atraídas acabam servindo como maquinaria celular para o vírus realizar sua replicação viral em maior escala. 
A partir dessa pequena população de células infectadas, o vírus é disseminado inicialmente para os linfonodos locais e depois, sistematicamente e em número suficiente para estabelecer e manter a produção de vírus nos tecidos linfoides, além de estabelecer um reservatório viral latente. 
Essa replicação viral ativa e a livre circulação do vírus na corrente sanguínea causam formação de um pico de viremia por volta de 21 a 28 dias após a exposição ao HIV. – essa viremia esta associada a um declínio acentuado no número de linfócitos T CD4+ 
Na fase de expansão e disseminação sistêmica, há indução da resposta imunológica, mas esta é tardia e insuficiente em magnitude para erradicar a infecção. Um número crescente de linfócitos T CD8+ exerce um controle parcial da infecção, mas não suficiente para impedir, em ausência de terapia, a lenta e progressiva depleção de linfócitos T CD4+ e a eventual progressão para a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS)
Esse aparecimento de uma resposta imune celular HIV-específica e a subsequente síntese de anticorpos anti-HIV levam a uma queda da carga viral plasmática (viremia) 
Como qualquer outra infecção viral, a primeira classe de anticorpo produzida durante uma resposta imune primária é a imunoglobulina M IgM. Devido a persistência do HIV, nosso organismo é continuamente exposto aos mesmos antígenos e a produção inicial de IgM é substituída pela produção de imunoglobulina G (IgG). Entretanto, ao contrário de outras doenças infecciosas, a presença de IgM não permite diferenciar uma infecção recente de uma infecção crônica, tendo em vista que a IgM pode reaparecer em outros momentos durante o curso da infecção. A IgG anti-HIV atinge níveis séricos elevados e persiste por anos, enquanto os níveis séricos de IgM tendem a desaparecer com o tempo ou apresentar padrão intermitência
Classificação
HIV agudo 
Quadro inicial, que nem todos apresentam 
Quadro clínico inespecífico 
HIV latente 
Periodo do vírus presente sem causar lesões 
Equilíbrio entre carga viral e contagem de CD4+ 
Ainda ocorrendo reações inflamatórias, com danos em outras estruturas 
HIV- AIDS
Perda de equilíbrio 
Fase de complicação e evolução para óbito
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL 
Na infecção inicial pelo HIV observa-se importante aumento da carga viral e de antígeno p24, posteriormente inibido pela ativação da resposta imune. Períodos de incubação que variam de alguns dias a 3 meses, tem sido descritos, e a soroconversão ocorre entre 1 e 10 semanas após o início da doença.
Anticorpos contra o HIV-1 podem ser detectados por teste de imunofluorescência em períodos de 2 a 8 dias após o início da infecção. 
Teste do Western blot podem ser reativos em períodos de 2 semanas de doença clínica
Testes imunoenzimaticos tornam-se reativos posteriormente em períodos médios de 31 a 58 dias. 
Testes imunológicos 
Atualmente, os testes moleculares são os mais eficazes para a confirmação diagnóstica, por permitirem o diagnóstico de infecções agudas e/ou recentes e apresentarem melhor custo-efetividade.
Esses métodos são utilizados para rastreamento em bancos de sangue e amostras sorológicas de indivíduos com sintomatologia sugestiva ou assintomática e com história de situação de risco. 
 Um teste sorológico reativo para anti-HIV em uma primeira amostra, deverá ser repetido, com a mesma amostra por metodologia de diferente procedência. 
 Se for reativo novamente, deve-se considerar o resultado positivo. 
 Recomenda-se a repetição da mesma rotina, em segunda coleta, como conduta para confirmar essa positividade em método imunoenzimático e em conjunto com outros testes de confirmação. 
 Os métodosde Western blot e Imunofluorescência em células fixadas são amplamente utilizados com testes confirmatórios em função de sua especificidade 
Western Blot é um método com elevada sensibilidade e especificidade que permite identificar anticorpos contra diferente constituintes do HIV-1
A metodologia desse teste utiliza antígenos do vírus, obtido em cultura de linhagem celular ou sinteticamente obtidos, separados em distintas regiões. 
Padrões de positividade podem ser definidos como: reatividade para p24 ou p31 e (2) gp41 ou gp120/gp160, com recomendações de que pelo menos uma das duas, p24 ou gp120/gp160, seja identificada
 A ausência de reações especificas para os diferentes antígenos HIV confirma a reação NEGATIVA 
 padrões que não atendam ao critério de positividade estabelecido são considerados indeterminados. 
 Resultados indeterminados podem ser observados em indivíduos com soroconversão precoce ou em fase avançada da infecção pelo HIV-1, casos de infecção pelo HIV-2 ou por reatividade cruzada com aloanticorpos (gravidez e indivíduos politransfundidos) ou autoanticorpos (neoplasias e doenças autoimunes)
Métodos mais comuns: Sorologia 
-Início de produção de anticorpos 2- 3 semanas após a infecção (algumas pessoas demoram 3 -6 meses )
Janela imunológica: período entre a infecção e a produção de anticorpos detectáveis pelos exames sorológicos
 
Para detecção mais precoce: busca de marcadores virais
 Carga viral por PCR
 Antígeno p24
Fase inicial
Media de 8 a 10 dias que o individuo esta infectado com o HIV mas a carga viral esta indetectável ou seja, a fase de eclipse é a fase em que não se consegue fazer o diagnostico de um paciente que foi infectado. 
após esses dias, o primeiro exame a ser detectado é o RNA viral 
posteriormente, a partir de 15 dias ( 2 semanas), é possível identificar o antígeno p24 (ELISA 4 geração) – identifica anticorpos IgG e IgM contra o HIV e o antígeno p24
OBS: a pesquisa de antígeno p24 é utilizado para casos de infecao aguda .
Demonstração de anticorpos anti-HIV e/ou detecção direta do vírus e seus componentes 
Marcadores da infecção pelo HIV na corrente sanguínea de acordo com o período em que surgem apos a infecção, seu desaparecimento ou manutenção ao longo do tempo 
Temos uma fase inicial de uma media de 10 dias em que o individuo esta infectado pelo HIV mas a carga viral está indetectável. Resumindo, esse período de 7 ~ 12 dias mais ou menos é o período denominado de Fase de eclipse a qual não é possível fazer o diagnostico do paciente com qualquer tipo de exame existente até hoje
Depois do período de eclipse, por volta de 15 dias (2 semanas ) começam a ser possível detectar o antígeno p24 que é a sorologia ELISA de 4 geração (detecta antígeno Anticorpos IgG e IgM + antígeno p24) 
OBS: só que esse antígeno p24 é possível de ser dectado em casos de infecções aguda, porque, depois de um certo tempo ( 5, 6 meses) se for realizado uma pesquisa de antígeno p24 ela será negativa, entretanto, os anticorpos sempre vão ser positivos. 
Depois de mais ou menos 20 a 22 dias, pode ser detectável o anticorpo IgM (ELISA de 3 geração ou pode-se utilizar também o teste rápido, ou seja, o teste rápido equivale ao ELISA de 3 geração)
O teste rápido pesquisa IgG e IgM aonde a segurança de detecção está por volta de 25 dias 
Controloadores de elite 
São pessoas que tem uma capacidade imunogênica extremamente potente contra o vírus, mesmo sem tomar medicação ou qualquer outra coisa, e perduram muitos anos sem a manifestação das doença.
Esses indivíduos conseguem manter a viremia em um nível que pode ser indetectável em testes moleculares. Nesses casos, o diagnóstico só pode ser realizado mediante a utilização de testes complementares convencionais Western blot, Imunoblot ou Imunoblot rápido. 
Pacientes que apresentam um sistema imunológico eficiente contra o vírus sem a necessidade de medicamentos 
A carga viral desses indivíduos é baixa, logo, a capacidade de transmissão deles é bem menor, entretanto eles transmitem.
Os controladores de elite, podem ser identificados com imunoensaios de 3 geração ou 4 geração, seguido da realização de um Western Blot como teste complementar. 
Diante dessa diversidade de cenários, não é possível a utilização de apenas um fluxograma para cobrir todas as situações que apresentam para o diagnostico de infecção pelo HIV. Assim, casos de infecção recente são melhor identificados com a utilização de uma teste de 4 geração como teste de triagem e um teste molecular como teste complementar. 
Pessoas na fase crônica da infecção, são identificados com sucesso por meio de qualquer combinação de testes de triagem ( 3 ou 4 gerações), seguido por um teste complementar (WB, IB, IBR ou TM)
Imunoensaios para triagem 
Testes de triagem aplicados em:
Triagem sorológica de sangue doado, ou órgãos para transplantes 
Estudos de vigilância epidemiológica 
Diagnostico de infecção por HIV
Detecção de anticorpos anti-HIV 
Muito sensíveis – Chance de falso-positivo
* Quando podemos ter um falso-positivo para HIV ?
R: quando ocorrer reação anticorpo cruzado, com diversos anticorpos virais. Se o paciente foi vacinado para a gripe é orientado que o paciente não faça o teste para o HIV pois existe chance de dar falso positivo para HIV 
Algumas doenças auto - imunes pode gerar anticorpo cruzado
Principal metodologia: ELISA 
1 geração – detecção indireta de anticorpos – Detectam apenas IgG – janela imunológica de 3 a 4 meses 
2 geração- detecta elementos sintéticos vindos de proteínas do HIV
3 geração : busca combinada de IgM e IgG (soroconversão de 22 – 25 dias) 
4 geração – detecta antígeno p24 e anticorpos anti-HIV - é o mais utilizado no SUS por exemplo – busca combinada de antígeno p24 e anticorpos (janela diagnóstica 15 dias)
3 e 4 gerações: mais sensíveis, capazes de detecção mais preoce 
Ensaios complementares (confirmatórios)
São exames confirmatórios, ou seja, que detectam os vírus 
Necessários devido chance de falso positivo nos testes de triagem 
Sorológico:: detectam apenas IgG específica para certas proteínas do vírus e por isso não são recomendados para confirmar a presença de anticorpos IgM HIV específicos (Ensaios de terceira ou quarta geração) ou a presença do antígeno p24 (ensaios de quarta geração). Nesse caso recomenda-se a utilizar um teste molecular para complementar o diagnostico de HIV 
 mais tardios na positividade 
Western-blot
Immunoblot
Imunoensaios rápido (P24, GP41, GP120/160)
Imunofluorescência indireta 
Teste molecular (carga viral): pesquisa direta do RNA/ DNA viral 
Método mais precoce de detecção da infecção 
Atualmente são os mais eficazes para confirmação 
A carga viral traduz o número de partículas virais no sangue periférico e, por meio de metodologias de amplificação do ácido nucleico ou sondas marcadas, pode ser estimada pela quantificação direta do RNA viral no plasma de pacientes infectados.
A avaliação da carga viral permite estabelecer o estagio da infecção viral e o risco de evolução à AIDS, indicar o inicio da terapia antirretroviral e monitorar a resposta à terapia, e pode, com ressalva, ser utilizado como teste confirmatório. 
Diagnóstico por detecção direta do HIV 
A infecção pelo HIV pode ser diagnosticada por meio da detecção direta de componentes do vírus, como o antígeno p24 ou com testes moleculares (TM) que detectam RNA ou DNA pró-viral. 
A detecção do antígeno p24 do HIV-1, de RNA ou DNA desempenha um papel importante quando a detecção de anticorpos não é possível. 
São especialmente úteis para o diagnóstico em crianças com idade inferior a 18 meses e na infecção aguda em adultos. 
É importante ressaltar que a maioria das pessoas com infecção aguda apresenta carga viral elevada e, consequentemente, maior risco de transmitir a infecção aos seus parceiros. 
Outra aplicação importante para os TM é o diagnóstico precoce da infecção pelo HIV em crianças com exposição perinatal.Crianças nascidas de mães soropositivas adquirem anticorpos anti-HIV passivamente e, dessa forma, ensaios baseados em anticorpos não podem ser utilizados para confirmar ou descartar a infecção pelo HIV em crianças com idade inferior a 18 meses de idade. 
Considerado positivo se detectados pelo menos dois dos 4 antígenos procurados são encontrados
Teste rápido 
OBS: o teste rápido é equivalente a sorologia de 3 geração, então, uma janela imunológica adequada é aquela de 30 dias para o teste rápido. Por isso que o ministério da saúde preconizou um exame seguro com 30 dias após o dia da infecção 
E no caso de um resultado negativo, repetir em mais 30 dias 
Os testes rápidos são desenvolvidos para detectar anticorpos anti-HIV em até 30 minutos
Podem ser analisadas amostras de sangue total (punção digital ou venosa), soro, plasma ou fluido oral
 Fluido oral – menor quantidade de anticorpos que sangue e período de soroconversão pode ser maior (Até 3 meses) - existe uma janela imunológica de um período maior em testes que utilizam fluido oral (cerca de 3 meses) 
 Simplifica a coleta (não invasiva, menor risco biológico)
Elaborados para execução e resultado presencial (descarta necessidade de nova amostra)
Podem ser utilizados fora do ambiente de laboratório por equipes treinadas para sua execução. 
Imunoensaios (sorologias) que reagem por imunocromatografia
Realização simples 
Dispositivos aceleram a reação Ag/AC com resultado em até 30 minutos 
 maior quantidade de antígenos e reagentes 
Formatos
- Imunocromatografia de fluxo lateral
- Imunocromatografia de dupla migração (DPP)
- Imunoconcentração
- Fase sólida
Fluxogramas de diagnóstico
 Resultado NÃO REAGENTE é liberado apenas com 1 único teste
	 Se persistir a suspeita de infecção, repetir com nova coleta após 30 dias 
 Resultado REAGENTE sempre deve ser confirmado com segundo teste de metodologia diferente
	 2 resultados reagentes = diagnóstico de infecção
 Fluxogramas com testes rápidos são preferenciais por permitirem maior agilidade e resolutividade 
VANTAGENS 
Conveniência 
Tempo curto de execução presencial 
Volume mínimo de amostra e de fácil coleta (punção digital/ fluido oral)
Dispensa amostra de confirmação (2 coleta)
Realização possível mesmo em locais sem estrutura laboratorial 
Armazenamento em temperatura ambiente 
Poupa tempo de trabalho 
Kits e reagentes prontos 
Resultados facilmente interpretados, a olho nu 
Permite diagnostico e encaminhamento imediato para seguimento em casos positivos 
* tratamento precoce e interrupção da cadeia de transmissão 
Resultados confiáveis 
Controle interno 
Altamente sensível e específico 
CRONOLOGICAMENTE 
Período de eclipse
Não existe possibilidade de detecção/diagnóstico de infecção por HIV 
Atualmente cerca de 7 dias de infecção 
Detecção quantitativa da carga viral 
Através do PCR 
Comum encontrar cerca de 10 a 12 dias após o período de eclipse 
Não é usado para diagnostico !!!! 
Detecção do antígeno p24
Podem ser encontrados cerca de 15 a 20 dias após eclipse
Detecção de anticorpos IgM 
Encontrados cerca de 20 a 25 dias após eclipse 
Teste de triagem detectam-no
Esboço de reação do organismo ao vírus 
Janela imunológica 
7 dias do eclipse + 20 dias até formação de anticorpos 
Western-blot
Detectam antígenos virais mais tardiamente, porém mais específicos
Situações especiais 
Testes no momento do parto, em caso de acidentes com materiais biológicos ou em dificuldade de realizar sorologias 
 Teste rápido 
Dois testes rápidos
+/+ Amostra reagente para o HIV
+/- fazer o 3 teste 
 + Amostra reagente 
 - amostra NR
- / - amostra NR para o HIV 
Dx de AIDS 
Diagnóstico de infecção por HIV e pelo menos uma das manifestações de imunossupressão avançada
ESTÁGIO DA INFECÇÃO RECENTE PELO HIV-1 DEFINIDOS COM BASE NO PADRÃO DE REATIVIDADE DE DIFERENTES ENSAIOS LABORATORIAIS
Estágio 0 (ou período de eclipse): é caracterizado pela ausência de marcadores virais em amostras de sangue. Esse período tem uma duração média de dez dias, a partir da infecção até a primeira detecção de RNA viral; 

Estágio I: o RNA viral é consistentemente detectável em amostras de sangue e nenhum outro ensaio laboratorial é reagente. A duração média desse estágio é de sete dias; 

Estágio II: os testes para RNA viral e antígeno p24 são reagentes, mas os anticorpos estão ausentes (resultado não reagente) no IE. A duração média desse estágio é de cinco dias; 

Estágio III: RNA, antígeno p24 e IE de terceira geração (sensíveis à detecção de IgM anti-HIV) são reagentes, mas o WB não mostra bandas especí cas do HIV-1. Esse estágio é o mais curto e tem duração média de 3 dias; 

Estágio IV: apresenta per l de reatividade idêntico ao do estágio III, mas com padrão indeterminado no WB, ou seja, observa-se a presença de bandas especí cas de HIV-1, mas que não preenchem os critérios de interpretação de WB reagente, que é de nido pela presença de duas das três bandas seguintes: p24, gp41 ou gp120/160. A duração média é de seis dias; 

Estágio V: apresenta per l de reatividade idêntico ao do estágio IV, mas com padrão reagente de WB, exceto pela ausência de reatividade da proteína p31 (pol). Esse estágio é mais longo e o tempo médio até o aparecimento da p31 é de 70 dias; 

Estágio VI: apresenta per l de reatividade idêntico ao do estágio V, mas com o padrão de reatividade do WB completo, incluindo a banda p31. A duração desse estágio não é de nida; no entanto, ele pode ser subdividido em dois períodos de infecção: recente e crônica. Essa subdivisão é baseada em testes laboratoriais que exploram certas características dos anticorpos anti-HIV, como quantidade (concentração), avidez e proporção. Dependendo do teste utilizado, a infecção recente tem duração de 120 a 180 dias após a infecção.