Aula 6 Tecnicas Purificação de Proteinas

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Técnicas de isolamento e caracterização de proteínas
Dra. Fabiana A. Carneiro
Professor Adjunto
Universidade Federal do Rio de Janeiro – Polo Xerém
email: fcarneiro@xerem.ufrj.br
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Classificação dos aminoácidos
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Ligações que mantém a estrutura de uma proteína:
Ligação covalente
• ligação peptídica
• ligação dissulfeto
Ligações não-covalentes
• interações eletrostáticas entre cargas e dipolos;
• forças de van der Waals;
• ligações de hidrogênio;
• interações hidrofóbicas.
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Estratégia geral de purificação de proteínas:
 Fonte de extração da proteína
 Solubilização da proteína
 Estabilização da proteína
 Detecção da proteína
Proteínas são purificadas por técnicas de fracionamento
Características que podem ser utilizadas nos processos de purificação:
- solubilidade, polaridade, massa molecular, presença de cargas 
iônicas, presença de sítios de ligação para moléculas específicas. 
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Estratégia geral de purificação de proteínas:
CROMATOGRAFIA 
 Cromatografia por troca-iônica 
 Cromatografia por gel filtração 
 Cromatografia de afinidade 
ELETROFORESE 
 Electroforese livre (frente móvel)
 Electroforese de zona
 Electroforese em papel
 Electroforese em acetato de celulose
 Electroforese em gel (SDS-PAGE)
 Focagem isoeléctrica
 Electroforese bidimensional
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Estratégia geral de purificação de proteínas:
Centrifugação e ultracentrifugação
 Diálise
 Salting out
Estratégias para detecção e caracterização de proteínas:
Proteômica
Western blotting
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 Ultracentrifugação: separação de proteínas por densidade/tamanho.
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 Salting out: é o efeito baseado na interação de eletrólitos e não eletrólitos, baseado no fato dos não-eletrólitos solubilizarem menos em altas concentrações de sal
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Diálise: é o processo físico-química pelo qual duas soluções (de concentrações diferentes), são separadas por uma membrana semipermeável, após um certo tempo as espécies passam pela membrana para igualar as concentrações. 
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Cromatografia em coluna
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Cromatografia de troca iônica
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Cromatografia de exclusão
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Cromatografia de afinidade
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Purificação de uma enzima hipotética
Procedimento
Volume da fração
(mL)
Proteina total
(mg)
Atividade
(unidade)
Atividade específica
(unidades/mg)
Extrato celular bruto
Precipitação com sulfato de amônio
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia de exclusão por tamanho
Cromatografia de afinidade
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Eletroforese SDS PAGE
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Tipos de coloração:
 Comassie Blue
 Comassie Coloidal
 Prata
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Western blot
Eletroforese
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Western blot
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Detecção por WB
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Focalização Isoelétrica
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Eletroforese bidimensional
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Introdução a Proteômica
Proteínas 
Estrutural
Transporte
Enzimática
Hormonal
Imunológica
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		A identificação e caracterização de proteínas, constituintes de uma matriz biológica (organismo, célula, organela, fluído biológico) que são produzidas em um determinado momento e sob determinadas condições.
Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995)
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OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA
Proteômica
Nível de expressão de proteínas
Modificações Pós-traducionais
Interações entre proteínas
Identificação de Biomarcadores
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Degradações
Proteínas
DNA
Transcrição
pré-RNAm
Splicing
RNAm
Tradução
Modificações
Fatores epigenéticos
Temperatura
Estresse
Doenças
Alimentação
Dinâmica do proteoma
WITZMANN & LI (2002)
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Biomarcadores: São moléculas biológicas indicadoras de estados fisiológicos ou patológicos, passíveis de serem mensuradas em células e fluídos biológicos.
Moore et al., (2007)
Amostra
Separação 
Identificação
ZHOU et al., (2005)
Coleta
Coleta
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Eletroforese Bidimensional (2D) 
Cromatografia líquida (CL)
Espectrometria de Massa (EM)
ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
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controle
Tratamento
Gel A
Gel B
≠
ISSAQ & VEENSTRA (2008)
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
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ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE)
controle
Tratamento
Cy5
Cy5
UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008)
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA
Digestão: tripsina
Espectrômetro de massas
m/z
Espectros de massas
Programas: identificar a proteína
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Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação (m/z) através de um campo elétrico ou magnético.	
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Fonte de Ionização
Analisador
Detector
Recipiente com baixa pressão
Amostra
Dados
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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Ionização por dessorção a laser assistida por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF)
Tempo de vôo
Detector
Laser
amostra
Karas & Hillkamp (1998)
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM (ES/ES)
Ionização por spray de elétrons –Tempo de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF)
m/z
Camara de colisão
MATT et al., 2008
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Determinação da estrutura tridimensional de proteínas
Cristalografia por difração de raios X
Ressonância Magnética Nuclear
Crio-microscopia eletrônica
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Cristalografia por difração de raios X
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Cristalografia por difração de raios X
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Ressonância Magnética Nuclear
Estrutura em solução
Sinais de deslocamento químico para cada átomo – reflexo do ambiente químico
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Ressonância Magnética Nuclear
Calculo da estrutura baseado em restrições de distância entre os átomos
Sinais de correlação entre átomos próximos até 5 angstrons
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Espectrômetro de RMN
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CRIO-MICROSCOPIA ELETRÔNICA
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Como vimos, as proteínas formam um grupo muito heterogêneo de moléculas com tamanhos e funções diferentes. O estudo de como as proteínas realizam sua atividades enzimáticas ou estruturais exigiu o desenvolvimento de técnicas para isolar uma determinada proteína (sobretudo enzimas). Daqui em diante, estudaremos como funcionam alguns dos principais métodos utilizados para purificar as proteínas.
Polar, Uncharged R Groups The R groups of these amino
acids are more soluble in water, or more hydrophilic,
than those of the nonpolar amino acids, because they
contain functional groups that form hydrogen bonds
with water. This class of amino acids includes serine,
threonine, cysteine, asparagine, and glutamine.
The polarity of serine and threonine is contributed by
their hydroxyl groups; that of cysteine by its sulfhydryl
group; and that of asparagine and glutamine by their
amide groups.
Asparagine and glutamine are the amides of two
other amino acids also found in proteins, aspartate and
glutamate, respectively, to which asparagine and glutamine
are easily hydrolyzed by acid or base. Cysteine is
readily oxidized to form a covalently linked dimeric
amino acid called cystine, in which two cysteine molecules
or residues are joined by a disulfide bond (Fig.
3–7). The disulfide-linked residues are strongly hydrophobic
(nonpolar). Disulfide bonds play a special
role in the structures of many proteins by forming covalent
links between parts of a protein molecule or between
two different polypeptide chains.
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Os íons pequenos interagem mais fortemente com a água que moléculas grandes como as proteínas. Uma forma de separar as proteínas umas das outras é denominada salting out. Nesta técnica uma alta concentração de sais são adicionados à uma solução contendo as proteínas que se deseja concentrar. O excesso de íons deixa menos água disponível para solvatar as proteínas. Elas começam a se agrupar e perder a solubilidade precipitando-se. Diferentes proteínas precipitam em diferentes forças iônicas o que permite um fracionamento (separação em proteínas precipitadas e não precipitadas) do extrato enzimáticobruto e por conseguinte concentrando a enzima de interesse nas fração precipitada ou sobrenadante.
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Algumas membranas como papel celofane e tripas de animais (com as quais fazemos lingüiça) permitem a passagem de pequenas moléculas como a água ou íons, mas impedem a passagem de grandes moléculas como as proteínas. Após a precipitação com um sal, pode ser necessário retirar o excesso de íons com que o extrato foi saturado. Isso pode ser feito por meio de um processo chamado diálise. O extrato enzimático saturado com sal é acondicionado no interior de uma bolsa manufaturada com uma membrana semi-permeável. Esta bolsa ou saco de diálise é depositada num vasilhame contendo uma solução tampão com a força iônica adequada. Os íons da solução salina vão difundir-se através do saco de diálise de modo a se espalhar homogeneamente pelo volume total do solvente. As proteínas são impedidas de sair devido ao seu tamanho ser maior do que os poros da malha do saco de diálise.
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Os elementos padrão de uma coluna cromatográfica incluem um material sólido,poroso (matriz) apoiado dentro de uma coluna, geralmente feitas de plástico ou vidro. A solução, a fase móvel, flui através da matriz, a fase estacionária. A solução que sai da coluna na parte inferior (efluente) é constantemente substituída por solução fornecida a partir de um reservatório na parte superior. A solução de proteína a ser separada é depositada no topo da coluna e infiltra na matriz sólida. A fase móvel complementar é adicionada no topo. A solução de proteína forma uma banda dentro da fase móvel que inicialmente tem a profundidade da solução de proteínas aplicada à coluna. As proteínas migram através da coluna, e são retardadas em diferentes graus pelas suas diferentes interações com o material da matriz. A banda de proteína total, portanto, aumenta conforme ele se move através da coluna. Diferentes tipos de proteínas (como A, B e C, mostrados em azul, vermelho e verde) são gradualmente separadas umas das outras, formando bandas dentro da faixa ampla de proteínas. A separação melhora (ou seja, aumenta a resolução) conforme o comprimento da coluna aumenta. No entanto, cada banda protéica individual também se amplia com o tempo devido à difusão, um processo que diminui a resolução. Neste exemplo, a proteína A está bem separada da B e C, mas impede a propagação de difusão completa separação de B e C, sob essas condições. O bombeamento da fase móvel sob alta pressão (como em HPLC e similares) ajuda a melhorar a resolução.
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A cromatografia de troca iônica explora as diferenças no sinal e amplitude da matriz de proteínas em um determinado pH. Proteínas catiônicas (com cargas líquidas positivas) aderem mais às esferas carregadas negativamente. Já proteínas mais negativas saem mais rapidamente da coluna, permitindo sua separação. Quando a fase estacionária é aniônica, dizemos que a coluna é uma trocadora catiônica e vice-versa. 
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A cromatografia de exclusão por tamanho usa esferas porosas que atrasam a percolação das moléculas menores (que entram nos poros), mas não aquela moléculas maiores que os poros. Este processo permite a separação com base no tamanho.
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A cromatografia por afinidade separa as proteinas com base na sua afinidade por um substrato. As esferas da fase estacionária são recobertas com ligantes específico da enzima de interesse. As enzimas que não reconhecem o substrato fluem livremente pela matriz estacionária. As proteínas de interesse (ou similares) interagem mais fortemente com os ligantes da matriz e ficam presas. No final da corrida, as proteinas de interesse podem ser liberadas pela passagem de uma fase móvel contendo o ligante solúvel. Este compete pelo siítio ativo das enzimas ligadas à fase estacionária, permitindo que as proteínas fluam pela coluna.
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A cada etapa de um processo de fracionamento o volume do extrato vai sendo reduzido, assim como o conteúdo total de proteínas. A atividade da enzima de interesse é determinada por um método adequado e expressa em unidades (quantidade de enzima capaz de catalisar a conversão de 1μg de substrato em produto). A atividade específica é obtida dividindo-se a atividade total pelo conteúdo protéico. Note que a atividade total sempre diminui um pouco a medida que a enzima vai sendo purificada. Isso decorre de perdas pela inativação das enzimas ou pelo fracionamento incompleto (uma parte das enzimas fica numa fração que é descartada). No entanto, esta perda é mais que compensada pelo aumento na pureza da enzima a cada passo de purificação.
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Na eletroforese, diferentes amostras são carregadas em poços ou depressões no topo de um gel de poliacrilamida (um polissacarídeo que quando se polimeriza forma uma malha com espaços de dimensões moleculares). Quando uma corrente é aplicada através do gel as proteinas se movem em função da carga elétrica que apresentam. O gel ajuda a minimizar as correntes de convecção pelos pequenos gradientes de temperatura, assim como movimentos das proteinas que não sejam induzidos pelo campo elétrico.
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O dodecil sulfato de sódio (SDS) é um surfactante (molécula anfipática) aniônico (com carga negativa) capaz de se ligar por interação hidrofóbica à proteínas, dando-lhes uma carga eletrostática negativa grande. Deste modo, as cargas intrínsecas das proteínas não exercem grande influência sobre a velocidade de migração durante a eletroforese, uma vez que o SDS proporciona um grande número de cargas negativas. Assim, quando recobertas com o detergente a proteína migra num campo elétrico com uma velocidade que é inversamente proporcional à sua carga.
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Proteínas padrão de massa molecular conhecida são submetidas à eletroforese (pista1). Estas proteínas marcadoras podem ser usadas para estimar o peso molecular de uma proteína desconhecida (pista 2). 
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As proteínas podem ser visualizadas após a eletroforese tratando-se o gel com um corante como o azul de Coomassie, que se liga a proteínas, mas não no gel em si. Cada banda no gel representa uma proteína diferente (ou  subunidade de uma proteína ); proteínas menores se movem através do gel mais rapidamente do que as proteínas maiores e, portanto, são encontrados mais próximos do fundo do gel. Este gel ilustra purificação da proteína RecA de E. coli. O gene para a proteína RecA foi clonado (capítulo 9), para que a sua expressão (síntese da proteína) pudesse ser controlada. A primeira faixa apresenta um conjunto de proteínas padrão (de massa conhecida), que servem como marcadores de peso molecular. As duas próximas pistas mostram proteínas de células de E. coli, antes e após a síntese de proteína RecA ser induzida. A quarta faixa mostra as proteínas em extrato celular bruto. Faixas subseqüentes (da esquerda para direita) mostram as proteínas presentes após sucessivas etapas de purificação. A proteína purificada é uma cadeia polipeptídica (Mr~ 38.000), como visto na pista da direita. 
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Esta técnica separa proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos. Um gradiente de pH estável é estabelecido no gel por adição de anfólitos adequados. Uma mistura de proteínas é colocada em um poço no gel. Com um campo elétrico aplicado, proteínas entram no gel e migram até que cada um atinja um pH equivalente ao seu pI.Lembre-se que quando o pH = pI, a carga líquida de uma proteína é zero. 
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Eletroforese bidimensional. As proteínas são primeiro separadas por focalização isoelétrica em gel cilíndrico. O gel é então colocado horizontalmente em um segundo gel em forma de placa e as proteínas são separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS. A separação horizontal reflete diferenças no PI; A separação vertical reflete diferenças no peso molecular. 
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Foto de um gel de 2D de E. coli. Mais de 1000 proteínas podem ser separadas por esta técnica.
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