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Universidade Federal de São Paulo ─ Campus Diadema UC: Microbiologia Básica ROTEIROS E TÉCNICAS UTILIZADAS EM AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA BÁSICA Docentes Profa. Dra. Cristina Viana Niero Profa. Dra. Karen Spadari Ferreira Profa. Dra. Renata Pascon Prof. Dr. Wagner Luiz Batista Discentes Camila Lopes Ramagnoli Natalia Maria da Silva 2015 2 SUMARIO Normas de segurança para as aulas práticas de microbiologia................................................ 3 Preparo de materiais utilizados em laboratório de microbiologia ............................................. 5 Preparo de vidrarias .................................................................................................................... 5 Esterilização ............................................................................................................................... 6 Procedimentos assépticos ........................................................................................................... 7 Flambagem de alças de platina ................................................................................................... 7 Flambagem de tubos e frascos.................................................................................................... 8 Manuseio de pipetas ................................................................................................................... 9 Preparação de lâminas ............................................................................................................... 10 Esfregaços de culturas a partir de meio líquido ......................................................................... 10 Esfregaços de culturas a partir de meio sólido .......................................................................... 11 Manuseio do microscópio ......................................................................................................... 12 Coloração de Gram ..................................................................................................................... 14 Coloração de Ziehl-Neelsen ....................................................................................................... 17 Preparo de meios de cultura ...................................................................................................... 19 Meios de cultura ........................................................................................................................ 21 Técnicas de semeadura .............................................................................................................. 23 Técnica de contagem de bactérias pelo método das diluições em placa ............................... 26 Teste de hemólise em ágar-sangue ........................................................................................... 27 Teste de motilidade .................................................................................................................... 29 Teste da catalase ........................................................................................................................ 30 Teste do tioglicolato ................................................................................................................... 31 Antibiograma ............................................................................................................................... 32 Prova do tubo germinativo ......................................................................................................... 34 Microcultivo em lâmina .............................................................................................................. 35 Colóquios das aulas práticas ..................................................................................................... 36 Roteiro nº 1 ............................................................................................................................... 36 Roteiro nº 2 ............................................................................................................................... 40 Roteiro nº 3 ............................................................................................................................... 43 Roteiro nº 4 ............................................................................................................................... 45 3 NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA O pequeno tamanho dos microrganismos e a necessidade de trabalhar com culturas que contêm muitos milhões de células requerem o conhecimento de procedimentos especiais de segurança. Existem quatro níveis de segurança, classificados de acordo com os fatores de risco envolvidos. Muitos são os fatores de risco, e entre eles podemos citar: • Tipos de atividade prática; • Tipos e fontes dos microrganismos; • Condições do laboratório; • Maturidade do estudante e experiência dos professores e técnicos (no caso de laboratórios de ensino). Um risco importante é a geração de aerossóis, gotículas de água contendo células vegetativas ou esporos de microrganismos, liberadas para o ar. Essas partículas, muito pequenas, podem ser facilmente levadas por correntes de ar e, ao serem inaladas, vão diretamente para os pulmões. Muitas das medidas de segurança adotadas são para minimizar o risco de formação de aerossóis. O trabalho com segurança, no laboratório de Microbiologia, exige o uso apropriado de equipamentos de proteção e de técnicas microbiológicas adequadas: • Equipamentos de Proteção Individual (EPI): luvas, aventais, gorros, pró-pés, máscaras, óculos; • Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC): cabine de segurança biológica (localizada em ponto de pouco tráfego e distante das portas): existem vários tipos de cabine, dependendo do grau de segurança necessário; extintores de incêndio, chuveiro de segurança e lava-olhos; • Todas as atividades devem ser realizadas de acordo com as condições conhecidas como GMLP (Good Microbiological Laboratory Practice), de forma a evitar a disseminação dos microrganismos, proteger os operadores da possibilidade de infecção e o experimento prático de contaminações com microrganismos do exterior. Uma das atividades mais importantes para manter a área física em condições adequadas é a limpeza geral do laboratório, com cuidado especial para as superfícies e com o lixo produzido. Você que está iniciando seus estudos em Microbiologia deve ler, atentamente, as normas abaixo, tantas vezes quanto necessário, para segui-las rigorosamente: 1. Todo trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de EPI: avental de mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos fechados. 2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem. 4 3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele. 4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, etc. na bancada de trabalho – eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação. 5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen, que deverá estar acesa durante a maior parte do tempo. 6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra similar (verifique se o bico de Bunsen está aceso). 7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o que fazer, a cada passo. 8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não pegarmais material que o necessário nem material indevido. 9. Todo o material deve ser devidamente identificado. 10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas. 11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas. 12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto. 13. Colocar materiais contaminados recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias. 14. Deixar as Placas de Petri tampadas sobre a bancada. 15. Deixar as lâminas fornecidas para visualização sobre as bancadas. 16. Deixar os tubos com culturas nas estantes. 17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino para retirar o óleo de imersão. 18. Quando terminar de trabalhar com culturas, esterilizar alças e fios de platina; retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante, lavar as mãos em água corrente e depois com álcool 70% ou similar; deixar secar ao ar. 19. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado. 20. Retirar todo o EPI quando sair do laboratório. As técnicas especiais de manuseio seguro serão explicadas e demonstradas pelo professor no momento apropriado, mas convém lembrar que é necessário um cuidado especial para manipular e/ou transportar materiais contendo microrganismos (em caixas ou bandejas, mantendo o material em pé para evitar derramamento ou vazamento acidental). Lembre que você poderá manusear alguns microrganismos potencialmente patogênicos. 5 PREPARO DE MATERIAIS UTILIZADOS EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 1. Preparo de vidrarias 1.1 Tubos, balões, erlenmeyers e outros Os tubos de ensaio devem ser tamponados com algodão hidrófobo; alternativamente podem ser tampados com roscas que devem resistir à autoclavação. Os frascos maiores devem ser tamponados com um tampão mais firme, constituído de algodão hidrófobo, gaze e papel alumínio. 1.2 Pipetas As pipetas devem ser providas de algodão na extremidade destinada à aspiração. Podem ser acondicionadas uma a uma, embrulhadas em papel ou em recipientes metálicos adequados, que comportam várias pipetas, no caso de laboratórios com uma rotina mais intensa. O volume deve ser anotado no papel quando embaladas individualmente ou no recipiente. 1.3 Placas de Petri Existem no comércio placas plásticas esterilizadas e descartáveis. Entretanto, podem ser utilizadas placas de vidro, que devem ser lavadas e em seguida esterilizadas embrulhadas em papel, a fim de se manterem estéreis durante o armazenamento. Se as placas forem utilizadas imediatamente, não há necessidade de embrulhar. 2. Esterilização No caso de tubos e balões contendo meios de cultura, a esterilização deve ser feita em autoclave, sob pressão (115-120ºC durante 20-30 minutos ou condições equivalentes; o tempo também depende da quantidade e disposição dos frascos dentro da autoclave). O material deve ser coberto com papel impermeável (alumínio, por exemplo) para evitar o umedecimento dos tampões. Componentes termolábeis de meios de cultura (alguns açúcares, antibióticos, uréia, etc.) são esterilizados separadamente, por filtração e depois adicionados ao meio-base, este esterilizado em autoclave. A vidraria seca pode ser esterilizada em forno de Pasteur, a 170-180ºC durante 1,5 horas ou 160ºC por 2 horas (o tempo deve ser contado após a temperatura ser alcançada). No caso de tubos vazios com rosca, que não suportam altas temperaturas em calor seco, podem ser autoclavados com a tampa semi-rosqueada (para o vapor de água penetrar dentro do tubo) ou envolvidos em papel grau cirúrgico e depois secos em estufa. 6 Em qualquer caso, deve-se, periodicamente, validar o processo de esterilização. Para isso, existem indicadores, como, por exemplo, tiras de papel impregnadas com esporos bacterianos, que devem ser submetidas ao processo de esterilização e depois cultivadas para verificar se os esporos foram eliminados. PROCEDIMENTOS ASSÉPTICOS Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas: • Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o mais próximo possível do operador, e deve ser realizado o mais rapidamente possível; • Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar; • Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente; ele deve ser mantido aberto ao redor do bico de Bunsen, na posição mais horizontal possível e deve ter sua “boca” novamente flambada antes de ser fechado. Quando você flamba o tubo, o calor cria uma corrente de convecção, que força o ar para fora, impedindo a entrada de contaminantes; • Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre nenhuma superfície; devem permanecer na mão do operador, entre o dedo mínimo e a palma da mão durante todo o procedimento; • Durante as manipulações, as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em contato com o ar o menor tempo possível; • As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis como, por exemplo, panos, superfície da bancada, paredes externas de placas ou tubos, etc. 1. Flambagem de alças de platina Para transportar o material a ser semeado ou repicado utilizamos, na grande maioria das vezes, um fio de níquel-cromo com a ponta dobrada em alça, capaz de carregar líquidos, a alça de níquel-cromo. Ela deve ser devidamente flambada e esfriada antes de cada operação. Segura- se a alça perto de sua parte superior, como se faz com um lápis (dedo polegar, indicador e médio), num ângulo próximo à posição vertical. Essa posição deixa o dedo mínimo livre para segurar os tampões dos tubos. Preferencialmente trabalhar com alças descartáveis. Existem alças calibradas, que carregam um volume conhecido do material, podendo ser usadas em determinações quantitativas. Algumas vezes usamos o fio de níquel-cromo sem dobrar a ponta, o estilete. 7 Chamamos de flambagem o aquecimento gradual da ponta da alça, pois depois do uso em culturas, o aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. Deve-se proceder da seguinte maneira: 1) Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama - essa é a região "fria" da chama; 2) Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama, acima do cone azul claro, mantendo-a até que fique completamente vermelha; 3) Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro"); 4) Esfriar a alça no ar, mantendo-a na mão, sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se contamine outra vez); alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo ou placa de Petri (regiões estéreis); 5) Usar imediatamente; 6) Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso. Observação: para que a alça carregue o líquido é necessário que o círculo exterior esteja bem fechado; se necessário, use um alicate. Figura 1: Técnica de flambagem de alças. 2. Flambagem de tubos efrascos 1) Afrouxe o tampão do frasco ou tubo, para que ele saia facilmente; 8 2) Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita, mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão, rode o frasco e não o tampão - o tampão fica fixo); 3) Passe a boca do tubo para frente e para trás, dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso, não se esqueça, o tampão fica preso na mão do operador; 4) Depois de usar, antes de fechar, repita a operação acima; 5) Feche o tubo, recolocando o tampão, rodando o tubo e não o tampão. Figura 2: Técnica de flambagem de tubos e frascos. 3. Manuseio de pipetas 1) As pipetas calibradas ou de Pasteur, com algodão na ponta, previamente esterilizadas, acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser manuseadas na frente do bico de Bunsen; 2) Segurá-las pela região do bocal, como um lápis, colocando o aspirador e mantendo o dedo mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido; 3) Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos; 4) A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante, imediatamente após o uso, para ser transportada. 9 4. Cadeia asséptica PREPARAÇÃO DE LÂMINAS 1. Preparação de lâminas fixadas 1.1 Esfregaços de culturas a partir de meio líquido 1) Identificar a lâmina com lápis dermatográfico; 2) Acender o bico de Bunsen e se posicionar bem à frente dele; 3) Segurar a alça de níquel-cromo entre o polegar e o indicador da mão direita, como um lápis, se você for destro; 4) Flambar a alça ao rubro; 5) Segurar o tubo com a mão esquerda, retirar o tampão de algodão (ou outro qualquer) do tubo com a cultura, utilizando para isso o dedo mínimo (dedo do bacteriologista); rodar o frasco e não o tampão - o tampão fica fixo, alojado entre o dedo mínimo e a palma da mão direita; 6) Flambar a boca do tubo; 7) Esfriar a alça no ar, ao lado do bico de Bunsen ou nas paredes internas do tubo; 8) Introduzir a alça fria dentro do meio de cultura; 9) Tomar uma alçada da cultura, flambar a boca do tubo novamente, recolocar o tampão e descansar o tubo fechado na estante (cuidado para não encostar na boca do tubo, que deverá estar quente); 10) Depositar a alçada sobre a lâmina limpa; esfregar, espalhando bem o material de modo que ele ocupe uma grande área da lâmina. 11) Se necessário, repetir a operação, para colocar mais alçadas na lâmina; 12) Deixar a lâmina secar ao ar ou sobre a chama do bico de Bunsen, sem encostar nela (para evitar superaquecimento e formação de aerossóis); 13) Quando toda água tiver evaporado, fixar o material à lâmina, passando-a três vezes na chama do bico de Bunsen (usar uma pinça para segurar a lâmina). Um aquecimento excessivo distorce a morfologia das bactérias. Observação: se for uma cultura pouco turva, não convém espalhar muito, minimizando a probabilidade do número de microrganismos ficar menor do que o exigido pela sensibilidade do método. Esterilização Uso Descontaminação (121ºC/15’) Lavagem Secagem Acondicionamento 10 Figura 3: Técnica de esfregaços de culturas a partir de meio líquido. 1.2 Esfregaços de culturas a partir de meio sólido 1) Identificar a lâmina com lápis dermatográfico; 2) Depositar uma alçada de solução fisiológica ou água destilada na lâmina; 3) Acender o bico de Bunsen e se posicionar bem à frente dele; 4) Segurar a alça de níquel-cromo entre o polegar e o indicador; 5) Flambar a alça ao rubro; 6) Com um movimento do punho da mão esquerda abrir a placa (a placa está sobre a mesa de trabalho, com a tampa apoiada), levantando a base (onde estão as bactérias, sobre o meio de cultura) até uma altura adequada; deixar aberta o menor tempo possível; 11 7) Esfriar a alça na parte interna da tampa da placa de cultura; 8) Tomar uma pequena amostra do crescimento bacteriano, tocando a porção superior de uma colônia, levemente, com a alça estéril, de modo a não arrastar o meio de cultura – para fazer lâminas finas; 9) Tampar novamente a placa (toda esta operação é feita ao redor da chama do bico de Bunsen); 10) Se a cultura estiver em tubo, desenroscar a tampa do tubo ou retirar o tampão de algodão do tubo com a cultura, utilizando para isso o dedo mínimo (dedo do bacteriologista); a tampa ou o tampão ficam alojados entre o dedo mínimo e a palma da mão; resfriar a alça nas paredes do tubo; introduzir a alça estéril no tubo e tomar uma pequena amostra do crescimento bacteriano, tocando levemente o crescimento bacteriano, de modo a não arrastar o meio de cultura; flambar a boca do tubo novamente, recolocar o tampão e descansar o tubo fechado na estante; 11) Emulsionar o material na água, espalhando muito bem, usando toda a superfície da lâmina, de modo a fazer um esfregaço fino; 12) Flambar a alça antes de depositá-la sobre a bancada; 13) Deixar a lâmina secar ao ar ou sobre a chama do bico de Bunsen, sem encostar na chama, para evitar a formação de aerossóis; 14) Fixar o material à lâmina seca, passando-a três vezes na chama do bico de Bunsen. O excesso de aquecimento pode distorcer a morfologia das bactérias Observações: É importante fazer lâminas finas, para que se tenha uma boa visualização. No preparo de lâminas de material biológico de consistência sólida, por exemplo, material interdental, utilizar algumas alçadas de água de torneira para obter um esfregaço homogêneo. Quando são preparadas lâminas para algumas colorações especiais, a fixação não pode ser feita pelo calor. 2. Manuseio do microscópio 1) Manuseie o microscópio com cuidado; 2) Limpe as lentes com lenço de papel - o papel toalha não deve ser usado, pois pode riscar as lentes; 3) Acenda a luz; 4) Ajuste a distância interocular - isso é muito importante, pois se ela não estiver correta você verá uma imagem dupla; 5) Coloque a lâmina; em geral, o seu centro deve ficar no meio do foco luminoso; 6) Coloque 01 gota de óleo de imersão; 12 7) Ajuste a iluminação. A observação com objetiva de imersão é feita com muita luz, o que é conseguido com o diafragma totalmente aberto e o condensador o mais alto possível; 8) No caso de observação de bactérias, o ajuste do foco é feito, na maioria das vezes, diretamente com a objetiva de Imersão. Nesse caso, coloque a objetiva de imersão dentro do óleo, encostando-a cuidadosamente na lâmina; rode o parafuso macrométrico vagarosamente, até que passe o foco; em seguida, volte com o parafuso micrométrico até o ajuste fino do foco. Se a objetiva sair do óleo, volte tudo e recomece; 9) Alternativamente, você poderá encontrar o foco em aumentos menores e, só depois, colocar o óleo e encaixar a objetiva de imersão; 10) Desça um pouco o condensador, para aumentar o contraste; 11) Ao final dos trabalhos, tire todo o óleo da objetiva com um lenço de papel. 13 COLORAÇÃO DE GRAM Em 1884, o dinamarquês Christian Gram desenvolveu um método de coloração que, até hoje, é fundamental na Bacteriologia. No método desenvolvido por Gram, o esfregaço bacteriano é tratado pelas seguintes soluções, na ordem: 1º violetade genciana (ou cristal violeta); 2º lugol (ou solução de iodo-iodetada); 3º álcool ou álcool-acetona (agente descorante); 4º fucsina ou safranina (corante de contraste); A importância do método de Gram reside no fato dele ser um método diferencial, o que permite distinguir as bactérias em dois grupos: - GRAM-POSITIVAS, que retêm o complexo violeta de genciana - lugol e aparecem coradas em azul (ou azul-arroxeado); - GRAM-NEGATIVAS, que são descoradas pela lavagem com álcool, e se coram posteriormente em vermelho, pelo corante de contraste. Tal divisão ocorre graças a coloração diferenciada que cada grupo apresenta de acordo com a composição química de sua parede celular. As Gram positivas retêm o complexo cristal violeta - lugol na sua grande camada de peptideoglicanos, aparecendo assim coradas em azul- arroxeado. Já as Gram negativas não retêm o complexo mencionado por possuirem uma camada menor de peptideoglicanos, sendo assim descoradas pela lavagem com álcool. Com isso, elas posteriormente são coradas em vermelho pelo corante de contraste (fucsina). 1. Método 1.1 Preparo do esfregaço 1) Colocar uma gota de salina sobre uma lâmina de vidro; 2) Espalhar sobre a lâmina uma pequena quantidade da cultura bacteriana com o auxílio de uma alça de platina ou descartável de forma a obter uma camada homogênea e pouco densa; 3) Secar o material ao ar e fixar pelo calor (50ºC) ou com metanol absoluto durante 1 minuto. 1.2 Coloração 1) Cobrir toda a lâmina com a solução de cristal violeta; 2) Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia; 3) Cobrir a lâmina com lugol; 4) Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia; 5) Inclinar a lâmina e gotejar álcool etílico a 95% (ou álcool acetona); 6) Lavar a lâmina rapidamente com água corrente; 7) Cobrir com fucsina de Gram; 14 8) Aguardar 30 segundos; 9) Lavar a lâmina e secar (sem esfregar). 2. Controle de qualidade - Gram positivos: Staphylococcus, Streptococcus e Enterococcus. - Gram negativos: Escherichia coli, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, entre outros. 3. Reagentes 3.1 Violeta de genciana - Violeta de genciana 10g; - Ácido fênico 20g; - Álcool absoluto 100mL; - Água destilada 900mL. 3.2 Álcool 95% Em água destilada, ou álcool comercial. Obs: pode-se usar mistura álcool-acetona em várias proporções. 3.3 Lugol - Iodeto de potássio 2g; - Iodo 1g; - Água destilada 300mL. 3.4 Fucsina de gram (Para uso, diluir 1/10 em água destilada) - Fucsina básica 1g; - Álcool 95% 10g; - Ácido fênico 5g; - Água destilada 100 mL. 3.5 Safranina - Safranina 1g; - Álcool 1mL; - Água destilada 100mL. 4. Funções dos reagentes • O calor funciona como agente fixador. • O ácido fênico (presente na solução de violeta de genciana) é o mordente (que facilita a penetração do corante). 15 • O complexo violeta de genciana-lugol funciona como corante essencial e cora protoplasma bacteriano. • O álcool é o agente diferenciador e auxilia na retirada da camada lipídica em Gram negativas). • A fucsina (ou a safranina) é o corante de contraste e cora Gram negativa. COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN Existem bactérias que, devido à composição química de suas paredes, não se coram bem pelo método de Gram, necessitando de condições mais drásticas para que o corante penetre em seu interior. O método de Ziehl-Neelsen é baseado no fato de que certas bactérias, como os bacilos da tuberculose e da lepra (micobactérias), quando tratadas pela fucsina fenicada a quente resistem ao descoramento subsequente por álcool acidificado. Assim sendo, permanecem coradas em vermelho, enquanto outras bactérias não resistem e tomam a coloração de contraste. Esta propriedade, chamada de álcool-ácido-resistência, está relacionada a existência de certos lipídeos (em grande quantidade) na parede celular, os quais não permitem a extração do corante pelo agente diferenciador. Este método permite, portanto a classificação das bactérias em dois grupos: álcool-ácido resistentes (resistem a descoloração e ficam vermelhas) e não álcool-ácido resistentes (descoram e ficam azuis graças a posterior coloração com azul de metileno). 1. Método 1.1 Preparo do esfregaço 1) Colocar uma gota de salina sobre uma lâmina de vidro; 2) Espalhar sobre a lâmina uma pequena quantidade da cultura bacteriana com o auxílio de uma alça de platina ou descartável de forma a obter uma camada homogênea e pouco densa; 3) Secar o material ao ar e fixar pelo calor (50ºC) ou com metanol absoluto durante 1 minuto. 1.2 Coloração 1) Cobrir o esfregaço com fucsina fenicada; 2) Aquecer a lâmina até produzir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de 5 minutos; 3) Lavar a lâmina em água corrente, suavemente; 4) Colocar álcool-ácido clorídrico 3% até que não se desprenda mais corante; 5) Lavar a lâmina com água; 6) Cobrir o esfregaço com azul de metileno por 30 segundos; 7) Lavar a lâmina com água; 16 8) Deixar secar e observar ao microscópio com objetiva de imersão. 2. Controle de Qualidade - Álcool-ácido resistentes: micobactérias, rhodococcus, nocardias. - Não álcool-ácido resistentes: Escherichia coli, entre outros. 3. Reagentes 3.1 Fucsina de Ziehl - Fucsina básica 1g; - Álcool 95% 10mL; - Ácido fênico 5g; - Água destilada 100 mL. 3.2 Álcool-ácido - Álcool 95% 990 mL; - Ácido clorídrico concentrado 10 mL. 3.3 Azul de metileno - Azul de metileno 33,5 mL; - Água destilada 1000 mL. 4. Funções dos reagentes • A fucsina fenicada é o corante específico para micobactérias. • O calor funciona como agente fixador. • A lavagem com álcool-ácido clorídrico 3% é responsável por descolorir todas as bactérias, exceto as micobatérias, pois o corante (fucsina fenicada) tem preferência por sua grande camada lipídica. • O corante azul de metileno é responsável por colorir as outras bactérias. 17 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 1. Preparo, distribuição e armazenamento dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser preparados a partir da pesagem de cada um dos componentes separadamente (exemplo: peptona, glicose, cloreto de sódio, etc.); existem no comércio os meios de cultura nos quais os nutrientes já estão previamente misturados na proporção adequada; em alguns casos se parte da matéria prima bruta, por exemplo: carne, batata, etc. Após a pesagem dos componentes (os fabricantes ou os manuais indicam a proporção adequada), o meio deve ser dissolvido em água destilada, geralmente a quente (principalmente se forem meios sólidos, pois o ágar só se dissolve a quente). Devem, então, ser esterilizados, na maioria das vezes em autoclave, sob pressão (115-120ºC, por 20-30 minutos ou equivalente), sendo que a maneira de acondicionar o meio vai depender de como ele vai ser utilizado (em placas ou em tubos). 1.1 Meios de cultura em tubos Os meios de cultura que vão ser utilizados em tubos, quer sejam sólidos, semi-sólidos ou líquidos são, após a dissolução dos componentes, distribuídos diretamente nos tubos; são, a seguir, tamponados o e o conjunto vai ser esterilizado em autoclave, sob pressão. Depois de autoclavados, os tubos contendo meios sólidos são deixados esfriar em pé ou inclinados, para que o meio solidifique na condição adequada ao uso que se destinam, em cada caso. 1.2 Meios de cultura em placas de Petri Os meios de cultura que vão ser usados em placas de Petri (sempre meios sólidos) costumam ser preparadosem grande quantidade (de acordo com o necessário a ser usado em alguns dias - 15 a 20 mL por placa), em Erlenmayers ou similares; o meio é autoclavado e, ainda líquido, vertido nas placas estéreis, ao redor da chama do bico de Bunsen, preferencialmente dentro de uma capela de fluxo laminar, com todo o cuidado para evitar contaminações: 1) Limpar e desinfetar muito bem a bancada, que deve estar completamente livre de objetos estranhos à operação; 2) Segurar o frasco com a mão esquerda; remover o tampão com o dedo mínimo da mão direita e mantê-lo até terminar a operação; se achar melhor, pode segurar o frasco com a mão direita e manter o tampão com a esquerda; 3) Flambar a boca do frasco; 4) Com a mão que estiver segurando o tampão, abrir ligeiramente a tampa da placa de Petri e verter vagarosamente (evitar bolhas) o meio de cultura estéril até cobrir totalmente o fundo, 18 mas não encher muito, pois o ágar não deve tocar a tampa da placa (o volume de meio varia entre 15 e 20 mL); fechar a placa; 5) Empurrar, cuidadosamente, a placa com meio de cultura, fechada, para o lado, trazendo uma placa vazia para perto do bico de Bunsen; 6) Flambar a boca do frasco e repetir a operação até a última placa ou o final do meio de cultura; 7) Esperar solidificar, antes de mexer nas placas; 8) Armazenar em posição invertida (a tampa da placa apoiada na superfície). 1.3 Teste de esterilidade Os meios prontos devem ser incubados por 24h em estufa a 35°C para confirmar sua esterilidade. 1.4 Armazenamento O armazenamento dos meios de cultura é feito, geralmente, em geladeira. Entretanto, se o material for guardado por muito tempo nessas condições (mais do que 05 dias) ocorre evaporação da água do meio de cultura e a superfície seca, prejudica o crescimento dos microrganismos (principalmente os meios em placa). Por isso, prefere-se os tubos com rosca, ao invés dos fechados com tampões de algodão; também por isso, costuma-se manter as placas em sacos plásticos selados. Uma alternativa para o armazenamento prolongado dos meios de cultura em geladeira, é autoclavá-los em porções de 20 mL, em frascos com rolha de borracha e selo de alumínio (chamados "frascos de penicilina"). Dessa maneira, os meios podem permanecer por longos períodos, inclusive à temperatura ambiente. Quando houver necessidade de uso, os meios líquidos são simplesmente distribuídos em condições assépticas, para tubos previamente esterilizados em forno de Pasteur; os meios sólidos são fundidos em banho-maria fervente e distribuídos em tubos estéreis ou vertidos diretamente em placas de Petri previamente esterilizadas (a quantidade contida num frasco é a adequada para uma placa). Existem procedimentos especiais, no caso, por exemplo, de um dos componentes do meio de cultura não poder ser esterilizado por autoclavação, por não suportar altas temperaturas, decompondo-se. É o caso da uréia, que deve ser esterilizada por filtração e depois misturada ao meio de cultura básico, que contem os outros nutrientes e que foi preparado da maneira convencional; é o caso também do sangue, que é colhido do carneiro (ou de outro animal) em condições de assepsia e misturado a um meio-base, já estéril, para o preparo do ágar-sangue. 19 2. Controle de qualidade Além do teste de esterilidade, deve-se retirar algumas unidades de cada partida de meio de cultura e semeá-las com bactérias de comportamento conhecido para verificar se o meio está funcionando adequadamente. 3. Meios de cultura Chama-se de meio de cultura a um conjunto de substratos ou nutrientes, nos quais os microrganismos são cultivados em laboratório. Dá-se o nome de cultura a qualquer crescimento ou cultivo de microrganismos. Quanto ao estado físico, os meios de cultura podem ser líquidos, sólidos ou semi-sólidos: • Nos sólidos, o agente endurecedor é o ágar-ágar, polissacarídeo extraído de algas marinhas, que é utilizado em menores concentrações nos meios semi-sólidos. • Os meios líquidos permitem um crescimento mais abundante das bactérias, devido à sua fluidez (culturas para enriquecimento), porém não permitem o isolamento (separação) das bactérias. Este só é obtido em meio sólido, em placas, utilizando técnica adequada de semeadura (técnica de obtenção de colônias isoladas). Quanto à composição, os meios de cultura podem ser ricos ou pobres: • Os primeiros contêm substâncias orgânicas complexas (triptona, vitaminas, etc.) e devem ser utilizados para o cultivo de bactérias exigentes nutricionalmente, ou seja, com menor capacidade de síntese. Exemplo: ágar-sangue, ágar-chocolate, BHI (“brainheart-infusion”) etc. • Os meios pobres são utilizados para microrganismos menos exigentes, com maior capacidade de síntese, como, por exemplo, as enterobactérias e os fungos. A maioria dos meios de cultura contém ingredientes cuja composição química não é bem definida. Exemplo: peptona (proteína de carne ou de soja parcialmente digerida); triptona (maior grau de digestão); extrato de levedura, etc, são os meios complexos. Entretanto, existem meios cuja composição química é definida, chamados de meios sintéticos, que contêm aminoácidos, vitaminas, açúcares e sais purificados e em quantidades conhecidas. A maioria dos meios sintéticos é muito cara e sua utilização é restrita a ensaios de doseamento de aminoácidos e vitaminas através do crescimento de bactérias. Existem meios de cultura seletivos, que são utilizados quando se privilegia cultivar um determinado grupo de microrganismos, a partir de um material contaminado com vários. A seletividade é obtida pela adição de substâncias que inibem o crescimento dos microrganismos não desejados. 20 Exemplos: • EMB = “eosine - methylene - blue” - os corantes inibem o crescimento de bactérias que não as enterobactérias, pseudomonas e outros bacilos aparentados com estas últimas. • Mac Conkey = contém corantes e sais biliares e tem utilização similar ao EMB. • Thayer-Martin = ágar-chocolate adicionado de vancomicina, colistina e nistatina, utilizado para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae a partir de secreções vaginais ou uretrais. • Ágar-batata-dextrose = meio pobre que é utilizado acidificado (pH < 3,5) para o crescimento exclusivo de bolores e leveduras. Existem meios que são diferenciais, ou seja, permitem distinguir uma determinada característica dos microrganismos. Exemplo: os meios EMB e Mac Conkey, além de serem seletivos, são diferenciais, permitindo distinguir as bactérias lac+ (fermentadoras de lactose) das lac- (não fermentam lactose), que apresentam colônias com cores diferentes. Há ainda os meios para provas bioquímicas, cuja composição permite testar alguma característica metabólica da bactéria. Esses meios são utilizados na identificação de bactérias. Convém ressaltar que, dependendo do microrganismo que visamos cultivar, devemos escolher adequadamente os meios de cultura, bem como as condições de cultivo, no que diz respeito à temperatura, tempo e atmosfera de incubação. 21 TÉCNICAS DE SEMEADURA Dependendo do objetivo do nosso trabalho, utilizamos diferentes procedimentos para a semeadura ou inoculação de nosso material no meio de cultura. Podemos semear diferentes materiais: urina, fezes, sangue, pus, etc. nos laboratórios clínicos; água, medicamentos, alimentos, etc., nos laboratórios de controle de qualidade microbiológica nas indústrias e laboratórios de Saúde Pública. Os mesmos procedimentos são usados para transferir um microrganismo deuma cultura para um novo meio de cultura; esta operação costuma ser chamada de repique (o verbo é repicar). Para transportar o material a ser semeado ou repicado, utilizamos: - alça de níquel-cromo: deve ser devidamente flambada e esfriada (na parte interna do tubo ou frasco, ou na parte interna da tampa da placa). Existem alças calibradas, que carregam um volume conhecido do material, podendo ser usadas em determinações quantitativas. Segura- se a alça como se faz com um lápis (dedo polegar, indicador e médio). - pipetas esterilizadas: utilizadas para determinações quantitativas (contagens de microrganismos). Essas operações devem ser feitas em ambiente de esterilidade, o qual pode ser obtido com um bico de Bunsen com a chama alta, ao redor da qual existe uma esfera livre de microrganismos, ou em câmaras de fluxo laminar, preferencialmente. Existem procedimentos básicos que visam: • Evitar contaminação das culturas com microrganismos do ambiente; • Evitar contaminação cruzada entre culturas; • Evitar contaminação do operador; • Evitar que o operador contamine as culturas. 1. Manuseio de tubos Quando se manuseia um tubo ou outro frasco similar num laboratório de microbiologia, ele sempre tem algum tipo de tampão. Este deve ser removido (se for pequeno, com o dedo mínimo) e a boca do tubo deve ser flambada na ocasião da abertura (operação que faz com que microrganismos do ambiente, que porventura cheguem, morram) e na operação de fechamento (podemos esbarrar a alça contaminada na boca, contaminando-a, o que traz risco de contaminação do tampão e conseqüentemente do operador). Observações: Durante todo o procedimento, o tampão deve permanecer no dedo mínimo, não na bancada. 22 Segurar o tubo somente quando estritamente necessário. Utilize a estante para apoio, senão, às vezes, vai faltar mão. 2. Manuseio de placas de Petri Quando se está utilizando alça de níquel-cromo, posicionamos a placa com a tampa apoiada na bancada, de modo que possamos abri-la, examiná-la e fechá-la com apenas uma das mãos (a outra está segurando a alça). Esse procedimento permite que a placa fique aberta o menor tempo possível, minimizando o risco de contaminação por microrganismos do ambiente. De preferência, manusear a placa em posição inclinada, na direção da chama e não na horizontal. Quando utilizamos pipetas para a semeadura de materiais líquidos, temos que utilizar a placa na posição normal na bancada, para que o líquido não escorra. Também se utiliza essa posição em alguns procedimentos com fungos. Após as placas serem semeadas, elas devem ser colocadas na estufa, para o crescimento dos microrganismos, em posição invertida, ou seja, a tampa apoiada. Se fizermos o contrário, parte da água do meio de cultura que sofre vaporização condensa na tampa, e cai sobre a cultura, prejudicando a técnica de semeadura utilizada. 3. Técnicas de obtenção de colônias isoladas (método de esgotamento) O isolamento de colônias é necessário para separar os diferentes tipos bacterianos existentes num material; freqüentemente, cada bactéria vai apresentar um aspecto diferente de colônia no que diz respeito a tamanho, cor, brilho, bordas (regulares ou irregulares). Tal procedimento permite que se estude separadamente cada bactéria, verificando sua forma, propriedade tintorial, características bioquímicas e antigênicas, permitindo sua identificação. O mesmo procedimento é utilizado para isolar bactérias de culturas mistas. Para que se obtenha um bom isolamento, utilizam-se placas comuns (cerca de 10 cm de diâmetro) contendo meio de cultura apropriado. Placas pequenas não devem ser utilizadas, por não apresentarem a superfície necessária. 3.1 Procedimento a) Tomar uma alçada do material e fazer estrias, bem próximas umas das outras, até a metade da placa; flambar e esfriar a alça; b) A partir de a), fazer outras estrias, ocupando ¼ da superfície da placa, em direção perpendicular; flambar e esfriar a alça; c) Repetir a operação, a partir de b); d) Incubar as placas em temperatura, atmosfera e por tempo adequado; e) Observar os tipos de colônias obtidos. Observação: eventualmente pode ser utilizado um número maior de operações. 23 Figura 4: Método de esgotamento. 4. Semeadura com alça de Drigalski A alça de Drigalski original era um bastão de vidro retorcido (de modo a formar um triângulo na sua extremidade), mas pode-se utilizar um fio grosso de níquel-cromo. É utilizada na técnica clássica de contagem de bactérias, realizadas nos laboratório clínicos e de controle de qualidade de alimentos, medicamentos e cosméticos. A semeadura com essa alça visa uma homogeneização do inóculo sobre a superfície do meio de cultura. 4.1 Procedimento 1) Com a placa em posição normal (tampa para cima), pipetar 0,1 ml do material a ser semeado; 2) Flambar a alça, esfriar na parte interna da tampa, e espalhar o inóculo por toda a superfície da placa (manuseando a alça em todas direções); 3) Incubar as placas na posição invertida (tampa para baixo), nas condições de tempo, temperatura e atmosfera adequadas; 4) Proceder a leitura (contagem de colônias). 5. Semeadura com “swab” É uma técnica utilizada para se obter uma semeadura homogênea do inóculo nos antibiogramas. 5.1 Procedimento 1) Molhar o “swab” na suspensão bacteriana; 2) Pressionar o “swab” contra a parede do tubo, para retirar o excesso de líquido; 3) Fazer estrias bem próximas, umas das outras, por toda a superfície da placa, em 3 direções. 24 TÉCNICA DE CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DAS DILUIÇÕES EM PLACA 1. Procedimento 1) A partir de suspensão bacteriana de E. coli a ser contada, realizar as diluições sucessivas, de 10-1 até 10-5, da seguinte maneira: transferir 1 mL da suspensão original para o tubo contendo 9 mL de salina estéril. Homogeneizar. Esta é a diluição 10-1. A partir deste tubo repetir o procedimento para obter os tubos com as diluições 10-2, 10-3, e assim sucessivamente até 10-5. 2) A partir de cada diluição, proceder à inoculação de 0,1 mL em cada placa contendo meio de Agar simples. 3) Espalhar o inóculo com o auxílio de uma alça de Drigalsky. 4) Incubar as placas a 37°C durante 24h. Posteriormente, selecione uma das placas incubadas e conte o número de colônias. Para efeito de cálculo, considerar as placas que tenham entre 25 e 250 colônias. Essa escolha é feita para se obter um resultado o mais seguro possível: a contagem em placas com muitas colônias não é confiável, pois as colônias, muitas vezes, estão juntas. Em placas com contagem baixa, verificou-se que a flutuação estatística é muito grande, às vezes, da ordem de 10 vezes na mesma diluição. Calcule a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte fórmula: UFC = (nº de colônias) x 10** x (diluição utilizada para contagem) UFC significa Unidade Formadora de Colônia, uma vez que a contagem feita referente às colônias e não às células presentes. 10** é um fator de correção. Exemplo: Caso contadas 105 colônias em uma placa onde foi feita diluição de 10-2, o cálculo final será: UFC = 105 x 10 x 10-2 = 1,05 x 105 UFC/mL 25 TESTE DE HEMÓLISE EM ÁGAR-SANGUE As bactérias podem ser diferenciadas e assim classificadas através da macro-morfologia de suas colônias. Uma dessas características fenotípicas é a hemólise em ágar-sangue. A hemólise pode ser classificada em três tipos: - Beta-hemólise: lise total dos eritrócitos - presença de halo transparente ao redor dascolônias semeadas; - Alfa hemólise: lise parcial dos eritrócitos - presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas; - Gama hemólise: sem hemólise - ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros). 1. Método 1.1 Preparo do meio 1) Pesar e hidratar o meio base conforme instruções do fabricante. Podem ser utilizados como meio base: tríptico de soja ágar (TSA), Columbia ágar, BHI ágar, Mueller Hinton ágar; 2) Esterilizar em autoclave; 3) Esfriar a base à +/- 50ºC; 4) Adicionar 5 mL de sangue desfibrinado de carneiro ou coelho para cada 100 mL de base; 5) Homogeneizar delicadamente para não formar bolhas; 6) Distribuir em placas de Petri. Observação: o pH deve se manter em torno de 7. 1.2 Inoculação 1) Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura por esgotamento; 2) No final da semeadura, picar o meio com a alça introduzindo-a verticalmente ao ágar para verificar hemólise em profundidade; 3) Incubar à 36ºC (+ ou - 1ºC) por 24 horas. 2. Controle de qualidade - Hemólise beta: Streptococcus pyogenes ou Staphylococcus aureus; - Hemólise alfa: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae; - Hemólise gama: Enterococcus faecalis ou Staphylococcus epidermidis. 3. Recomendações Não adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemácias rompem-se, dificultando o estudo de hemólise. 26 Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biológicos em geral costuma ser abundante. Sempre que necessário, isolar a colônia em estudo para os procedimentos de identificação, para não correr o risco de se trabalhar com cepas misturadas. 27 TESTE DE MOTILIDADE As bactérias móveis podem conter um ou mais flagelos, sendo assim classificados em: - Monotríquias: único flagelo em uma das extremidades; - Lofotríquias: tufo de flagelos em uma ou ambas as extremidades; - Anfitríquias: único flagelo em cada extremidade; - Peritríquias: cercada de flagelos. O movimento pode então ser classificado em: - Positivo e polar: as bactérias apresentam movimento em flecha; - Positivo e peritríquio: as bactérias apresentam movimentos circulares; - Negativo: apenas movimento browniano. 1. Método 1) Tocar uma colônia isolada com agulha bacteriológica ou alça estéreis; 2) Inocular a bactéria até dissolvê-la na parede do tubo contendo o meio líquido; 3) Incubar por duas horas a 35ºC; 4) Adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pasteur em lâmina e cobrir com lamínula; 5) Examinar ao microscópio com aumento de 400X. 2. Controle de qualidade - Pseudomonas aeruginosa apresenta movimento positivo e polar, enquanto Klebsiella sp apresenta movimento negativo. 28 TESTE DA CATALASE O desdobramento do peróxido de hidrogênio em oxigênio e água é mediado pela enzima catalase. Quando uma pequena quantidade de um microrganismo que produz a catalase é introduzido em peróxido de hidrogênio, rapidamente bolhas de oxigênio, o produto gasoso da atividade da enzima, são produzidas. 1. Método 1) Com auxílio de uma alça ou vara de madeira estéreis, transferir uma pequena quantidade do crescimento bacteriano puro para superfície de uma lâmina de vidro limpa e seca. 2) Colocar uma gota de água oxigenada a 3% em uma porção da colônia na lâmina. 3) Observar a formação das bolhas de gás, indicando um teste positivo. 2. Controle de qualidade Os estafilococos e os estreptococos são respectivamente controles positivo e negativo. 29 TESTE DO TIOGLICOLATO As bactérias podem ser classificadas de acordo com sua necessidade ou não de oxigênio para crescerem em: - Aeróbias estritas: crescem somente na presença do oxigênio; - Anaeróbias estritas: crescem somente na ausência do oxigênio (o gás é letal a essas bactérias); - Anaeróbias facultativas: o oxigênio não é essencial para o seu crescimento, porém crescem melhor na presença do mesmo; - Microaerófilas: necessitam do oxigênio para crescerem, porém em níveis menores; - Anaeróbias aerotolerantes: oxigênio não é letal, porém crescem melhor na ausência do mesmo. Para o teste, os tubos de tioglicolato apresentam um indicador de oxigênio, a rezazurina, presente somente na região superior do meio (+/- 2 cm), a qual possui coloração rósea. Sendo assim, a partir da análise da concentração das bactérias nas diferentes regiões do tubo é possível classificá-las com sua necessidade ou não do oxigênio para crescerem, como pode ser visualizado na figura abaixo: 1. Controle de qualidade - Aeróbias estritas: bactérias do gênero Pseudomonas; -Anaeróbias estritas: Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Porphiromonas gengivallis, Prevotella intermedia; - Anaeróbias facultativas: Escherichia coli, espécies de Staphylococcus e Streptococcus e todas as bactérias da família Enterobacteriaceae; - Microaerófilas: bactérias do gênero Campylobacter; - Anaeróbias aerotolerantes: Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophillus. 30 ANTIBIOGRAMA Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. Estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (Minimun Inhibitory Concentration) ou MBC (Minimun Bactericidal Concentration). 1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. 2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns fatores são essenciais: - Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas; - Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias, devendo-se realizar a coloração de Gram. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão de turbidez (Escala de Mac-Farland). Através desse método é possível analisar pelo método de difusão a resistência de E. coli a alguns antibióticos. 1. Materiais - “Swab” estéril; - cultura líquida fresca de Eschirichia coli; - placas de Petri, com meio Mueller-Hinton sólido; - discos de papel com antibióticos; - pinças; - régua. 2. Procedimento 1. Introduzir nas culturas um “swab” estéril, retirar o excesso de líquido comprimindo a ponta do “swab” nas paredes do tubo; 2. Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton).Espalhar bem, de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do meio sólido; 3. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos); 31 4. Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças); 5. Incubar em estufa a 37ºC, por 16 a 24 horas; 6. Medir os halos formados (em mm), registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactéria Discos com antibióticos Oxacilina OX (1g/mL) Carbemicilina CB (100g/mL) Kanamicina K (30g/mL) Rifampicina RIF (30g/mL) Sulfonamida SUL (300g/mL) Estreptomicina EST (10g/mL) Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R< 10 S> 13 R< 13 S> 17 R< 12 S> 15 R< 16 S> 20 R< 12 S> 17 R< 11 S> 15 32 PROVA DO TUBO GERMINATIVO Cepas de Candida albicans produzem tubos germinativos a partir de sua célula levedurifome quando adicionadas a um meio nutriente líquido e incubadas a 35ºC por 3 horas (similar ao estado in vivo). 1. Método 1) Suspender um pequeno inóculo das células levedurifomes de uma colônia isolada em 0,5 mL de soro; 2) Incubar entre 35º e 37ºC por não mais que 3 horas; 3) Após a incubação, adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pauster em lâmina e cobrir com lamínula; 4) Examinar ao microscópio a presença dos tubos germinativos. Um tubo germinativo é definido como um apêndice que é metade da largura e três a quatro vezes o comprimento da célula de levedura da qual tem origem. Na maioria dos casos, não há nenhum ponto de constrição na origem do tubo nas células. 2. Controle de qualidade Candida albicans e Candida tropicalis são usadas como controle positivo e negativo respectivamente. 33 MICROCULTIVO EM LÂMINA 1. Método 1) Cortar um pequeno bloco de ágar apropriado que tenha sido previamente vertido em uma placa a uma profundidade de cerca de 2 mm. O bloco deve ser cortado com uma lâmina de bisturi estéril. 2) Colocar uma lâmina estéril na superfície de uma placa contendo solução ágar 2%. Como alternativa, colocar um pedaço redondo de papel de filtro ou papel toalha na placa estéril, adicionar duas zaragatoas, e posicionar a lâmina de microscópio por cima. 3) Adicionar o bloco de ágar na superfície da lâmina de microscópio esterilizada. 4) Com um ângulo direito da alça em L, inocular os quatro quadrantes do ágar com o organismo. Aplicar uma lamínula estéril sobre a superfície do ágar. 5) Se o filtro de papel é utilizado, adicionar uma pequena quantidade de água estéril para o fundo do prato de cultura. Colocar a tampa da cultura e incubar a 30ºC. 6) Após um período de incubação apropriado, remover a lamínula (trabalhando dentro de um gabinete de segurança biológica) e fixar o organismo na lamínula com 1 a 2 gotas de álcool (esperar secar). 7) Colocar em uma lâmina contendo uma gota de lactofenol azul algodão ou anilina. 8) Observar ao microscópio a forma característica e o arranjo dos esporos. Figura 6: Disposição da lâmina. 34 COLÓQUIOS DE AULAS PRÁTICAS AULA PRÁTICA 1 Primeira Parte Preparo de meios de cultura e vidraria utilizadas em rotina de microbiologia, esterilização e técnicas de manipulação asséptica Introdução Entre os vários métodos de esterilização existentes, dois são os mais indicados para serem utilizados no laboratório, devido à facilidade e segurança que oferecem: 1) esterilização por calor úmido em autoclave e, 2) calor seco em forno Pasteur (estufa esterilizadora). Entretanto, para que estes métodos funcionem corretamente, deve-se considerar o binômio tempo- temperatura, pois se o mesmo não for correto, a esterilização não ocorrerá. Objetivos Aprender a preparar e acondicionar meios de cultura e materiais de laboratório para a esterilização por autoclave (calor úmido); Aprender a forma correta de uso da estufa e da autoclave (métodos de esterilização por calor seco e úmido respectivamente); Aprender a técnica de manipulação asséptica Procedimento 1 Preparo de meios de cultura e vidrarias a) Desinfecção do local de trabalho com álcool 70%; b) Preparar o meio de cultura LB sólido: - 10g de peptona caseína; - 5g de extrato de levedura; - 10g de NaCl; - 15g de ágar bacteriológico; - H2O q.s.p. 1000 mL. (ajustar a fórmula para o volume final de 60 mL) e acondicionar o meio de cultura em Erlemmeyer de 250 mL. c) Acondicionar duas placas de Petri para autoclavação (seguir orientação do instrutor); d) Demonstração (em grupo de 10 alunos) da técnica de esterilização pelo calor úmido sob pressão (autoclavação) a partir do meio de cultura preparado e o material de acondcionamento; e) Demonstração da técnica de esterilização pelo calor seco (forno de Pasteur); f) Treinamento individual da técnica de flambagem de alças e agulhas de semeadura bacteriológica, tubos de ensaio e balões de fundo chato (seguir orientação do instrutor). 2. Manipulação asséptica a) Manipulação de placas de Petri: treinar repetidas vezes a técnica de abrir e fechar uma placa de Petri (100 x 15mm), utilizando-se apenas uma das mãos, conforme demonstração do instrutor. b) Enumerar 5 tubos de ensaio (13 x 100mm) previamente esterilizados, com os números de 1 a 5. Identificar com o número do grupo, turma e data. A partir de um tubo de ensaio (16 x 150mm) (Tubo “A”) contendo 10mL de caldo nutritivo previamente esterilizado transferir, assepticamente com o auxílio de uma pipeta de 5 mL, volumes de 5 mL, no tubo nº 1, em seguida transferir 4 mL do tubo nº 1 para o tubo nº 2 (com auxílio de uma pipeta de 5 mL), repetir este procedimento segundo esquema 1. Incubar o material (tubos de nº 1 a 5 e o tubo “A”) na estufa a 36ºC. Realizar a leitura após 48-72 horas de incubação e registrar os resultados na tabela 1. 35 Figura 1: Diluições. c) Distribuição asséptica do meio LB ágar em placas de Petri (de acordo com a Figura 2); Figura 2 Tabela 1: Aspecto dos tubos após 48-72h horas. Tubos (n°) Límpido Turvo Tubo “A” 01 02 03 04 05 Interpretação dos resultados ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ Tubo “A” Caldo nutritivo 5 mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL n°01 n°02 n°03 n°04 n°05 5 mL Tubo “A” Caldo nutritivo 5 mL 4 mL 3 mL 2 mL 1 mL n°01 n°02 n°03 n°04 n°05 5 mL 36 Segunda Parte Anti-sepsia de Mãos: Experimento de Price Introdução As mãos constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infecção cruzada. A quantidade de micro-organismos constituintes da microbiota normal da pele dos profissionais de saúde deve ser reduzida, assim como possíveis micro-organismos patogênicos presentes devem ser eliminados. Objetivo Verificar o grande número de micro-organismos que existe na pele. Observar a eficácia da lavagem das mãos e do uso de um anti-séptico na redução dos micro- organismos da pele. Procedimentos Dividir o fundo da placa de Petri contendo Agar-sangue em três partes com canetapara vidro, e identificar a placa; Pegar um swab com assepsia, umedecê-lo em salina estéril e esfregar sobre a pele da palma da mão. A seguir, semear 1/3 da placa de Ágar-sangue com swab identificando “mãos sem lavar”; Lavar as mãos com detergente (sabão), vigorosamente em todas as superfícies, durante 1 minutos. A seguir, pegar outro swab esterilizado, umedecer em salina esterilizada e esfregar na pele das mãos lavadas, então semear o segundo 1/3 da placa, e identificar: mãos lavadas: Realizar anti-sepsia das mãos pré-lavadas (1 minutos com sabão) com álcool (durante 1 minuto). A seguir utilizar de outro swab estéril umedecido em salina também esterilizada, esfregar nas palmas das mãos lavadas e desinfetadas e semear na terceira parte do meio de cultura. Identificar: mãos com anti-sépsia – seguir o esquema da Figura abaixo. Figura 3 - Esquema do experimento de Price (anti-sepsia de mãos) Incubar por 24-48 horas à 37ºC, e observar o crescimento de colônias nas três partes da placa. Fazer a contagem (quando possível) do número de colônias em cada uma das condições analisadas. Interpretação dos resultados ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ __________________________________________ __________________________________________________________________ Terceira parte I – mãos sem lavar II – mãos lavadas: 5 min - sabão III – mãos lavadas + álcool Salina esterilizada Swab estéril I – mãos sem lavar II – mãos lavadas: 5 min - sabão III – mãos lavadas + álcool I – mãos sem lavar II – mãos lavadas: 5 min - sabão III – mãos lavadas + álcool Salina esterilizada Swab estéril 37 Eficácia da luz ultravioleta sobre micro-organismos Introdução A luz ultravioleta apresenta efeitos sobre micro-organismos, principalmente quando os mesmos encontram-se suspensos no ar. Lâmpadas de luz ultravioleta são utilizadas para controle de micro-organismos em ambientes hospitalares, em capelas, laboratórios (fluxo laminar) e para controle de micro-organismos do ar. Por outro lado, devido ao seu comprimentos de onda, não apresenta poder de penetração. Objetivos Verificar a ação da luz ultravioleta sobre os micro-organismos. Observar o baixo poder de penetração da luz ultravioleta Procedimentos Semear 2 placas de Petri contendo meio de cultura (LB), pela técnica do esgotamentos. Aguardar 15 minutos; Expor as placas à luz ultravioleta (dentro do fluxo laminar) por 2 minutos, da seguinte forma (Figura 4): Placa A: expor a placa semeada aberta à luz ultravioleta Placa B: expor a placa fechada à luz ultravioleta Incubar a 37ºC por 24-48h. Observar as placas semeadas na aula, observando o efeito da luz ultravioleta sobre a bactéria testada. Figura 4 – Esquema de procedimento a serem seguidos na verificação da ação da luz ultravioleta sobre Escherichia coli. Interpretação dos resultados ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ IMPORTANTE! Ao final de todos os procedimentos NÃO SE ESQUEÇAM de realizar a desinfecção da bancada com álcool a 70% e de organizar o local de trabalho. LUZ ULTRAVIOLETA 2 minutos Placa aberta Placa fechadaLUZ ULTRAVIOLETA 2 minutos Placa aberta Placa fechada 38 AULA PRÁTICA 2 11..11 Experimento 1: a) Fazer esfregaço de colônias bacterianas, corar pelo método de Gram, observar ao microscópio e discutir resultados com professor. b) Com auxílio de um swab, remover células da mucosa oral e fazer um esfregaço, deixar secar e fixar. Em seguida corar pelo método de Gram, observar ao microscópio e discutir resultados com professor. 1.2 Experimento 2: Você recebeu uma lâmina contendo dois esfregaços para coloração de Ziehl-Neelsen, após a coloração observe ao microscópio e discuta com professor. obs: A classificação deverá ser quanto à resistência ou não à descoloração com álcool ácido, sendo assim, teremos: Bactérias álcool ácido resistentes (BAAR) = vermelhas e Bactérias não álcool ácido resistentes = azul. 1.3 Experimento 3: Observe a placa de agar sangue e descreva as características fenotípicas de cada bactéria. Nota- se alguma diferença? Se sim, qual? 1.4 Experimento 4: As bactérias podem ser classificadas de acordo com sua necessidade ou não de oxigênio para crescerem em: aeróbias estritas, anaeróbias facultativas, anaeróbias aerotolerantes, anaeróbias estritas e microaerófilas. Você recebeu tubos de tioglicolato contendo cada um, um tipo de cultura bacteriana. O meio de cultura, no caso, possui um indicador de oxigênio, a rezazurina que está presente somente na região superior do meio ( 2 cm) e tem coloração rósea. Responda, com relação à exigência de O2 para seu metabolismo: Como é possível classificar as bactérias de cada tubo de acordo com a necessidade de oxigênio? Por quê? 11 22 33 1111 22 33 11 11 39 1.5 Experimento 5: Teste da catalase A catalase é uma enzima produzida por certas bactérias e que desdobra o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio livre (2 H 2 O 2 → 2 H2O + O2). Você recebeu uma placa contendo: Staphylococcus Streptococcus Com auxilio de uma alça remova uma porção da colônia bacteriana e transfira para uma lâmina de vidro. Em seguida, adicionar uma gota de H2O2 10 V sobre a bactéria e observar o aparecimento de bolhas (indica reação positiva). Descreva o que você observou. Qual a finalidade da prova da catalase? Obs.: Quando a colônia é obtida de uma placa de Ágar-sangue, é essencial que o meio de cultura não seja removido da superfície, pois hemácias contêm catalase. 1.6 Experimento 6: Motilidade As bactérias móveis podem conter um ou mais flagelos e são classificadas em: A - monotríquias (único flagelo em uma das extremidades); B - lofotríquias (dois ou mais flagelos em uma das extremidades); C - anfitríquias (tufo de flagelos em cada extremidade); D - peritríquias (cercadas de flagelos). Para verificar esta característica pode-se realizar experimento em meio líquido ou semi-sólido. Procedimento em meio líquido: - tocar uma colônia isolada com agulha bacteriológica estéril ou alça - inocular a bactéria até dissolvê-la na parede do tubo contendo o meio líquido - incubar por duas horas a 35oC aa bb H2O2 + Bactéria a H2O2 + Bactéria b 40 - montar gotas da suspensão bacteriana entre lâmina e lamínula - observar em microscopia de campo claro, em aumento de 400X, com diafragma semi-fechado. Interpretação: (+) POLAR (monotríquia ou lofotríquia com flagelos em uma das extremidades) – bactérias apresentam movimento de flecha. (+) PETRITRIQUIO – bactérias apresentam movimentos circulares. (-) apenas movimento browniano. Procedimento em meio semi-sólido. - tocar uma colônia bacteriana com agulha bacteriológica estéril e inocularo tubo contendo o meio - incubar 24h a 35oC - realizar a leitura Interpretação: (+) quando há crescimento ao redor do local inoculado (-) crescimento bacteriano apenas no local inoculado Você recebeu dois tubos, A e B com bactérias distintas, observe e responda: Qual bactéria apresenta movimento? Por esta técnica é possível classificar o tipo de movimento? 41 AULA PRÁTICA 3 1.1 Experimento 1 Você recebeu uma placa de ágar sangue (AS) e uma de ágar MacConkey (MC), devidamente identificadas. As bactérias, como qualquer célula viva, precisam de substâncias e nutrientes para viver e se multiplicarem. Quando os nutrientes são obtidos de um meio artificial, este é denominado MEIO DE CULTURA. a) Observar e descrever a características fenotípicas de cada bactéria. b) Analisar as placas quanto à presença ou ausência de crescimento. c) Responda qual dos meios de cultura pode ser classificado como: Meio enriquecido, Meio seletivo, Meio diferencial. Por quê? d) Faça a coloração de Gram e identifique as bactérias quanto à morfologia, arranjo e coloração. AASS MMCC 1.2 Experimento 2 a) Observe os dois tubos A e B contendo meio líquido. É possível identificar em qual deles houve crescimento bacteriano? Por quê? b) É possível identificar se esta cultura bacteriana é uma cultura pura? Por quê? c) Observe esta mesma cultura semeada em uma placa contendo meio de cultura sólido. É possível responder a questão anterior? Por quê? 1.3 Experimento 3 Você recebeu um tubo com meio líquido contendo duas bactérias diferentes. Para obter colônias isoladas, você deverá: Semear as bactérias em meio ágar LB (Luria-Bertani: triptona,extrato de levedura, NaCl e Agar bacteriológico) pela técnica de esgotamento de acordo com a figura abaixo: 1.3 Experimento 4: Antibiograma aa bb aa bb 42 1. Imergir um swab estéril na suspensão preparada, retirando o excesso do líquido na parede do tubo; 2. Realizar a semeadura padrão até a metade da placa de Agar Mueller Hinton, girando-a em 6 direções, com o cuidado de que toda a superfície do Agar seja semeada; 3. Deixá-la secar por aproximadamente 10 minutos sobre a bancada; 4. Com o auxílio de uma pinça esterilizada, selecionar os discos a serem utilizados, dispondo-os e pressionando-os, cuidadosamente, na placa de Agar Mueller Hinton; 5. Deixar a placa por 5 – 10 minutos sobre a bancada, antes de incubá-la a 35ºC, durante 16-18 horas em aerobiose. 6. Anotar os discos de antibióticos testados; 7. Medir o tamanho dos halos de inibição com auxílio de uma régua, anotando em milímetros; 8. Com ajuda de tabelas, interpretar os valores e resultados obtidos. Bactéria Discos com antibióticos Ampicilina AMP Carbenicilina CAR Gentamicina GEN Cefalotina CFL Ciprofloxacino CIP Estreptomicina EST Escherichia coli Leituras (mm) Resultados Padrões R≤ 13 S≥17 R≤19 S≥ 23 R≤ 12 S≥ 15 R≤ 14 S≥ 18 R≤ 15 S≥ 21 R≤11 S≥ 15 43 AULA PRÁTICA 4 ESTRUTURAS FÚNGICAS Fungos Filamentosos e Leveduras Os fungos apresentam semelhanças com organismos do Reino Animal, tais como presença de quitina em sua parede celular e o armazenamento de glicogênio. Do mesmo modo, compartilham com as bactérias a capacidade de causar doenças infecciosas e métodos semelhantes de isolamento e culturas. Por outro lado, estes apresentam características próprias e diferenças em relação aos outros Reinos, o que permitiu seu agrupamento em um Reino distinto. O termo fungo provém do latim, fungus e significa cogumelo. Consistem numa forma antiga de vida, com cerca de 400 milhões de anos. Juntamente com as bactérias, são considerados os principais responsáveis pela manutenção da estabilidade geoquímica da biosfera, e são distribuídos amplamente na natureza, seja em ambientes aquáticos como em terrestres. Crescem em ambientes com temperaturas elevadas, assim como em regiões com temperaturas muito baixas. A maioria das espécies cresce por extensão contínua e ramificações de estruturas filiformes denominadas hifas. Alguns possuem valor comercial graças ao seu importante papel na fermentação de bebidas, alimentos, produção industrial de antibióticos e etanol. Por outro lado, estão também relacionados com muitas doenças em plantas, animais e seres humanos. O Reino Fungi engloba organismos com morfologias distintas, uni e multicelulares, e podem ser classificados em leveduras: a) leveduras – fungos unicelulares microscópicos, que podem ser patogênicos; b) bolores – também denominados como fungos filamentosos, são multicelulares, constituídos de células microscópicas cilíndricas ligadas nas extremidades formando um filamento denominado hifa. Quando grande quantidade de hifas estão agrupadas, são visíveis a olho nu e denominadas de micélio. Podem ser patogênicas; e c) cogumelos, organismos macroscópicos, não-patogênicos. A cultura de um micro-organismo refere-se à capacidade que este tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é evidenciado macroscopicamente pela formação de uma unidade estrutural, denominada colônia. As colônias de determinados fungos geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através dos seus aspectos macro-estruturais de uma colônia, é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Sendo assim, o conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada espécie fúngica. Na observação das características culturais de determinado fungo, devemos ressaltar os seguintes aspectos: a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espécie fúngica. Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a superfície da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus quando cultivadas a 35ºC. Já o fungo Piedraia hortae apresenta crescimento muito lento, sendo sua colônia restrita ao centro da placa de Petri. b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados muitos desenhos que vão desde morfologias bem delimitadas até achados de projeções irregulares que lembram franjas. Além disso, também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para indicar o possível patógeno implicado, como por exemplo, nas colônias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura. c) textura: é a característica mais importante utilizada na caracterização de uma colônia fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas. As colônias podem ser classificadas quanto à textura em diversos tipos: 44 colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com algodão, colônias granulosas (poeira): aquelas formadas por fungos que esporulam ou produzem grandes quantidades de conídios, colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido aveludado, colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo, podendo ter superfície lisa ou irregular e sempre com ausência de filamento, ou seja, não algodonosa, colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual
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