para prova de genetica

Prévia do material em texto

1
Biologia Molecular
O Dogma Central da Biologia Molecular foi postulado por
Francis Crick em 1958.
Ele explica como ocorre o fluxo de informações do código
genético.
Esse modelo mostra principalmente que uma sequência de um
ácido nucleico pode formar uma proteína, entretanto o
contrário não é possível.
Segundo esse dogma, o fluxo da informação genética segue o
seguinte sentido: DNA → RNA→ PROTEÍNAS.
2
NUCLEOTÍDEO
A Estrutura do DNA
3
Transcrição do RNA Tradução
4
Diagnóstico Molecular PCR
• Método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido
desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo,
Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.
• Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR é uma das técnicas mais
comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas
para diversas tarefas.
APLICAÇÕES DA PCR
• o sequenciamento de
genes,
• diagnóstico de doenças
hereditárias,
• identificação de "impressão
digital" genética (usado em
testes de paternidade e na
medicina forense),
• detecção de diagnóstico de
doenças infecciosas e
• criação de organismos
transgênicos.
Técnicas de Amplificação de Ácidos Nucléicos
5
Ensaios de hibridização de ácidos 
nucléicos
• PCR
nsaios padrão Sonda marcada em solução DNA alvo não marcado ligado a suporte sólido
Dot-blot Qualquer DNA ou RNA marcados, mas 
usualmente um oligonucleotídeo
Populações complexas de DNA ou RNA, sem prévio fracionamento por tamanho, 
mas pipetadas diretamente sobre a membrana, formando pequenos pontos (dots)
Southern blot Qualquer
Geralmente DNA genômico complexo (mas podem ser clones individuais de 
DNA), digerido com enzimas de restrição, fracionado por tamanho (em 
eletroforese), e transferido para membrana
Northern blot Qualquer População complexa de RNA (p. ex.: RNA celular total ou mRNA), fracionada por tamanho (em eletroforese) e transferida para uma membrana
Hibridização in situ de cromossomo Geralmente um clone genômico marcado DNA nos cromossomos (em geral em metáfase) de células lisadas numa lâmina de 
microscópio
Hibridização in situ de tecido
Geralmente uma ribo-sonda anti-sense (isto é, 
complementar à fita de RNA do tecido) ou ainda 
um oligonucleotídeo
RNA dentro de células de tecidos, em secções fixadas numa lâmina de 
microscópio
Blot de colônia Qualquer Colônias de bactérias ou células, obtidas por plaqueamento em ágar, e transferidas para uma membrana
Blot de plaque viral (ou fágica) Qualquer Plaques de lise fágica em tapete de bactérias formado em placa de ágar nutriente, transferidas para membrana.
Ensaio de hibridização de grid de 
colônias Qualquer
Clones de bactérias transferidos por robô, de forma geometricamente ordenada, 
em membrana. Pode ser feito manualmente, em escala menor.
Ensaios reversos DNA alvo marcado em solução Sondas não marcadas ligadas a suporte sólido
Dot-blot reverso DNA complexo Oligonucleotideos pipetados em pontos sobre uma membrane
DNA microarray DNA complexo Clones de DNA aplicados em micro-pontos sobre uma membrana com auxílio de 
um robô
Microarray de oligonucleotídeos DNA complexo Oligonucleotideos sintetizados diretamente sobre lâmina de vidro, e, micro-pontos
ordenados.
Teste de paternidade
Um dos resultados mais interessantes do Projeto Genoma
humano foi a descoberta de que aproximadamente 99,9% do
genoma humano é comum entre qq indivíduo.
0,1% 3 milhões de pb
polimorfismo
resulta na variabilidade
individualidade 
6
Individualidade única
• Determinação da paternidade
• Identificação de criminosos
• Aconselhamento genético
Uso de MARCADORES GENÉTICOS 
denominados STR (pequenas repetições em 
tandem – microssatélites)
7
PCR na Investigação de Paternidade
• A exame de paternidade é realizada através da análise do DNA contido
no sangue, colhidos da mãe, filho e suposto pai.
• São analisados uma bateria de marcadores polimórficos do tipo STRs
(small tandem repeats) que estão distribuídos por todo genoma
humano.
• Os STRs são formados por pequenos motivos (de 1 a 8 nucleotídeos)
repetidos sequencialmente e são encontrados em regiões não
codificantes por todo o genoma.
• Para elucidar uma investigação de paternidade leva-se em conta um
mínimo de 12 locos de microssatélites (STRs)
8
• A técnica utilizada é a PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) que amplifica o
DNA e obtém padrões específicos (alelos) que são comparados entre mãe,
filho e suposto pai. Atualmente, estão disponíveis kits comerciais para a
realização de PCR multiplex com alvos STR.
• Cada um de nós carrega, em princípio, dois alelos para quaisquer destas
repetições, uma vinda do genoma de nossas mães e outra de nossos pais.
• Quando transmitimos à progênie estas "marcas", uma delas apenas passará à
F1, que receberá a outra do outro parceiro (ou parceira) do cruzamento.
• Então, estudando estas regiões, que são polimórficas em tamanho,
poderemos inferir hereditariedade e individualidade.
Próxima figura, http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/, mostra como poderiam aparecer estes fragmentos de
restrição reconhecidos por uma sonda, numa análise de relação de parentesco.
• O RFLP para paternidade gera um número de bandas
grande (simplificado na figura), fruto da digestão do DNA
genômico do indivíduo com enzimas de restrição e do
reconhecimento de múltiplos fragmentos pela sonda
dirigida contra a região repetida de interesse.
• Neste esquema as cores das bandas maternas e paternas
correspondem às cores de seus ovócito e espermatozóide.
• D1, filha do casal, tem 2 bandas maternas, sendo as
restantes necessariamente paternas.
• D2, filha de um primeiro casamento da mãe, tem 3
bandas maternas mas as bandas paternas (em vermelho)
não coincidem todas elas com as esperadas no atual
marido (uma pequena diferença de migração é suficiente
para diferenciar duas bandas).
• S1, filho do casal, tem duas bandas maternas e as 3
esperadas bandas paternas.
• S2, filho adotivo, tem bandas que não correspondem nem
à mãe nem ao pai (embora possa haver algumas
coincidências). Na prática, o RFLP não tem cores distintas
para as bandas materna e paterna, o que faz com que a
distinção seja baseada exclusivamente na posição da
banda no gel (migração).
• RFLP real. Veja a distorção das faixas
(lanes) de eletroforese, tornando
difícil identificar com precisão a
posição relativa de uma banda e
outra entre colunas não adjacentes.
Cálculos de Paternidade
• Para alcançar um resultado confiável, é necessário realizar uma análise
estatística.
• O índice de paternidade (IP) resume a informação fornecida pelo
exame.
• Nesse índice, é calculada a probabilidade do suposto pai ser o pai
biológico da criança, contra a probabilidade de qualquer outro
indivíduo ser o pai.
• Para tal, considera-se que, em uma população em equilíbrio de Hardy-
Weinberg, a probabilidade de que um homem qualquer transmita um
alelo específico para a criança em questão é igual à frequência deste
alelo na população.
9
Cálculos de Paternidade
• O cálculo do IP deve ser realizado para cada um dos loci utilizados
individualmente.
• O produto dos IPs estudados irá gerar o Índice de Paternidade
Cumulativo (IPC).
• O IPC indica se a hipótese de que o suposto pai é o pai biológico está
mais próxima de ser verdade do que a hipótese de que qualquer outro
homem o seja.
• Teste deve seguir padrões da Sociedade Internacional de Genética
Forense, alcançando grau de precisão de 99,99999999%
Cálculos de Paternidade
Coleta de material biológico para o teste de 
paternidade
• Perícia sem a presença do suposto pai (exumação)
• Perícia de Paternidade Pré-natal
MITO 
• O exame de DNA tem de ser feito no sangue?
• Cortei o cabelo dele para fazer o exame de DNA
10
EMPACOTAMENTO DO DNA
Existem quatro níveis decompactação da cromatina:
Estrutura primária
• Associação da dupla hélice do DNA com um grupo específico de histonas.
Duas cópias de cada uma das quatro histonas (H2A, H2B, H3, H4)
constituem um octâmero, em torno do qual um segmento de dupla
hélice de DNA se enrola, como uma linha em torno de um carretel.
• O octâmero circundado por duas voltas de DNA constitui um
nucleossomo. Cerca de 140 bases de DNA estão associadas a cada centro
de histonas. Este primeiro nível de compactação reduz o tamanho da
molécula de DNA em 6 a 7 vezes.
Solenóides
A histona H1 tem papel na organização da cromatina ocupando lugar na
região entre os nucleossomos, forçando o material a outro tipo de
compactação, em estruturas secundárias helicóides, denominadas
solenóides.
O solenóide corresponde à compactação de 6 a 7 nucleossomos. Essa nova
fibra é a unidade fundamental da organização da cromatina. O solenóide é
capaz de condensar aproximadamente 1200 bases de DNA
11
Alças 
Com a formação do solenóide, tem lugar a ação de proteínas não-histônicas,
que formam estruturas em alças ou domínios.
As alças podem ser o início de espessamentos parecidos com nós,
denominados cromômeros.
À medida que os cromossomos se condensam mais, os cromômeros
adjacentes fundem-se em estruturas maiores, que depois se tornam às
bandas cromossômicas.
Cromossomos
Encontramos essas formas na metáfase, quando há a maior condensação da
cromatina. É o enrolamento final, do qual participa a topoisomerase II.
Forma do Cromossomo
• Estudado durante a divisão celular
• Cada cromossomo é constituído por duas CROMÁTIDES
• Ligadas pelo CENTRÔMERO (divide em braço curto e longo)
Cromossoma. 
(1) Cromatídeo. Cada um dos dois braços idênticos de um
cromossoma depois da fase S.
(2) Centrómero. O ponto de ligação de dois cromatídeos, onde se
ligam os microtúbulos.
(3) Braço curto.
(4) Braço longo.
Classificação dos Cromossomos
12
Tipos de Cromatina
• Eucromatina, que consiste em DNA ativo, ou seja, que se pode expressar
como proteínas
• Heterocromatina, que consiste em DNA inativo devido ao fato de estar
condensada e que parece ter funções estruturais durante o ciclo celular.
Tipos de Cromatina
Heterocromatina constitutiva
• nunca se expressa como proteínas,
• nunca é transcrita em RNA e que se encontra localizada à volta do centrômero
(contém geralmente sequências repetitivas).
• Sendo, então, a porção permanentemente condensada da cromatina em todas as
células de um organismo;
Heterocromatina facultativa
• se expressa, ou seja, pode ser transcrita em RNA.
• É a parte da heterocromatina que, num organismo, pode estar condensada em
algumas células e em outras não.
• O melhor exemplo de heterocromatica facultativa é o cromossomo X dos
mamíferos fêmeas. A condensação de um dos cromossomos X das fêmeas ocorre
aleatoriamente. Assim, em algumas células teremos o cromossomo X paterno
ativo e o cromossomo X materno inativo e vice-versa.
Tipos de Cromossomos
• Autossomos ou somáticos
• Alossomos ou sexuais
13
Cromatina Sexual ou Corpusculo de Barr
• Encontrado em indivíduos do sexo feminino, genótipo XX dos genes
sexuais, visível nas células somáticas durante a intérfase.
• É compensação natural para a dupla carga genética dos indivíduos
femininos da espécie humana. Um dos cromossomos X fica espiralizado,
ou seja, inativo, fazendo com que só um dos alelos x se manifeste.
• Essa espiralização é aleatória nas células do organismo, porém o
cromossomo X que por acaso possuir alguma anomalia será
preferencialmente inativado.
• Nos indivíduos masculinos da espécie humana, genótipo XY, não há
corpúsculo de Barr ou cromatina sexual, pois somente se manifesta em
cromossomo X.
Cromatina Sexual ou Corpusculo de Barr
• A importância da cromatina sexual está no fato de através dela
diferenciarmos as células masculinas das femininas e também
identificarmos a ocorrência de síndromes ou anomalias cromossômicas
sexuais.
• Descoberta na década de 40, nas células somáticas em intérfase,
aparece, junto à face interna da membrana nuclear, uma pequena
mancha de cromatina (heterocromatina), porção que não desespiraliza e
cora-se, mais intensamente.
14
Cromatina Sexual ou Corpusculo de Barr
• A cromatina sexual pode ser observada em células da mucosa bucal e 
outros tecidos. Nos leucócitos ela aparece como um pequeno lóbulo 
arredondado, semelhante a uma raquete, preso ao núcleo.
• A determinação do sexo nuclear (presença do corpúsculo de Barr) tem sido utilizada em jogos olímpicos,
quando há dúvidas quanto ao sexo do indivíduo.
Referências
GRIFFITHS, Anthony JF et al.. Introdução à genética. Guanabara Koogan, 2008.
KARP, Gerald. Biologia celular e molecular. Editora Manole Ltda, 2005.
MAYR, Ernst. O desenvolvimento do pensamento biológico: diversidade, evolução e 
herança. Ed. UnB, 1998.