RELATÓRIO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA - MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA – CCEN
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA 
EDNA MARIA DOS SANTOS ALVES - 11311745
GABRIEL ARAUJO ROMANIUC - 11411530
 JULIANA TEÓFILO DOS SANTOS PEREIRA - 11321812
SIDNEY LUCAS MONTEIRO DE ARAUJO - 11328185
DETERMINAÇÃO DE PARACETAMOL E CAFEÍNA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
JOÃO PESSOA 
2017
 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA – CCEN
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA 
DETERMINAÇÃO DE PARACETAMOL E CAFEÍNA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Relatório apresentado ao Curso de Bacharelado em Química Industrial na disciplina Introdução aos Métodos Instrumentais Experimentais como um dos requisitos necessários à aprovação.
Docente: Professor Doutor Mário Cesar Ugulino De Araújo.
JOÃO PESSOA 
2017
SUMÁRIO
1.	INTRODUÇÃO	2
2.	OBJETIVOS	6
3.	METODOLOGIA	6
3.1 MATERIAIS E REAGENTES	6
3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL	6
4.	RESULTADOS E DISCUSSÃO	7
5.	CONCLUSÃO	7
6.	REFERÊNCIAS	8
 INTRODUÇÃO
 A cromatografia fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase estacionária, e a outra um fluido que se move através da fase estacionária sendo chamada de fase móvel. Na cromatografia líquida a fase móvel é líquida! (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).
A cromatografia em coluna divide-se em cromatografia gasosa, cromatografia com fluído supercrítico e cromatografia líquida, podendo esta última ser classificada em cromatografia líquida clássica e cromatografia líquida de alta eficiência, tema que será abordado no presente trabalho (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998). 
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC) se desenvolveu muito nos últimos anos, recebendo o nome de cromatografia líquida por que a sua fase móvel é um solvente.
Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, coluna cromatográfica, detector e o registrador. É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou macromoléculas e compostos termolábeis.
A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características impostas por esse método analítico. A principal característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV). A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e, também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vários solventes, três deles são mais utilizados: água, metanol e acetonitrila.
Como fase estacionária utilizam-se sólidos ou semirígidos, cujas partículas porosas esféricas ou irregulares apresentam diferentes diâmetros e suportam pressão até 350 bar.
A coluna cromatográfica é feita de um material inerte que resiste a todas as pressões em que ela vai ser usada. A capacidade da coluna é determinada pelo comprimento, diâmetro e pelo material de recheio. As colunas geralmente utilizadas são: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8), CN (cianopropil) e NH2 (amina). Quanto aos detectores, não existe um que apresente todas as propriedades para que ele seja ideal para CLAE. Não são versáteis, ou universais, mas existem detectores que apresentam ampla faixa de aplicações. A sensibilidade de um detector é determinada a partir da relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal. A linearidade é a faixa linear do sistema, onde o sinal do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto.
Os detectores mais usadas na CLAE são os fotométricos, baseados na absorbância no ultra violeta e no visível. Os detectores de fluorescência, utilizados como método de detecção específica, são sensíveis para substâncias que fluorescem. Este tipo de detector pode detectar quantidades de ordem picograma. Também são utilizados detectores por índice de refração, os quais acompanham continuamente a diferença no índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. A resposta deste detector é moderada, geralmente de ordem micrograma.
 Métodos Cromatográficos
A classificação dos métodos cromatográficos pode ser quanto ao mecanismo de separação, quanto a técnica empregada e em relação ao tipo de fase utilizada. No entanto, a classificação mais popular é a que leva em consideração o tipo de superfície na qual ocorre a separação (Fig.1), sendo dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar (LANÇAS, 1993).
Cromatografia
Fluído 
Supercrítico
Papel
HPLC
Gasosa
Clássica
Liquida
Coluna
Camada 
Delgada
Planar
Fluxograma 1 - Tipos de Cromatografia
 Fases Móveis (FM)
Para que um solvente possa ser utilizado como fase móvel na HPLC este deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fácil purificação; deve dissolver a fase móvel sem decompor seus componentes, para que estes sejam transportados pela coluna sem que haja modificação; não deve dissolver a fase estacionária; deve ser compatível com o detector; não ser tóxico e deve ter baixa viscosidade, pois isso irá interferir diretamente na eficiência da separação, devido ao fato de solventes viscosos além de dificultarem a transferência de massa entre a fase móvel e a fase estacionária, também influenciarem na intensidade da vazão (COLLINS; GUIMARÃES, 1997).
 Fases Estacionárias (FE)
As fases estacionárias a serem utilizadas na HPLC devem ter alta resolução entre os componentes da amostra, devem ser de fácil introdução na coluna, ter diâmetro uniforme, partículas porosas ou peliculares e serem sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos (COLLINS; GUIMARÃES, 1997; CECCHI, 2003).
 As partículas da fase estacionárias podem ser classificadas quanto ao seu tamanho em: macropartículas, quando apresentam diâmetro entre 20 e 40μm; intermediárias, quando tem entre 20 e 10μm; e micropartículas, de 3 a 10μm. Quanto menor for a partícula, maior será a eficiência da separação, melhorando assim o processo de difusão das moléculas da amostra dentro e fora das partículas, pois partículas menores reduzem a distância de contato do soluto com as fases estacionária e móvel, facilitando o equilíbrio e, consequentemente, melhorando a eficiência da coluna. Elas podem ser de formato esférico, também chamado de regular, e de formato irregular, sendo que as regulares são mais eficientes por oferecerem um enchimento mais uniforme e mais reprodutível da coluna e por esse motivo são mais caras (CECCHI, 2003; ARAÚJO, 2004).
Eluição
A eluição é um processo no qual os solutos são lavados através da fase estacionária pelo movimento de uma fase móvel. A fase móvel que deixa a coluna é chamada de eluato. Eluente é um solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através de uma fase estacionária. A coluna de uma eluição consiste em um tubo recheado com um sólido inerte, que retém a fase estacionária na sua superfície e a fase móvel ocupa os espaços entre as partículas do recheio. Inicialmente a solução da amostra contendo uma mistura é introduzida na coluna. Os componentes da mistura na amostra distribuem-se entre a fase móvel e a fase estacionária. A eluição ocorre forçando os componentes da amostra através da coluna, introduzindo-se a fase móvel de forma constante.
OBJETIVOS
Análise de um fármaco que contem paracetamol e cafeína;
Estudo da eluição gradiente e da isocrática, por meio da observação dos gráficos referentes a absorbância e comprimento de onda.
METODOLOGIA
3.1 MATERIAIS E REAGENTES
Balões volumétricos
Micropipetador
Aceto nitrila
Metanol
Agua destilada
THF
Fármaco 
Cromatógrafo líquido
3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Para a análise deste fármacofoi obtido um comprimido com as seguintes substancias 500mg de paracetamol e 65mg de cafeína e o restante da massa é dos incipientes.
Do comprimido de 0,9g foi utilizado 0,2g do mesmo para a análise, ele foi macerado até que ficasse em forma de pó o que ajuda na solubilização;
Esse pó que foi obtido foi solubilizado em 100ml de solvente constituído por etanol/água;
Da solução de 100ml feita anteriormente foi retirada uma alíquota de 1ml e diluída em uma solução de solvente constituída por acetonitrila/água 10%;
Na segunda diluição a solução obtida pelo processo citado acima foi diluída em 10 vezes (10x);
20 μL da feita foi injetada na coluna.
A coluna utilizada para a análise foi de sílica c-18 (o C-18 foi quimicamente ligado a sílica), de tamanho 4.6 x 250 mm, o diâmetro da sílica é 5 μC e o tamanho do poro de 100 Ӑ.
 O detector foi arranjo de diodos. A amostra foi injetada, utilizando uma seringa, dentro da coluna e foi feita a corrida cromatográfica.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As análises no cromatógrafo nos dão os seguintes espectros de cafeína e paracetamol, referentes ao fármaco utilizado. Como mostra nas Figuras 1 e 2 a seguir: 
Figura 1 – Espectro da Cafeína
Figura 2 – Espectro do Paracetamol
É visível, que o espectro do paracetamol apresenta um sinal maior do que o da cafeína. Sendo possível identificar o maior e menor pico. Abaixo, vemos o espectro do modo isocrático e gradiente (Figura 3 e 4):
 
Figura 3 – Cromatograma do modo isocrático 
Figura 3 – Cromatograma do modo gradiente
A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou com uma mistura de solventes de composição constante). A eluição por gradiente é realizada quando se utiliza uma quantidade de solvente B a uma quantidade de solvente A para aumentar a força eluente (variação da concentração dos solventes durante a análise). Em comparação a estrutura da cafeína e paracetamol, vemos que a cafeína tem mais heteroátomos, anéis e ligações duplas, por isso, ela sairá depois do paracetamol. Com relação aos cromatogramas, é possível perceber que o espectro do paracetamol apresenta uma intensidade do sinal maior que o da cafeína.
CONCLUSÃO
Pode-se concluir com esse experimento, que é possível determinar e quantificar as concentrações de paracetamol e cafeína de um fármaco, utilizando-se o método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Isto foi realizado através de um preparo de uma curva analítica e pelas áreas dos picos representados nos cromatogramas. Nota-se também, que há uma diferença com o tempo de retenção dos modos comparados, nesse caso (gradiente e isocrático). Para analisar, é recomendado utilizar o modo gradiente, pois ele possui uma relação sinal-ruído maior, vistos pelos valores dos picos e pelos espectros.
REFERÊNCIAS
CECCHI, Heloisa Máscia. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 2ª ed. rev. Campinas: Editora da Unicamp, 2003, 207p.
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve ensaio. Atualidades em Química, n.7, p.21-25, mai.1998.
Disponível em: <http://pfarma.com.br/farmaceutico-industrial/130-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia.html>. Acesso em: 08 de maio de 2017.
GUIMARÃES, Luis Fernando Lopes; COLLINS, Carol H. Cromatografia líquida de alta eficiência. In: Introdução a métodos cromatográficos. 7ª ed. Campinas: Editora da UNICAMP, 1997. p.183-238.
LANÇAS, Fermando M. Cromatografia em fase gasosa. São Carlos: Acta, 1993. 254p.
REFERENCIAS RUTZ, Josiane Kuhn. Avanços na cromatografia líquida. 2009.