Espectroscopia de fluorescência: Fundamentos e aplicações em biologia e medicina - Prof. Dr. Amando Ito

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Amando Siuiti Ito
Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto
USP
Espectroscopia de Fluorescência:
Fundamentos e aplicações em biologia e 
medicina
EIFAMB 2016
Bernardino de Sahagún
(~1500-1590)
Historia General de las Cosas 
de Nueva España
Coatli .. pieces of wood... makes
water bluish, good for urine disease..
Fluorescence – early reports
Nicolás Monardes (1508-1588) 
Sevilha 1565 - "Historia 
Medicinal" - study of America
plants
Onde tem “Coatli” ? 
1852 – Sir George Stokes: materials that convert 
invisible UV radiation into visible radiation
named fluorescence, as exhibited by fluorspar
“Modern” report
Onde está o 
fluorspar
(fluoreto de 
cálcio) ? 
Luz branca - absorção
Fluorescência – absorção e emissão de 
LUZ
Luz UV - emissão
Lâmpada
fotomultiplicadora
Monocromador de emissão
Monocromador 
de excitação
Fluorímetro de estado estacionário
280 320 360 400 440
0
500
1000
1500
2000
In
te
ns
id
ad
e 
de
 E
m
is
sã
o
Comprimento de onda (nm)
Espectros de emissão
Absorção (excitação) e emissão
Luz – absorção e emissão 
Átomo – modelo de Bohr 
Molécula: elétrons em 
orbitais moleculares 
Transições eletronicas
Absorção Emissão 
Estado excitado Ψe
Coordenadas 
nucleares
Estado fundamental Ψ0
Energia
Luz branca
fluoresceina
Fluorescência – visualização e espectroscopia 
Espectro de emissãoLuz UV
Sulfato de quinino
brometo de etidio 
rodamina 
Information from fluorescence (not all of them)
EnvironmentFluorophore
- depends on energy difference between 
excited state and fundamental state
- also depends on interactions 
1. Excitation and emission 
spectra
wavelength of absorption or emission 
1. Example: Stokes shift:
Fluorescent molecule/environment
Orto-aminobenzoic acid : solvent effects
C OH
O
N
H
H
Orto-aminobenzoic acid (o-Abz)
Also anthranilic acid
Fluorescência o-Abz: espectros
Excitação 310 nm
Emissão (deslocamento de Stokes) depende do meio
340 360 380 400 420 440 460
0
1
 
 ciclohexano 2,02
 dioxano 2,21
 benzeno 2,284
 acetona 20,7
 etanol 24,55
 TFE 27,68
 metanol 32,66
 acetonitr. 37,5
 dmso 47
 agua 78,3
In
te
ns
ida
de
 d
e 
Fl
uo
re
sc
ên
cia
 
No
rm
ali
za
da
 (nm)
Ambiente com maior polaridade: 
deslocamento da emissão para o vermelho
Stokes shift :
Stokes shift - Solvent effect – Abz emission
 
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
AbzNH
2
14
13
12
11
10
9
8
7
6
54
32
1
S
to
ke
s 
sh
ift
 (
x1
04
cm
-1
)
 f
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
360 380 400 420 440 460 480 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
fedcba
In
te
n
si
ty
wavelength (nm)
Spectra - different solvents
Linearity deviation: specific interaction
with solvent molecules
Emission and polarity – no single rule
Lippert/Onsager – dielectric cavity in 
continuum medium 
General rule – more polar solvent, 
red shift of spectrum
 
const
an
n
hc
fa 













3
*
2
2
12
1
12
12 


Detergente
SDS
CH3(CH2)11OSO3Na
SDS + PEO (Polióxido de etileno)
H - (O - CH2 - CH2)n - OH
Lutrol PEO-PPO-PEO
Exemplo 2: peptídeos em interação com 
sistemas nanoestruturados
Micelas
Agregados 
Polímero-Detergente
Micela Polimérica
7 nm
27 nm
17 nm
Melittin: peptídeo, 40-50% do peso seco do veneno.
- anfipatico, aumenta permeabilidade de eritrocitos e
membranas celulares.
- dilatação/contração de vasos, contração de músculos.
Veneno de Apis mellifera e sistemas
drug delivery
- triptofano : sonda fluorescente
- drug delivery systems: micelas (SDS), agregados SDS-
PEO (polyethylene oxide) e micelas polimericas (LUTROLF
127).
Fluoroforos naturais em Proteinas
Fenilalanina 
Ex/Em 260 nm/282 nm
Tirosina 
ex/em 280 nm/305 nm
Triptofano
ex/em 280, 295nm/ 305-350 nm
amino acidos aromaticos
SDS PEO LUTROL
peptídeo de veneno de abelha 
(Trp) em interação com micelas
Emissão (nm)
Tampão 350
SDS 340
SDS+PEO 335
Lutrol 335
Emissão desloca para o azul
Peptídeo insere-se no meio apolar da micela
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
300 350 400 450
Wavelenght (nm)
E
m
is
si
on
 in
te
ns
ity
Information from fluorescence (not all of them)
1. Excitation and emission spectra √
2. Intensity – quantum yield / Lifetime
Probalilidade
de absorção:
Absorbância
Probalilidade de 
emissão:
Taxa kf
tempo de vida:
τ = 1/ kf
Rendimento quântico: Φ = kf / kf + kNR
Processos não 
radiativos
0 20 40 60 80 100
1
10
100
1000
10000
c
b
a
C
on
ta
ge
ns
tempo (ns)
 a - KKA-0
 b - RKK3-0
 c - RKK3-30
 
fotomultiplicadora
fotomultiplicadora
monocromador
amostra
Semi-
espelho
Conversor 
tempo-amplitude
partida
chegada
Experimentos: Fluorímetro com resolução temporal
Laser pulsado
 
0 500 1000 1500 2000
1
10
100
1000
10000
co
nt
ag
en
s
tempo (ns)
Cinética do decaimento do 
estado excitado
I(t) : função de 
decaimento, após 
excitação por um 
pulso de luz
Fluorescência com Resolução temporal
Fluorescência: rendimento quantico e tempo de vida
 
0 500 1000 1500 2000
1
10
100
1000
10000
co
nt
ag
en
s
tempo (ns)
n* - número de moléculas excitadas
280 320 360 400 440
0
500
1000
1500
2000
2500
E
m
is
si
on
 In
te
ns
ity
Wavelenght (nm)
Resolvida no Tempo Estado estacionário
)(
1
)(
)( **
*
tntkn
dt
tdn  
I(t) α /** )0()( tentn  
 
Intens α )0()( *
0
* ndttn


 
 
Variação temporal Estado estacionário
Tempo de vida e rendimento 
quântico rnrr
rr
kk
k
k
k






 



i
ii
i
ii



2



i
t
i
ietF
)(
Decaimento 
multiexponencial
0 20 40 60 80 100
1
10
100
1000
10000
 
 
C
on
ta
ge
ns
Tempo (ns)
Ahba - pH neutro
Múltiplos fluoróforos
Múltiplos isômeros
Fluorescência com resolução temporal
Tempo médio
Tempo de vida e quantum yield dependem do 
ambiente
ANS lifetime:
in water is ~0.1 ns 
bound to proteins is 
8 – 10 ns
Ethidium bromide: 
1.8 ns in water
22 ns bound to DNA 
27ns bound to tRNA
tryptophan in proteins 
ranges from ~0.1 ns 
up to ~8 ns
Melittin: peptídeo, 40-50% do peso seco do veneno.
- anfipatico, aumenta permeabilidade de eritrocitos e
membranas celulares.
- dilatação/contração de vasos, contração de músculos.
Veneno de Apis mellifera e sistemas
drug delivery 2
- triptofano : sonda fluorescente
- drug delivery systems: micelas (SDS), agregados SDS-
PEO (polyethylene oxide) e micelas polimericas (LUTROLF
127).
Interação veneno de abelha / sistemas microheterogêneos
1 (ns) 2 (ns) 3 (ns) α1 α2 α3  (ns)
Tampão 4,74 2,01 0,25 0,24 0,39 0,37 3,49
SDS 5,66 1,62 0,51 0,05 0,35 0,60 2,32
SDS-PEO 4,72 1.33 0,40 0,07 0.35 0,58 2,13
LUTROL 5,54 2,32 0,50 0,23 0,55 0,22 3,80
Decaimento tri-exponencial
Interação com sistemas micelares: produz 
alteraçõesconformacionais no peptídeo
Mudanças nos tempos de vida e fatores pré-exponenciais
A clinical application: lifetime in thyreoid tissue analysis
59 human thyroid samples removed during
surgery
13 – healthy
36 – benign
10 - malignant
0 10 20
100
1000
co
un
ts
time (ns)
Tail fit – 2 exp
Emission (nm) Histopathology diagnosis τ1 (ns) τ2 (ns) 
340 
Healthy 0.80 ± 0.26 3.94 ± 0.47 
Benign 0.90 ± 0.24 4.05 ± 0.46 
Malignant 1.21 ± 0.14 4.63 ± 0.25 
450 
Healthy 0.25 ± 0.18 3.99 ± 0.39 
Benign 0.24 ± 0.17 4.20 ± 0.48 
Malignant 0.33 ± 0.32 4.55 ± 0.55 
 
59 human thyroid samples removed during
surgery
13 – healthy
36 – benign
10 - malignant
Results of tail fit (2 exp):
Analysis of variance (ANOVA) using Fisher's Least Significant 
Difference (LSD), Tukey, and Dunnet methods
Discriminant analysis:
- achieved 83.3% of correct classification for malignant 
samples when using both lifetimes as predictors
- 93.3% of correct classification for malignant samples when 
using only the longer lifetimes as predictor.
emissions at 340 nm : longer lifetimes for 
malignant thyroid samples (tryptophan 
metabolic pathway could be the cause) 
A clinical application: lifetime in thyreoid tissue analysis
0 10 20
100
1000
co
un
ts
time (ns)
 
0 500 1000 1500 2000
1
10
100
1000
10000
co
nt
ag
en
s
tempo (ns)
Fatores que influenciam o tempo de vida 1
Temperatura
Phenantrolina em meio 
aquoso
Intervalo: 10 a 36 C
Aumento de processos 
não radiativos: diminui τ


nrr kk
1

Supressão Colisional 
Fluoróforo excitado interage (curto alcance) com átomo ou
molecula supressora
Aumenta taxa de transições não-radiativas para o estado
fundamental. 
Diminui tempo de vida
Exemplos: O2, I-, Cs+ , acrilamida, piridínio
F*Q F
Fatores que influenciam o tempo de vida 2
Com suppressor [Q]
Fo/F = 0/  = 1 + kq [Q] 
na ausencia do supressor
F0 é a intensidade de emissão
0 é o tempo de vida do estado excitado
0 10 20 30 40 50
1
10
100
1000
10000
C
ou
nt
s
Time / ns
Supressão dinâmica: caso simples
][sup Qkk q
Taxa de supressão
 

][
1
Qkkk qnrr

Tempo de vida
kq é a taxa bimolecular (proporcional
à soma dos coeficientes de difusão do 
fluoróforo e supressor) 
(b) Doador ---- Aceitador
Transferência de energia
Fatores que influenciam o tempo de vida 3
(a) Só Doador
 
0 20 40 60 80 100
1
10
100
1000
10000
( b )
( a )C
ou
nt
s
time (ns)
 
 
 
hghg
Donor
hg
Acceptor
FRET
hg
FRET : diminuição da intensidade e tempo de vida
do doador, e aumento na fluorescencia do aceitador
Fluorescence (ou Förster) Resonance
Energy Transfer (FRET)
Example
Energy transfer and enzymatic assay
Donor: Aminobenzoic acid
 
N H 2 
O 
O 
C H 
 NO2 
NO2 
NH H2N CH2 CH2 
Eddnp (Etilenodiamina dinitrofenil) 
Acceptor: Eddnp
Donor - peptide -Acceptor
Protease
Low fluorescence
Donor-pep1 pep2-Acceptor High fluorescence
300 350 400 450 500 550 600
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
In
te
ns
ity
wavelength (nm)
 
 
 Abz-bk and Bk-Eddnp spectral overlap:
Red – Eddnp absorption
Black: Abz emission (excitation 310 nm)
Bk Sequence:
RPPGFSPFR
N-terminal: Abz
C-terminal: Q-Eddnp
Example FRET: Abz - Bradykinin – Eddnp 
 
0 20 40 60 80 100
1
10
100
1000
10000
( b )
( a )C
ou
nt
s
time (ns)
 
 
 
Curve a: Abz-bk
Curve b: Abz-bk-
Eddnp
energy transfer: 
decrease in lifetime
Labeled bradykinin – fluorescence decay
Abz - Bradykinin – Eddnp 












 t
r
R
ItI
dd
6
6
0
0
1
exp)(

- Complex decay: multiple donor-acceptor distances
I(t) : modulated by distribution function f(r)
ai : pre-exponential factor 
τdi : donor's lifetimeI t a I f r
R
r
t dri
i di di
( ) ( )exp  
















 

0
0
0
6
6
1
 
Intensity decay and Energy Transfer
“Molecular rule” 
Energy transfer - additional 
route for deexcitation. 
Decay for single distance r
From decay: distance r can be measured !
y
N
j
ikj
b
a
kk NkLdrtrKrfty
L
,.....1,),()()(
1
 


















 k
jdd
okj t
r
R
KtrK
6
6
01exp),(

f(r) was recovered from the experimental data using CONTIN
(program that inverts general systems of linear algebraic
equations)
y(tk) :experimentally observed intensity of fluorescence at the instant tk.
K(rj,tk): equation for intensity decay with energy transfer, deconvoluted 
from the instrument response function
Recovery of the distance distribution function
second term accounts for impurities that may 
contribute to the decay profile
Donor only: Abz – Bk-Q – NH2
Acceptor only: Bk-Q – EDDnp
350 400 450 500 550
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
In
te
ns
id
ad
e.
 (
un
id
ad
es
 a
rb
.)
 (nm)
 fluorescência
 coeficiente de extinção
 
energy transfer rate:
kT = Ro
6/d r
6
d : donor’s lifetime.
Ro : Förster distance
Fd(): donor’s emission
Φd: donor’s quantum yield 
a(): acceptor’s extinction coefficient
n: refractive index 
: orientational term
Energy Transfer
   
dν
ν
νενf
Nn128π
9000ln10
R
0
4
dd
45
2
d6
o 



Donor-aceptor spectal superposition
Donor: Abz Acceptor: Eddnp 
Medium: HEPES buffer, pH 7.4 or TFE, pH 7.0 
Parameters: index of refraction n; quantum yield (QY); rotational 
correlation time (); Förster distance (Ro) 
 
 n 
 
QY 1 (ps) 2 (ns) Ro (Ă) 
Abz-Bk 
buffer 
1.334 0.33 170 0.620 25.8 
Abz-Bk 
TFE 
1.291 
 
0.26 
 
280 
 
1.34 
 
26.0 
 
 
 
Bradykinin: energy transfer parameters
 
10 12 14 16 18 20 22
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
r(Å)
f(
r)
 
 
 
distance distribution
recovered from decay
curves
mean distances (steady state) are similar 
- 14 Å (water), 15 Å (TFE)
Example: Bradykinin end-to-end distance distribution
HEPES pH 7.4
TFE
Abz-Bradykinin–Eddnp in water and TFE 
conformational states (distance distribution) are different
- agreement with CD results (extended and turned conformations in TFE)
longer Bk derivative: similar distances, turned structure
Information from fluorescence (not all of them)
1. Excitation and emission spectra √
2. Intensity – quantum yield / Lifetime √
3. Emission depolarization (anisotropy) 
EnvironmentFluorophore
Dipolo de absorção
Dipolo de emissão t = 0
Dipolo de emissão
t > 0


3. Despolarização
Dipolo de emissão não é 
paralelo ao de absorção
Fluoróforo pode girar durante 
o tempo de vida do estado 
excitado
Anisotropia da fluorescência:





II
II
A
2ll
ll
Emission depolarization (anisotropy) 
Rotação livre: Anisotropia vai a zero
ANISOTROPIA COM RESOLUÇÃO TEMPORAL 
...)( 2
2
1
1 00




tt
eAeAAtA
i = tempo de correlação rotacional  mobilidade da molécula
Decaimento da Anisotropia
Decaimentos Multiexponenciais
)(2)(
)()(
)(
| |
| |
tItI
tItI
tA





10 20 30 40
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
 
 
A
ni
so
tr
op
ia
Tempo (ns)
Detergente
SDS
CH3(CH2)11OSO3Na
SDS + PEO(Polióxido de etileno)
Lutrol PEO-PPO-PEO
Exemplo: peptídeos em interação com 
sistemas nanoestruturados
Micelas
Agregados 
Polímero-Detergente
Micela Polimérica
7 nm
27 nm
17 nm
Exemplo: Interação veneno de abelha / sistemas
nanoestruturados
λemiss (nm) R Φ1 (ns) Φ2 (ns)
Tampão 350 0,024 1.09 0.064
SDS 340 0,080 2.51 0.078
SDS+PEO 335 0,078 2.21 0.085
LUTROLF 127 335 0,061 3.10 0.094
Aumento nos tempos de
correlação rotacional (Φi):
menor difusão rotacional
Deslocamento da 
emissão: 
ambiente menos 
polar
Aumento na anisotropia de 
estado estacionário (R): 
ambiente mais rígido
Peptídeo insere nos 
sistemas 
nanoestruturados
Example: anisotropy and model membranes
micelles and vesicles
SDS
CTAB
Ahba and micelles
Example: New lipophylic probe
2-Amino hexadecil benzamida (Ahba)
0 10 20 30 40 50 60 70
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
 
 
A
ni
so
tr
op
y
[Surfactant] mM
0 20 40 60 80
392
396
400
404
408
(1a)
 
 
 m
ax
 (
nm
)
[Surfactant] mM
Ahba – good affinity to micelles
SDS (Sodium dodecyl sulfate)
CTAB (Hexadecyl trimethylammonium Bromide)
HPS (N-Hexadecyl-N,N-Dimethyl-3-Ammonio-1-Propanesulfonate)
DPS (N-Dodecyl-N,N-Dimethyl-3-Ammonio-1-Propane sulfonate)
Emission wavelength and static anisotropy: 
Monitors CMC of detergents
2-Amino hexadecil benzamida (Ahba)
15 20 25 30 35 40
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
 
 
A
ni
so
tr
op
y
Temperature (ºC)
HexAbz 10M in DMPC 0,5mM
Anisotropy monitors
phase transition of
DMPC vesicles
Interaction with LUV (Large Unilamelar Vesicle)
DMPC – dimiristoil
phosphatidylcholine
Fluorescence + confocal microscopy
Técnicas Avançadas
- Fluorescence correlation spectroscopy – FCS
- Fluorescence lifetime imaging - FLIM
 Número de moléculas fluorescentes 
no volume de observação
 Difusão
 Ligação
 Dinâmica conformacional
 Movimento rotacional (se os 
polarizadores são utilizados)
 Folding de proteínas
 Blinking
 etc…
flutuação na fluorescência
onde
Distribuição da duração das 
flutuações Função de correlação
Análise da Autocorrelação
230pM de rodamina 6G em tampão
•Amplitude  Concentração
<N> = 0,085 moléculas
•Decaimento  Constante de 
difusão
D = 280μm2/s (wr = 374nm)
Moléculas Difundindo Livremente
Small volume in focus – scanning stage: imaging
Each pixel:
Lifetime determined
lifetime imaging
FLIM : fluorescence lifetime imaging
FLIM – fluorescence lifetime imaging 
Decaimento associado a varredura
Cell with GFP/RFP. Red strip: acceptor 
photobleaching prevents energy transfer 
induced decrease in fluorescence lifetime
intensity (left) and lifetime image 
(right) of a pollen grain (from a 
daisy). Regions uniform in the 
intensity image show pronounced 
differences in the FLIM image 
Miltefosine (non-
fluorescent)
Application 1: Anti-leishmania drug: hexadecyl
phosphocholine (miltefosine)
Leishmaniasis : neglected disease, public healthy problem. 
Treatments expensive, drug resistant 
Miltefosine: alternative oral drug 
-incorporated by the parasite, high level of 
intracellular concentration 
-Mechanism of action? 
Fluorescent analog
6-Et-BODIPY-11C-PC, 
(MT-BODIPY)
Miltefosine: from fluorescence
intensity and anisotropy of
probeAhba
CMC = 50 uM
lifetime
Application 1: interaction miltefosine - lipid vesicles 
MT in DMPC (dimiristoil phosphatidylcholine) LUVs
(large unillamelar vesicles)
MT in DMPC - Luv´s
– below CMC - fluidification
- above CMC – lipid solubilization
M.Barioni et al, Biophys Chem 2015
anisotropy
Luv´s
i) one phospholipid – (DMPC, DPPC e POPC)
ii) two phospholipids – (POPC/DPPC); 
iii) binary plus cholesterol (POPC/cholesterol)
FCS – correlation function
LUVs (phosfolipids): Addition of MT 
– increase in diffusion coefficients
LUVs (phospholipids + cholesterol): no 
change in diffusion coefficient with addition
of MT– stabilizinf effect of cholesterol
Application : interaction miltefosine - lipid vesicles
FCS – Fluorescence Correlation Spectroscopy 
Miltefosine in giant vesicles 
No miltefosine –
diameter 8 um
miltefosine – 50 uM miltefosine – 400 uM 
FLIM : MT em Guv´s DPPC/POPC 
GUVs
i) one phospholipid – (DMPC, DPPC e POPC)
ii) two phospholipids – (POPC/DPPC); 
iii) binary plus cholesterol (POPC/cholesterol)
iv) ternary (POPC/cholesterol/ceramide)
Fluorescent probe
NBD-PE  1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-
Phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-
benzoxadiazol-4-yl)
Application : interaction miltefosine - lipid vesicles 
MT INTERACTION WITH GUVs OF TERNARY MIXTURES 
(PHOSPHOLIPID/CERAMIDE/CHOLESTEROL)
BY CONFOCAL FLUORESCENCE MICROSCOPY
Effect of fluidification in ceramide containing membranes
MT 0 mol%
MT 5 mol%
MT 10 mol%
M.Berardi et al, 2014 
Application : interaction miltefosine - lipid vesicles 
0 3 6 9 12 15
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
fre
qu
ên
ci
a 
(m
il 
co
nt
ag
en
s)
tempo de vida (ns)
0 3 6 9 12 15
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
fre
qu
ên
ci
a 
(m
il 
co
nt
ag
en
s)
tempo de vida (ns)POPC POPC/Chol 7:3FLIM : MT INTERACTION WITH GUVs - BINARY MIXTURES (PHOSPHOLIPID/CHOLESTEROL)
MT : fluidification of
membrane
cholesterol: membrane
more rigid (increase in 
lifetime)
Cholesterol : decreases
effect of MT
With MT With MT
Application 1: interaction miltefosine - lipid vesicles 
0 3 6 9 12 15
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
fre
qu
ên
ci
a 
(m
il 
co
nt
ag
en
s)
tempo de vida (ns)POPC/Col/Cer 8:1:1
0 3 6 9 12 15
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
fre
qu
ên
ci
a 
(m
il 
co
nt
ag
en
s)
tempo de vida (ns)POPC/Col/Cer 1:1:1
FLIM : MT INTERACTION WITH GUVs - TERNARY 
MIXTURES (PHOSPHOLIPID/CERAMIDE/CHOLESTEROL)
- domain formation with 
ceramide
- MT modifies 
distribution and 
morphology of domains
with 
MT
with 
MT
Ceramide domains
Application : interaction miltefosine - lipid vesicles 
Application 2 – lipid nanoparticles and miltefosine
lipid nanoparticles (LNP)
glycerin, cotton seed oil, oleic acid, egg phosphatidylcholine, 
Tween 80, cholesterol
miltefosine-loaded lipid nanoparticles
MT 15mg/ml :
Lowest turbidity and 
polidispersity
Application 2 – lipid nanoparticles and miltefosine
reduced cytotoxicity against macrophagesdecreased erythrocytes hemolysis
miltefosine-loaded lipid nanoparticles: comparison with free miltefosine
Maintained cytotoxicity against promastigote forms of L. (L.) chagasi
very promising to treat 
leishmaniasis by oral and 
parenteral administration
0,1 1 10 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
 
 
No
rm
ali
ze
d A
ut
o-
Co
rre
lat
ion
Time (ms)
 Control 0 chol
 Fit
 MT Em. 0 chol
 Fit
 Control 80 mg Chol
 Fit
 MT Em. 80 mg Chol
 Fit
0 20 40 60 80
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Di
ffu
sio
n c
oe
ffic
ien
t (
m
²/s
)
[chol (mg)]
0
20
40
60
80
100
120
Ra
diu
s (
nm
)
R2
R1
D1
D2
Time-resolved data: miltefosine-loaded 
lipid nanoparticles - higher stability
FCS: MT decreases
size of
nanoparticles, 
increases stability
Flu decay
a) control 37C
b) MT loaded LNP 37C
c) MT loaded LNP 25C
C. Valduga et al, 2016
Application 2 – lipid nanoparticles and miltefosine
- Fluorescence data 
Brazilian Propolis - GUVs POPC 1 mM – probe DiI C18 0.1 mol%
Application 3: brazilian propolis and lipid vesicles
GUVsGUVs + DMSO GUVs + DMSO + propolis
Artepillin C (3,5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid) 
- major constituent of the Brazilian green propolis
-properties as anticancer, anti-inflammatory and 
antimicrobial agent. 
-high affinity to phospholipid monolyers and 
bilayers
FLIM IMAGES – propolis ethanol extracts
GUV – DPPC/DOPC
0.0 0.8
Ld phase
Lo phase
0.0 0.8
Generalized polarization –
identifies fluid and rigid 
regions of the bilayer
Application 3 : brazilian propolis and lipid vesicles
Confocal Fluorescence Microscopy Probe – Laurdan
100 uM Artepillin C
20 minutes after inserting
0.0 0.8
Increase in rigidity of the 
lipid bilayer due the presence 
of cholesterol, 
artepillin C: disorganization 
of the lipid bilayer, without 
change in the fluidity
Application 3: brazilian propolis and lipid vesicles
GUV – DPPC/DOPC/Chol (0.47/0.23/0.30)
Probe – Laurdan
Generalized polarization
DOPC GUVs
0 5 10 15 20 25 30
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
 
 
 Photobleaching Control
 MeOH 1% (v/v)
 Artepillin C 100uM
 Artepillin C 200 uM
N
or
m
al
iz
ed
 G
ra
y 
In
te
ns
ity
Time (minutes)
DOPC GUVs
0 minute 30 minutes
Artepilin C in GUVs -Leakage analysis
DPPC GUVs – less intense decrease
DOPC/DPPC/Chol - small leakage
Application 3 : brazilian propolis and lipid vesicles
Probes: 
Alexa and DiI
GUV – DPPC/DOPC/Chol (47/23/30) Effect of Artepillin C
0 min. 6 min. – 40 uM 22 min. - 120 uM 45 min
62 min. 68 min. - 160 uM
W.Pazin 2016
Large morphological changes 
with addition of Artepilin C
Application : brazilian propolis and lipid vesicles
Simulações Dinâmica Molecular: Artepillin C e bicamadas DMPC
0 min. 6 min. – 40 uM 62 min.
W.Pazin 2016
Simulações computacionais:
Agregação de Artepilin C –
Entrada na bicamada
Application : brazilian propolis and lipid vesicles
glycoprotein E is the main peptide in the the viral
envelope – is a dimer complex with 495 aminoacids in each
subunit, each with three subdomains.
Interaction step between vírus and host cell: aminoacid
sequence 98-112 from domain II of Glycoprotein E inserts
in the cell membrane.
Application: interaction of dengue virus fusion 
peptides with membranes; Anisotropy, simulations
Main aminoacid sequence from serotype 2 DEN II 88 – 123
Sequence DEN II 98 – 112 (underlined): fusion loop or fusion peptide
Charged polar (green), Hydrophobic (blue) and non-charged polar (red).
Peptides and Sequences
Simulation – Peptides in Water
DEN II – 88 – 111
DEN II – 98 – 112
DEN II – 88 – 123
DEN II – 98 – 123
Trp residue – exposed to water
Fluorescence decay: 3 lifetimes
Average lifetime ~ 2 ns
Quenching by acrylamide
DPPG + DEN II – 88 - 123
After 100 ns
Final position
Initial position
Molecular Dynamics Simulation – Peptides/membranes
Aorta for control group and chol fed 
group (60 days)
Staining: oil red and europium 
chlortetracycline. 
New Zealand rabbits: CG (control group, regular diet);
EG (experimental group, 1% cholesterol diet) 20, 40 and 60 days.
Cholesterol: formation of atheroma plaque in aorta
Application 4 – Tissues and cholesterol
Control group:
Normal thickness
Cholesterol fed group: 
Intima layer thickned
EuCTC is LDL fluorescent probe
Green: autofluorescence
Red emission : Eu in intima layer
FLIM – exc 440 nm, endogenous fluorescence (flavins, protoporphyrins) 
and Europium complex 
images: intima layer is thickened.
New Zealand rabbits: CG (control group, regular diet);
EG (experim. group, 1% cholesterol diet) 20, 40 and 60 days.
Application 4 – Tissues and cholesterol
Cholesterol: formation of 
atheroma plaque in aorta
FLIM – exc 440 nm, endogenous fluorescence 
(flavins, protoporphyrins,)
L.B.Sicchieri et al. 2014 SPIE
Photonics West
Lifetime histogram
Plaque formation – longer lifetime
Detection of 
- increased emission from porphyrins,
- metabolic changes,
- inflammation and presence of 
macrophages
Cholesterol: formation of atheroma 
plaque in aorta
Application 4 – Tissues and cholesterol
Cucurbiturils
– glycoruril units
Langmuir-Blodget monolayers
DPPC/Cholesterol (80/20)
- Probe: Chol-NBD
- Sub-phase:
water
β-Cyclodextrin (β-CD) 
Cucurbiturils - CB[5], CB[6], CB[7]
C.B. Tovani et al. / Coll and Surf B: Biointerfaces 111 (2013) 398– 406
application 5 – Lipid monolayer: cucurbiturils and cholesterol
Langmuir-Blodget monolayers – solid substrate BK-7 glass
DPPC/Chol (80/20)
Probe: Chol-NBD
Water sub-phase: dark background
With β-CD and CB[7] : enhancement of fluorescence
C.B. Tovani et al. / Coll and Surf B: Biointerfaces 111 (2013) 398– 406
FLIM – lifetime imaging
application 5 – Lipid monolayer: cucurbiturils and cholesterol
Monolayers with cholesterol
DPPC/Chol (80/20); probe: Chol-NBD
C.B. Tovani et al. / Coll and Surf B: Biointerfaces 111 (2013) 398– 406
Sub-phase τ1 (ns) τ2 (ns)
Water 0,81 -
β - CD 0,56 4,7 b1 << b2
CB [5] 0,52 5,7 b1 >> b2
CB [6] 0,51 6,2 b1 >> b2
CB [7] 0,53 5,3 b1 << b2
Cholesterol solubilization from model 
membrane by cucurbituril CB[7]
β-CD and CB[7] : 
enhancement of
contribution from long
component ~ 5.0 ns
application 5 – Lipid monolayer: cucurbiturils and cholesterol
Decays: fit to bi-exponential
Application 6: β-amiloid agregation – Ru complexes
study of diagnostic properties of ruthenium complexes 
in the process of formation of β-Amiloid fibrils
M. Lima, R.M.Carlos, 2014
Complexes: 5 μM
Β-amiloide monomers – 50 μM
fibrils – complexes in hydrophobic
clefts
β-amiloid agregation – Ru complexes
monomers fibrils
TEM images
Fibril formation
followed by FLIM
-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ite
ns
id
ad
e 
N
or
m
al
iz
ad
a
Tempo de Incubaçao (min)
 RuApy 0.5 uM
0 min 1440 min60 min 180 min 350 min
β-amiloid agregation – Ru complexes
30 min
1h
24h
5h
3h
0 h
Monômeros
3 hours - aggregates with 
variety of shapes, from 
oligomers units, linear and 
parallel assemblies to S-
shaped forms. 
30 min - monomers self-assemble 
into oligomeric structures with 
ring like (globular) shapes. 
1 hour – protofibrills linear 
and aligned in parallel 
pattern. 
24 hours – only mature fibrils
β-amiloid agregation – Ru complexes - FLIM
M. Lima, R.M.Carloset al, 2014
Interações com solventes
Interações peptídeos-membranas
Propriedades de membranas – modelo (micelas, vesículas)
Conformações de peptídeos/proteínas
Mecanismos de ação de drogas/produtos naturais
Tecidos – patologias (colesterol, tumores, disturbios
neurológicos)
Diagnósticos, análises clínicas
Terapias
Aplicações (algumas)
George Steiner (Princeton, Genebra, Cambridge)
Os finalmente ...
- Muitos dizem que as utopias são idiotices. Mas, serão 
idiotices vitais. Um professor que não deixa seus alunos 
pensar em utopias e errar é um péssimo professor
- Hoje, mesmo a criança cheira o dinheiro, o único objetivo já parece 
querer ser rico. E a isso se soma o enorme desprezo dos políticos em 
relação aos que não têm dinheiro. Para eles, somos apenas uns pobres 
idiotas. E isso Karl Marx viu com bastante antecedência.
- .... existe na universidade uma vaidade descomunal. E cai 
mal, para eles, que alguém lhes diga claramente que eles são 
uns parasitas. Parasitas na juba do leão.
- Disse Aristóteles: “Se você não quer entrar na política, na 
ágora pública, e prefere ficar em sua vida privada, então não 
venha se queixar depois de que são os bandidos que governam”.
- ..é mais importante cometer erros do que tentar 
entender tudo desde o início e de uma vez só. É dramáticoter claro aos 18 anos o que você tem que fazer e o que não.