Estudo Dirigido

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Universidade Federal de São João Del-Rei 
Campus Centro-Oeste Dona Lindu 
 Processos Bioquímicos e Microbiológicos Industriais 
Estudo Dirigido 1: Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial 
 
Nome: Gabriela Carolina Silva Almeida 
1. Explique e descreva cada uma das possíveis fontes de microrganismos de interesse. 
Os microrganismos podem ser obtidos das seguintes formas: 
1. Isolamento a partir de recursos naturais: Acontece através do isolamento de 
microrganismos a partir de recursos naturais como solo, água, plantas. E é importante 
para descobertas de novas linhagens de microrganismos para fins industriais. 
2. Compra em coleções de culturas: É a aquisição de um microrganismo através de coleções 
de culturas que estão presentes em vários países como Agricultura. Research Service 
Culture Collection (EUA). 
3. Obtenção de mutantes naturais: Quando ocorre a proliferação celular pode ocorrer o 
surgimento de mutantes naturais, e esses poder ser isolados e ensaiados objetivando a 
verificação de sua potencialidade de produção, porém esse processo depende de um 
grande tempo. 
Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais: Utilização de métodos que 
forcem aparecimento de celular multadas, como é o caso de submeter suspensões de 
células ou esporos a radiações ultravioleta ou a substâncias químicas mutagênicas. Ao se 
permitir essa exposição ou contato, ocorre uma drástica destruição da maioria das células, 
recuperando-se, a seguir, aquelas que sobreviveram, verificando-se se mutaram na 
direção desejada. Essa técnica para a obtenção de mutantes é obviamente 
4. obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética: 
Através da engenheira genética permite a obtenção de células alteradas geneticamente, 
a partir da tecnologia do DNA recombinante. 
2. Descreva as características ideais dos microrganismos a serem empregados em Processos 
Biotecnológicos Industriais e explique porque cada uma delas é fundamental para que se 
alcançar produtividades e rendimentos aceitáveis do processo. 
1. Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto 
O valor da matérias-primas incide fortemente no custo do produto final. 
2. permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentração do 
produto no caldo fermentado: 
Que o microrganismo seja resiste a uma alta concentração do produto, para que não 
inibição na formação do produto. 
3. Não produzir substâncias incompatíveis com o produto: Que o microrganismo produza 
dois produtos final e que um interfira na atividade do outro. 
4. Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico: O microrganismo se 
mantenha eficiente ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua proliferação em 
nível de laboratório, germinadores e biorreator principal 
5. não ser patogênico: os quais possam ser manuseados sem riscos ambientais, 
particularmente nas etapas seguintes em relação ao termino do processo fermentativo. 
6. não exigir condições de processo muito complexas: Economia no processo. 
7. não exigir meios de cultura dispendiosos: não ter meio de cultura caros para economia 
do processo. 
8. permitir a rápida liberação do produto para o meio: de onde o produto final será 
recuperado nas etapas seguintes ao processo fermentativo 
3. Discuta como os micro-organismos geneticamente modificados podem aumentar a 
produtividade e o rendimento dos processos. 
Nos últimos tempos, a engenharia genética trouxe células mais produtivas, e também 
tornaram células produtoras de substâncias que naturalmente não são produzidas 
por elas produzidas, em virtude da ausência de codificação genética para tanto. 
Com a tecnologia do DNA foi possível a obtenção de proteínas heterólogas de alto 
valor agregado, em particular para uso em saúde humana, como é o caso da produção 
de hormônio de crescimento humano, insulina, interferons, Fator VII. 
4. Explique detalhadamente os principais métodos existentes para preservação de 
microrganismos em laboratório, mostrando quais são vantagens e desvantagens de cada 
método. 
1. Métodos de conservação 
(a) Método de curto prazo: repicagem contínua ou periódica: O método consiste na 
inoculação do microrganismo em meio adequado, incubação em ambiente favorável 
à multiplicação e estocagem em baixas temperaturas, após sua multiplicação. Nesta 
situação, é aconselhável o armazenamento de culturas sob refrigeração (5ºC a 8°C), 
em busca da redução do metabolismo do microrganismo e o aumento entre os 
intervalos de repiques das culturas. 
Vantagens: simplicidade; baixo custo; não necessidade de reativação, não 
provocando assim estresse ou injuria celular; e a não exigência de equipamentos 
sofisticados. 
Desvantagens: Apresenta maior risco de contaminação em decorrência da constante 
manipulação das culturas devido aos repiques contínuos e periódicos; perdas de 
características genéticas decorrentes de mutações provenientes da intensa 
multiplicação celular; necessidade de maior espaço físico para armazenamento das 
culturas; logística inconveniente quanto ao transporte; variabilidade entre as cepas e 
consequentemente entre os intervalos de repiques dos microrganismos 
armazenados. 
2. Métodos de médio prazo 
(a) Manutenção em óleos: Este método de conservação consiste na aplicação de uma 
camada de óleo mineral esterilizado sobre a cultura do microrganismo a fim de limitar 
a quantidade de oxigênio disponível, causando assim uma redução no metabolismo e 
consequentemente na taxa de multiplicação do agente. Deve-se multiplicar o 
microrganismo em meio de cultura dentro de um frasco, por exemplo, um tubo de 
ensaio, e em seguida cobrir essa colônia com óleo mineral esterilizado. 
Posteriormente, esse frasco pode ser mantido em temperatura ambiente ou em um 
refrigerador 
Vantagens: A técnica proporciona uma maior longevidade às estirpes, quando 
comparada à repicagem periódica, bem como redução da velocidade de desidratação 
do meio de cultura. 
Desvantagens: A possibilidade de contaminações, instabilidade genética e 
dificuldades com a utilização do óleo, sua esterilização e seu manuseio. 
(b) Manutenção em água esterilizada: Consiste no armazenamento de microrganismos 
em água estéril ou solução salina, sendo indicada na preservação de microrganismos 
sensíveis a baixas pressões osmóticas de soluções hipotônicas. O método consiste na 
transferência de blocos de Ágar contendo os microrganismos para um frasco, com a 
posterior adição de uma solução de água esterilizada. 
Vantagens: Preservação das características originais da cultura por longos períodos, 
pode promover a ausência de contaminação por ácaros, apresentar baixo custo por 
utilizar somente água destilada e a necessidade de pequeno espaço físico para 
acondicionar os frascos, além de poder ser empregada para grande número de 
gêneros e espécies de fungos. 
Desvantagens: Sua aplicação é restrita a microrganismos que tenham grande 
aderência ao Agar, como nota-se em bolores e algumas leveduras. 
(c) Congelamento: O congelamento consiste na conservação de microrganismos em 
temperaturas relativamente baixa, entre -4°C e -20ºC. 
Vantagens: Um dos métodos de manutenção mais simples e baratos, além de 
oferecer boa segurança para o armazenamento de diversos microrganismos por 
períodos de alguns meses a dois anos. 
Desvantagens: A possibilidade de redução da viabilidade de alguns microrganismos 
em função dos danos causados às células decorrentes da formação de cristais de gelo 
e da variação eletrolítica na faixa de temperatura utilizada. 
3. Métodos de longo prazo: 
(a) Liofilização: A técnica se baseia na remoçãoda água intracelular de materiais 
biológicos congelados, por sublimação, evitando a formação de cristais de gelo, que 
são capazes de provocar danos às estruturas celulares, além de poder degradar as 
enzimas presentes no citosol, o que poderia levar à morte dos microrganismos. A 
liofilização é constituída por três etapas: congelamento, desidratação primaria e 
desidratação secundária. Durante o processo de congelamento pode ocorrer um 
dano à estrutura celular relacionado com o comportamento peculiar da água sob 
condições de baixas temperaturas. A água congelada expande-se ao cristalizar e no 
processo de fusão tende a recristalizar e aglutinar, formando longos e protuberantes 
cristais de gelo, capazes de produzir uma série de danos mecânicos, bioquímicos e 
osmóticos à célula. 
Vantagens: O método oferece alta estabilidade do material a ser conservado, baixa 
taxa de mutação e contaminação, não requer monitoramento nem manutenção 
frequente, além de ocupar pouco espaço no armazenamento. Quanto ao transporte 
de culturas de referência ou até mesmo materiais de rotina, o liofilizado pode ser 
transportado a longas distancias em temperatura ambiente, não havendo 
necessidade de refrigeração. 
Desvantagens: Como desvantagem verifica-se a necessidade de equipamentos 
onerosos para a desidratação do material, além dos custos com o preparo das 
culturas. 
(b) Criopreservação: Este método compreende a manutenção de materiais a baixas 
temperaturas, - 20ºC a -80ºC em freezers, e a ultra-baixas temperaturas, -150ºC a -
196°C em contêineres de nitrogênio liquido 
Vantagens: Já os sistemas de nitrogênio líquido garantem o armazenamento a 
temperaturas constante e por longos períodos, a elevada taxa de sobrevivência, 
principalmente pelo aspecto pratico, visto a recuperação e viabilidade de populações 
celulares, mas também na redução das possíveis alterações na sua composição 
genética. 
Desvantagens: Pode ocorrer um choque térmico, que induz a prejuízos irreversíveis 
como danos à membrana plasmática, aumento da permeabilidade, com consequente 
perda de íons e moléculas intracelulares e a redução do metabolismo. 
4. Cite os diferentes tipos de meio de cultura que podem ser utilizados para o cultivo 
de microorganismos e explique como se formula um meio de cultivo. 
• Pré-enriquecimento: para amostras que sofreram algum processo físico ou químico. 
Exemplo: caldo lactosado); 
• Enriquecimento: desenvolvimento de bactérias gerais. Exemplo: Caldo Tetrationato. 
• Seletivo: inibem o crescimento de alguns microrganismos e propiciam o 
desenvolvimento de outros (Exemplo: Manitol e MacConkey); 
• Diferencial: permite a diferenciação de microrganismos parecidos (Exemplo: Ágar 
sangue e MacConkey); 
• Triagem: avalia as atividades metabólicas, permitindo a identificação de vários 
microganismos. (Exemplo: Tríplice açúcar e ferro); 
• Identificação: para realização de provas bioquímicas e funções fisiológicas do 
organismo a ser identificado (Exemplo: Ágar citrato, Caldo nitrato); 
• Dosagem: determinações de aminoácidos, vitaminas e antibióticos; 
• Contagem: determinação quantitativa da população microbiana (Ex.: Ágar de 
Contagem em Placas, Ágar Baird-Parker) 
• Manutenção: conserva os microrganismos em laboratório (Ex.: Ágar Sabouraud). 
O cultivo de microrganismo em laboratórios requer a formulação de meios de cultura e o 
estabelecimento de condições que favoreceram o seu desenvolvimento fora do seu habitat 
natural. Os meios de cultura devem proporcionar todos os elementos que compõem a 
célula: Carbono, Nitrogênio, Fosforo, Enxofre, elementos metálicos, vitaminas e água, 
substâncias que os micro-organismos não podem sintetizar, como vitaminas e aminoácidos. 
Como também devem ser observados o pH, a pressão osmótica, o grau de umidade, 
temperatura. 
Os meios de cultura dividem-se primeiramente em meios sólidos, aqueles que contêm agar, 
e meios liquidos, sem agar. Ambos os meios são preparados com água destilada, aquecidos 
até que se dissolvam completamente e posteriormente esterilizados por autoclavagem a 
121º c 
Nos meios sólidos o crescimento por exaustão de nutrientes, devendo realizar-se a 
transferência de colónias para novo meio. No entanto estes meios permitem a 
individualização das colónias. Os meios líquidos permitem melhor difusão de metabólitos, 
mas não o isolamento de colónias. 
 Após autoclavagem, os meios sólidos vertem-se em caixas de petri de forma a cobrir 
uniformemente o fundo da caixa e após solidificação guardam-se por 24h na estufa a 37oC 
para testar a sua esterilidade e em seguida no frigorifico até à altura das sementeiras. Os 
meios sólidos podem também ser vertidos em tubos de ensaio de vidro. Os meios líquidos 
são mantidos em tubos de ensaio de vidro (os meios ditos sólidos estão líquidos quando 
saem da autoclave e solidificam após o arrefecimento). 
Quanto ao grau nutritivo dos meios de cultura consideram-se: 
meios nutritivos gerais: contendo elementos minerais e metabólitos orgânicos. Ex. Agar 
Nutriente, Caldo Nutriente. 
Meios enriquecidos: contendo produtos biológicos (sangue, soro), vitaminas. Ex: Agar 
Sangue, meio geral não seletivo. 
Meios complexos: contêm todos os ingredientes necessários para o crescimento de um 
determinado microrganismo, mas não se conhecem as quantidades exatas de todos os 
componentes. 
Meios definidos: aqueles em que se sabe a concentração exata dos seus componentes. A 
composição destes meios varia consoante os requisitos dos organismos a cultivar. 
Classificam-se ainda os meios em: 
Seletivos:meios para seleção de determinados grupos de bactérias, os quais contêm 
substâncias que inibem o crescimento de outras bactérias distintas daquelas que nos 
interessam (meios sólidos). Ex: Agar Pseudomonas, Tiossulfato-citrato-bilis-sacarose (TCBS) 
para Vibrio, Agar MacConkey para coliformes. 
Diferenciais: para identificação de microrganismos, meios sólidos com a composição 
química adequada para evidenciar uma característica bioquímica (meios sólidos). Ex: 
MacConkey Agar para o isolamento de coliformes, patogênicos intestinais na água 
produtos derivados do leite, e espécimes biológicos. Neste ágar após 24h a 35ºC as colónias 
de Escherichia coli são vermelhas e mucoides, enquanto que as colónias de Salmonella e 
Shigella são brancas. 
Indicadores, meios líquidos, com a mesma função dos diferenciais, servem para evidenciar 
uma característica bioquímica, mas não para separar as colónias positivas e as negativas. O 
pH do meio é ajustado antes de autoclave.