Relatório I Coloração de Gram (1)

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COLORAÇÃO DE GRAM
INTRODUÇÃO
Este relatório visa descrever como é feita, em detalhes, a coloração de bactérias encontradas na mucosa oral seguindo o método desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes: Cristal Violeta, Lugol, Álcool e Fucsina. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas1. Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos2. A Seguir descreveremos os passos necessários para realização do experimento, como também os seus resultados.
OBJETIVO
Observar as morfologias bacterianas da microbiota oral.
MATERIAIS
- Lâminas;
- Swab (palito com algodão em uma das pontas);
- Corante Fucsina;
- Corante Cristal Violeta;
- Álcool Etílico a 95°C;
- Pipetas Pasteur;
- Lugol (Iodo);
- Água para lavar a lâmina;
- Papel tolha;
- Bico de Bunsen.
- Óleo de Imersão.
MÉTODO
Raspar suavemente a mucosa oral com o auxílio do Swab;
Esfregar o Swab sobre a superfície da lâmina delicadamente;
Pegar o corante Cristal Violeta com a pipeta, despejar algumas gotas sobre a lâmina e deixar por 1 (um) minuto;
Após o tempo limite de 1 (um) minuto, escorrer o excesso de corante;
Lavar num fio de Água;
Escorrer o excesso de água da lâmina em um papel absorvente;
Cobrir a lâmina com Lugol (Iodo), aguarde agir por 1 (um) minuto;
Escorrer o excesso da solução;
Cobrir a lâmina com Álcool a 95°, deixar descansar por 15 (quinze) segundos;
Após o tempo de ação do Álcool, deixe escorrer bem;
Deposite o corante Fucsina sobre a lâmina, aguarde 1 (um) minuto;
Após 1 (um) de ação do corante, lave em um fio de água;
Deixe a água escorrer até a lâmina ficar quase seca;
Levar ao microscópio para visualização.
FACESA
Faculdade de Ciências e Educação Sena Aires
Portaria MEC nº 1.504, publicada no DOU em 28/09/2000
RESULTADOS
Figura 1: Células da mucosa oral coradas utilizando a Coloração de Gram. Objetiva de 4x.
Figura 2: Células da mucosa oral coradas utilizando a Coloração de Gram. Objetiva de 10x.
 Figura 3: Células da mucosa oral coradas utilizando a Coloração de Gram. Objetiva de 10x. Notam-se aglomerados de células do tecido epitelial, indicados pelas setas. 
Figura 4: Células da mucosa oral coradas utilizando a Coloração de Gram. Objetiva de 40x. Células do tecido epitelial com o núcleo em tom de rosa mais escuro que o citoplasma, nitidamente visível, indicadas pelas setas.
Estreptococos
Estreptococos
Diplococos
Bacilos
Bacilos
Cocos
Diplococos
Figura 5: Células do tecido epitelial retiradas da mucosa oral coradas utilizando a Coloração de Gram. Objetiva de 100x. Identificação de bactérias gram-positivas (seta preta) coradas de Roxo e bactérias gram-negativas (setas laranja) coradas de Rosa, dentre elas encontram-se Bacilos, Cocos, Diplococos e Estreptococos.
CONCLUSÃO
O esfregaço deve ser feito delicadamente sobre a lâmina, para que o material colhido cubra toda a superfície em uma camada fina. Após a coloração com o Cristal Violeta é necessário a utilização do Álcool a 95° para descorar as bactérias gram-negativas e assim evidenciar sua parede celular e sua membrana interna.
As bactérias Gram-positivas não se descoram pelo tratamento com o álcool, pois possuem uma parede celular espessa composta por tetrapeptídeos e permanecem com a coloração roxa. 
Já as bactérias Gram-negativas sofrem a ação do álcool, porque tem uma camada de parede celular mais fina, o que não é suficiente para impedir a passagem do solvente, além de uma membrana externa composta por fosfolipídios. O álcool dissolve estes lipídeos o que permite a permeabilidade da parede, descorando a célula. As bactérias descoradas pelo álcool são coradas novamente, desta fez, utilizando a fucsina e coram-se de rosa. 
Estas bactérias têm colorações diferentes devido à organização de suas paredes celulares, sendo assim, as bactérias gram-positivas possuem apenas uma parede celular espessa e uma bicamada fosfolipídica, já as bactérias gram-negativas têm uma bicamada fosfolipídica externa, uma parede celular fina e uma membrana plasmática interna, formando um sanduíche.
BIBLIOGRAFIA
1 - VALÉRIA, M. Tecnica de Coloração de Gram. Unichristus. Disponivel em: <http://microbiologia.yolasite.com/resources/Pr%C3%A1tica%20-%20Colora%C3%A7%C3%A3o%20Gram.pdf>. Acesso em: 05 mar. 2019.
 2 - MARTINS et al. Técnica de Coloração de Gram. bvsms.saude.gov.br, 2001. Disponivel em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf>. Acesso em: 05 mar. 2019.