Aula+6 Parãmetros+enzimáticos+e+práticas+ SDS PAGE+ +Enzimas

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09/11/2018 
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Augusto_18 
ESQUEMA DA AULA 
Práticas finais voltadas à caracterização de propriedades da 
da α- glicosidase: 
-Massa molecular- Prática 6, SDS-PAGE verificará o grau de 
purificação da enzima a partir do lisado de S cerevisiae e 
permitirá o cálculo de sua massa molecular. 
 
-pH ótimo- prática 7 
 
-Cinética enzimática- práticas 8 e 9 
 
-Cálculos para a prática de SDS-PAGE (prática 6); estudo 
dirigido de purificação de proteínas (linguagem profissional); 
problema 15. 
 
-Ida ao laboratório ao final da aula para acabar a preparação 
para o experimento de SDS-PAGE. 
 -Enzimas são proteínas, as quais são polieletrólitos de alto PM, 
cujas estruturas, cargas e funções são alteradas pelo pH do meio no 
qual se encontram. 
 -Como definimos o pH ótimo de uma enzima? 
Augusto_18 
É o pH onde a enzima apresenta o máximo de atividade. 
A
ti
v
id
a
d
e
 r
e
la
ti
v
a
 
A
ti
v
id
a
d
e
 r
e
la
ti
v
a
 
Depende da enzima- extremos de pH denaturam proteínas mas o 
o pH ótimo depende também dos grupos da enzima que participam 
do mecanismo de catálise. 
pI- ponto isoelétrico- pH onde a enzima tem carga líquida zero. 
(protease; estômago) 
(via glicolítica; citossol) 
ENZIMAS E pH 
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CINÉTICA ENZIMÀTICA 
 -Durante este curso para calcular a concentração de atividade 
enzimática utilizamos concentrações saturantes de substrato (Vmax; toda 
E está ligada ao S), condições nas quais a velocidade da reação 
enzimática é proporcional à concentração de enzima. 
E + S ES E + P (rápida) 
 S P (lenta) Reação não catalisada 
Reação catalisada pela enzima E 
k1 
k-1 
k2 
 
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vo= Vmax [S] 
 [S] + KM 
Equação de Michaelis-Menten 
v= k [E] [S] 
KM = k2+k-1/k1 Onde: 
Vmax = k2 [Et] 
-Para determinar os parâmetros cinéticos da enzima precisamos 
determinar a velocidade da reação com várias [S]. 
EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN 
Vo=1/2 Vmax 
 
Vmax= Vmax [S] 
2 [S] + Km 
KM=[S] 
KM= k2+k-1/k1 
E + S ES E + P 
k2 
k-1 
k1 
k2 muito pequeno 
KM= k-1/k1=KS 
Constante de dissociação ES 
vo= Vmax [S] 
 [S] + Km 
[S]<<<Km vo= Vmax [S] 
 Km 
1a. ordem em S (k2) 
[S]>>>Km Vo= Vmax 
ordem zero em S 
ordem zero em relação ao S 
1a. ordem em relação ao S 
[E1] 
[E2= 2 E1] 
KM 
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1/[S] 
1/v 
1/Vmax 
-1/KM 
Plote de Lineweaver-Burk 
Inclinação =Km/Vmax 
[S] 
v 
CÁLCULO DE KM E VMAX 
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vo= Vmax [S] 
 [S] + KM 
1/v0 = Km/Vmax . 1/[S] + 1/Vmax 
MEDICAMENTOS INIBIDORES DE ENZIMAS 
-VIAGRA (SILDENAFIL)-INIBIDOR DE FOSFODIASTERASE 
HN
N N
N
O
O
P
O
O
H2N
OH
O OH
HN
N N
N
O
CH3
O
CH3
SO O
N
N
CH3
cGMP
Sildenafil
-CELEBRA E VIOXX- INIBIDORES DA COX-2 
 
-ESTATINAS-INIBIDORES DA HIDROXIMETIL GLUTARIL COA REDU- 
TASE (BIOSSÍNTESE DO COLESTEROL) 
 
-COQUETEL DE INIBIDORES DE PROTEASES-HIV 
FOSFATO 
GUANILATO CICLASE 
MIOSINA 
RELAXAMENTO 
 
FOSFODIASTERASE 
CGMP + FOSFATO 
H2O 
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INIBIÇÃO (x modulação) DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
-Irreversível- modificação covalente(não reparável) 
 Inibição suicida 
E + I E-I 
Proteólise 
1 e COX2 
 ácido 
araquidônico 
X 
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-Reversível- formação de um complexo EI 
 (revertida por diálise, filtração em gel, etc) 
“Docking” no 
síto ativo da MPO 
INIBIÇÃO COMPETITIVA 
Inibidor compete com o substrato pelo 
sítio ativo (semelhança estrutural) 
 
O aumento da concentração do 
substrato pode deslocar o inibidor. 
 
Vmax não se altera; Km aparente 
aumenta; slope aumenta. 
 
= 1 + [I] 
 KI 
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INIBIÇÃO ACOMPETITIVA 
Inibidor liga-se ao complexo ES 
(sítio diferente do substrato) 
 
Aumento na [S] não reverte a inibição. 
A ligação do inibidor remove uma fração de 
ES (diminui Vmax). 
 
Vmax aparente diminui; Km aparente diminui; 
slope não se altera 
‘= 1 + [I] 
 KI´ 
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INIBIÇÃO MISTA 
Inibidor liga-se a um sítio diferente do 
sítio ativo, afetando tanto E como 
ES. 
 
Vmax aparente diminui; Km aparente 
aumenta ou diminui; Slope aumenta 
ou diminui 
KI≠KI` 
= 1 + [I] 
 KI 
‘= 1 + [I] 
 KI’ 
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INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA 
Inibidor liga-se a um sítio diferente do 
sítio ativo tanto em E como em ES 
afetando Vmax. 
 
Vmax aparente diminui; Km aparente → 
não altera; slope aumenta 
KI=KI` 
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V0 
= + 
Km 1  
Vmax [S] Vmax 
= 1 + [I] 
 KI 
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PRÁTICAS 8 E 9: CARACTERIZAÇÃO DA -
GLICOSIDASE (KM E VMAX) E INIBIÇÃO POR 
MALTOSE (KI) 
Cinética Enzimática e Inibição da Atividade Enzimática 
-Estudar o efeito da [S] na velocidade da reação da -
glicosidase contida no lisado de Saccharomyces cerevisiae e 
calcular Km e Vmax. 
-Repetir o experimento na presença de duas concentrações de um 
inibidor (maltose) e calcular o KI (constante de inibição pela maltose). 
Cuidados com as concentrações das soluções e com os 
volumes pipetados!!! 
-glicosidase 
KM e Vmax e KI 
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TAMPÃO DE AMOSTRA 
(Laemmli buffer) 
Água 3,55 mL 
Tampão Tris 0,5 M pH 6,8 1,25 mL 
Glicerol (aumenta a densidade) 2,50 mL 
SDS 10 % (desnatura proteínas) 2,00 mL 
Azul de bromofenol 0.5% (corante marca a frente da corrida) 0,20 mL 
-mercaptoetanol (redutor de pontes dissulfeto) 0,05 mL 
+ 25 L 
Tampão de 
amostra 
Ferver/ 5 min 
SDS-PAGE 
2) Preparo das amostras 
Augusto_18 
Amostras 
secas 
(DEAE 
dialisada e 
seca) 
maximum 
~100 µg protein 
http://bitesizebio.com/3285/sds-page-the-easy-way-to-find-the-wells/ 
 
Aplicar as amostras com cuidado! 
1 2 3 4 
1: Padrão de peso molecular 
2: Lisado centrifugado 
3: P2 (precipitação c/sal e diálise) 
4:Material DEAE 
SDS-PAGE 
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8 
+ 25 L 
Tampão de 
amostra 
Ferver/ 5 min 
Amostras 
secas 
(DEAE 
dialisada e 
seca) 
maximum 
~100 µg protein 
Amostras aplicadas no gel devem ter a mesma quantidade de 
proteína por poço 
Volume de material DEAE 
dialisado ? 
[Proteína] (ug/ml) =? 
Quantidade de Proteína 
dialisada e seca 
ug = x (?) 
Lisado 
[Proteína] (ug/ml) =?) 
Qual volume de lisado 
preciso pipetar para ter a 
mesma quantidade de 
proteína que o material 
DEAE? ( x ug proteína) 
P2 dialisada 
[Proteína] (ug/ml) =? 
Qual volume de P2 
preciso pipetar para ter a 
mesma quantidade de 
proteína que o material 
DEAE? ( x ug proteína) 
+ - 
+ - 
Ligar a fonte e aguardar a 
migração da proteína até o 
final. 
Augusto_18 
SDS-PAGE 
Durante a espera 
determinar o pH ótimo da 
α-glicosidase (Prática 7) 
(usar o lisado)