Seminário de Alcaloides

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Universidade Federal da Paraíba
Programa de Pós-Graduação em Produtos 
Naturais e Sintéticos Bioativos
Disciplina: Produtos Naturais I - Alcaloides
Docente: Dr. Emídio Vasconcelos Leitão Cunha
Mestrando: Anderson Vieira
João Pessoa, 2015.
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	1. Introdução
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Família: Apocynaceae;
Gênero: Tabernaemontana;
Espécie: salzmannii;
Nome popular: “Espeta”;
Nativa no sudeste;
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
99 espécies;
27 no Brasil.
Fonte: http://img.socioambiental.org/v/publico/pibmirim/ondevivem/
rema_mata_atl__ntica_bioma2peq.jpg.html
O gênero Tabernaemontana pertence à família Apocynaceae e em sua última revisão botânica feita por Leeuwenberg é reagrupado com outros gêneros, totalizando 99 espécies, das quais 27 são encontradas no Brasil (Leeuwenberg, 1994). A ocorrência de aproximadamente ¼ das espécies do gênero no Brasil demonstra a necessidade de aprofundar o estudo fitoquímico das espécies brasileiras do gênero.
Entre as apocináceas, Tabernaemontana é especialmente rico em alcaloides indólicos monoterpênicos, que são utilizados como marcadores químicos do gênero, sendo então usados na classificação de suas espécies (VanBeek et. al., 1984). Os alcaloides indólicos monoterpênicos apresentam inúmeras atividades biológicas, das quais podese destacar as atividades, antitumoral, antimicrobiana, anti-hipertensiva e estimulante do sistema nervoso central (Verpoorte, 1998).
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	1. Introdução
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Marcadores químicos do gênero:
Todas as classes de alcaloides indólicos monoterpênicos;
Biossíntese:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Via Chiquimato
Via MEP
Em publicações anteriores foi relatado o isolamento e identificação de alcaloides indólicos monoterpênicos das espécies T. laeta (Medeiros et al., 1999, 2001 e 2003) e T. hystrix (Monnerat et al., 2005a), bem como a atividade anticolinesterásica de dezessete alcaloides indólicos (Vieira et al., 2008).
Como parte de nosso contínuo interesse na investigação fitoquímica de espécies de Tabernaemontana de ocorrência no Brasil, decidiu-se estudar Tabernaemontana salzmannii, uma espécie nativa da Mata Atlântica do sudeste do Brasil, popularmente conhecida como “espeta” sem relatos químicos na literatura. T. salzmannii possui como sinonímia homotípico: Peschiera salzmannii (A. DC.) Miers, Apoc. S. AM. 40 (1878) e sinonímia heterotípico: T. rauwolfiae A. DC. e T. salzmannii var. longifolia Muell (Leeuwenberg, 1994).
MEP: Metil-Eritroil Fosfato e a reação ocorre nos cloroplastos. 
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	1. Introdução
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Atividades dos alcaloides indólicos monoterpênicos:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Fonte: http://ceb.edu.es/pt/combinacion-de-farmacos-mejora-el-tratamiento-antitumoral/
Anti-hipertensivo
Antimicrobiano
Estimulante SNC
Antitumoral
Em publicações anteriores foi relatado o isolamento e identificação de alcaloides indólicos monoterpênicos das espécies T. laeta (Medeiros et al., 1999, 2001 e 2003) e T. hystrix (Monnerat et al., 2005a), bem como a atividade anticolinesterásica de dezessete alcaloides indólicos (Vieira et al., 2008).
Como parte de nosso contínuo interesse na investigação fitoquímica de espécies de Tabernaemontana de ocorrência no Brasil, decidiu-se estudar Tabernaemontana salzmannii, uma espécie nativa da Mata Atlântica do sudeste do Brasil, popularmente conhecida como “espeta” sem relatos químicos na literatura. T. salzmannii possui como sinonímia homotípico: Peschiera salzmannii (A. DC.) Miers, Apoc. S. AM. 40 (1878) e sinonímia heterotípico: T. rauwolfiae A. DC. e T. salzmannii var. longifolia Muell (Leeuwenberg, 1994).
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	2. Objetivo
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Investigação fitoquímica de Tabernaemontana salzmannii;
Porções: cascas do caule e folhas;
Avaliação da atividade in vitro contra células leucêmicas humanas THP-1;
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Fonte:http://calphotos.berkeley.edu/cgi/img_query?enlarge=0000+0000+0908+0162
Como parte de nosso contínuo interesse na investigação fitoquímica de espécies de Tabernaemontana de ocorrência no Brasil, decidiu-se estudar Tabernaemontana salzmannii, uma espécie nativa da Mata Atlântica do sudeste do Brasil, popularmente conhecida como “espeta” sem relatos químicos na literatura. T. salzmannii possui como sinonímia homotípico: Peschiera salzmannii (A. DC.) Miers Apoc. S. AM. 40 (1878) e sinonímia heterotípico: T. rauwolfiae A. DC. e T. salzmannii var. longifolia Muell (Leeuwenberg, 1994).
No presente trabalho, é relatado o isolamento e identificação de nove alcaloides indólicos monoterpênicos das cascas das raízes e folhas de T. salzmannii, incluindo a atividade in vitro contra células leucêmicas humanas THP-1 dos alcaloides majoritários isolados.
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	3. Materiais e Métodos
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Material Vegetal:
Cascas das raízes e folhas de T. Salzmannii coletada pelo Prof. Dr. Ivo Vieira em agosto de 2000;
Local: Reserva Biológica do Vale do Rio Doce, Linhares-ES;
Identificação botânica: Domingos Folly;
Exsicata: Herabário da Companhia – CVRD-133.
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Fonte: https://minassustentavel.wordpress.com/tag/ief-minas/
As cascas das raízes e folhas de T. salzmannii
foram coletadas pelo Prof. Dr. Ivo J. Curcino Vieira em
agosto de 2000, nas proximidades da Reserva Biológica
da Companhia Vale do Rio Doce, Linhares-ES, Brasil.
A identificação botânica da espécie foi realizada pelo
Botânico Domingos A. Folly, sua exsicata encontrase
depositada
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	3. Materiais e Métodos
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Extração e Isolamento dos Constituintes Químicos:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Folhas (1,2 kg)
Extração Ácido/Base [H3PO4 (4%)/ NH4OH (10%)
Extração com CH2Cl2]
14 Frações
5.10
(7)
Fração 4
5.8
(6)
Fração 5
(5)
15 Frações
Recromatografado
Col. Sílica
CH2Cl2:MeOH
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Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Casca de raiz (2,0 kg)
Secagem
Trituração
Maceração
N-hexano
CH2Cl2
MeOH
15 Frações
Fração 15
7 Frações
4 Frações
Col. Sílica
CH2Cl2:MeOH
Fração 2
CH2Cl2:MeOH
Fração 6
CH2Cl2:MeOH
2.3
(1)
2.6
(9)
6.3
(2)
(3)
CCDP
CH2Cl2:MeOH
5 Frações
Fração 2
Fração 5
Col. Sílica
CH2Cl2:MeOH
5.3
(8)
2.3
(4)
8
	4. Resultados
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Identificação dos Alcaloides:
Espectros de RMN:
Unidimensionais (1D): 
Bidimensional (2D):
- Espectros de Massa	
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
RMN ¹H
RMN ¹³C
¹H-¹H-COSY
HMQC
HMBC
¹H-¹H-NOESY
Espectros de RMN uni- (1D: RMN 1H, RMN 13C-PND e RMN 13C-APT) e bidimensional [2D: 1H-1H-COSY, 1H-1H-NOESY, HMQC e HMBC]. 
Os dados obtidos através destes espectros nos permitiram a atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos de todos os átomos de hidrogênio (δH) e carbono-13 (δC).
Os sinais dos espectros de RMN 13C dos alcaloides 1-9 correspondentes a carbonos quaternários, metínicos, metilênicos e metílicos foram identificados pela análise comparativa dos espectros obtidos com desacoplamento de hidrogênio PND e com a técnica APT.
A atribuição inequívoca dos δC de todos os átomos de carbono foi assegurada pelas análises dos espectros bidimensionais de correlação heteronuclear HMQC e HMBC. A análise dos espectros bidimensionaisde correlação homonuclear 1H-1H-COSY permitiu reconhecer todas as interações spin-spin dos átomos de hidrogênio. Os espectros bidimensionais de interação dipolar 1H-1HNOESY dos alcaloides 1-9 foram utilizados para confirmar as junções dos anéis e as conformações correspondentes.
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	4. Resultados
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Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
1 - Coronaridina
2 - (19S)-heyneanina
9 - 3-oxo-coronaridina
3 -Voachalotina
4 - Voacangina
5 - Isovoacangina
6 - Isovoacristina
8 - Olivacina
7 -(3S)-hidroxiisovoacangina
	4. Resultados
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Identificação dos Alcaloides:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
RMN ¹H (400 MHz, CDCl3):
7,67 (s,NH)
7,13 (d, J=8,8, H-12)
6,92 (d, J=2,6 Hz, H-9)
6,80(dd, J=2,2 e 2,6 Hz, H-11
3,85 (sl, OCH3);
3,71 (sl,CO2CH3)
0,89 (t, J=7,4 Hz, H-18)
1,87 (s, H-14)
1,31 (m, H-20)
3,54 (sl, H-21)
Assim como sinal de H de grupo metoxila em dH 3,73 (Ome).
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	4. Resultados
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Identificação dos Alcaloides:
- Voacangina:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
RMN¹³C (100 MHz, CDCl3)
137,54 (C-2)
27,38 (C-14)
51,57 (C-3)
32,04 (C-15)
53,14 (C-5)
55,15 (C-16)
22,21 (C-6)
36,57 (C-17)
110,15 (C-7)
11,63 (C-18)
129,22 (C-8)
26,67 (C-19)
100,88 (C-9)
39,14 (C-20)
154,03(C-10)
57,49 (C-21)
111,82(C-11)
175,69 (C-22)
111,05 (C-12)
56,06 (MeO-10)
130,59 (C-13)
52,53 (MeO-22)
Assim como sinal de H de grupo metoxila em dH 3,73 (Ome).
12
	4. Resultados
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Identificação dos Alcaloides:
- Isovoacangina:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
RMN ¹H (400 MHz, CDCl3):
7,75 (s,NH)
6,76 (d, J=2,2, H-12)
7,33 (dd, J=9,2e 2,6Hz, H-9)
6,75(m, H-10)
3,82 (sl, OCH3);
3,71 (sl,CO2CH3)
0,89 (t, J=7,3 Hz, H-18)
1,89 (d, J=2,2, H-14)
1,53 (m, H-20)
3,53 (sl, H-21)
	4. Resultados
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Identificação dos Alcaloides:
- Isovoacangina:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
RMN¹³C (100 MHz, CDCl3)
136,18 (C-2)
27,33 (C-14)
51,38 (C-3)
32,03 (C-15)
53,06 (C-5)
55,01 (C-16)
22,12 (C-6)
36,38 (C-17)
110,00 (C-7)
11,58 (C-18)
123,16 (C-8)
26,67 (C-19)
118,98 (C-9)
39,09 (C-20)
108,85(C-10)
57,56 (C-21)
156,43(C-11)
175,80 (C-22)
94,23 (C-12)
55,65 (MeO-11)
135,25 (C-13)
52,44 (MeO-22)
	4. Resultados
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Identificação dos Alcaloides:
- Olivacina:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
RMN ¹H (400 MHz, CDCl3):
3,03 (s,H-21)
2,74 (s, H-17)
8,62 (s, H-18)
8,19 (d, J=7,7 Hz,H-9)
7,30 (m, H-10 e H-11)
7,26 (m, H-12)
7,72(d, J=6,2, H-3)
7,51 (d, J=5,5, H-14)
	4. Resultados
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Identificação dos Alcaloides:
- Olivacina:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
RMN¹³C (100 MHz, CDCl3)
140,90 (C-2)
115,14 (C-14)
137, 93 (C-3)
132,87 (C-15)
122,17 (C-7)
110,94 (C-16)
123,05 (C-8)
11,96 (Me-17)
120,88 (C-9)
114,64 (C-18)
119,45 (C-10)
125,40 (C-19)
127,63(C-11)
158,79(C-20)
110,63 (C-12)
22,00 (Me-21)
142,33 (C-13)
-
Indólico + Isoquinolínico
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	3. Materiais e Métodos
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Cultura de Células Leucêmicas THP-1:
Cultura replicada a cada dois dias;
Mantida em estuda a 37°C, com 5% de CO2. 
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Meio D-MEM F12
(Life Technology–USA)
20 µg/ml de gentamicina 
10% de soro fetal bovino
Linhagem monocítica de origem humana
Meio D-MEM F12 (Life Tecnology – USA);
Suplemento com 20 µg/ml de gentamicina (Life Tecnology – USA) e 10% de soro fetal bovino (Life Technology – USA);
Cultura replicada a cada dois dias e mantida em estuda a 37°C, com 5% de CO2. 
 DMEM: Esta é uma abreviatura do inglês Dulbecco/Vogt modified Eagle's (Harry Eagle) Minimal Essential Medium. O DMEM comercial é o meio utilizado para a maioria das células. Ele difere do meio original MEM, pois contém cerca de 4 vezes mais vitaminas e os aminoácidos do que as presentes na fórmula original, e alguns de 2 a 4 vezes mais glicose. Também contém ferro e outros adicionais. A maioria dos tipos de células humanas, de macaco, de hamster, de rato e galinha crescem bem neste meio;
Soro bovino: Os meios de cultura celulares são sempre suplementados com soro. A maioria das linhas de células é cultivada em meio DMEM suplementado, seja com soro bovino a 10% ou soro fetal bovino a 10%. As células transformadas normalmente crescem bem em soro fetal bovino. Algumas linhagens muito exigentes são cultivadas em soro fetal bovino a 20%. Como alternativa ao soro fetal bovino, devido ao custo e a escassez, algumas células são cultivadas em soro de cavalo.
O meio de algumas células linfóides é suplementado com 5 x 10-5 M de 2-mercaptoetanol, independente da ocorrência de oxidação. Outras linhagens melhoram após a inclusão 2mM de glutamina; 2, 5 ou 10% de caldo triptose fosfato; 2mM de piruvato; ou aminoácidos não-essenciais nos seus meios de cultura.
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	3. Materiais e Métodos
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Avaliação da atividade antileucêmica dos alcaloides (19S)-heyneanina (2), coronaridina (1), isovoacangina (5), isovoacristina (6) e voacangina (4):
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Células THP-1
Diferentes concentrações de alcaloides
Sulfato de vincristina
200 µL
37°C, com 5% CO2 e umidade relativa
As células leucêmicas humanas THP-1 foram semeadas em placas de 96 poços em volume de 200 μL (1,2x 106cels/mL) e tratadas com diferentes concentrações dos alcaloides e do medicamento contendo sulfato de vincristina como controle positivo e mantidas na estufa a 37 oC, com 5% de CO2 e umidade relativa. 
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	3. Materiais e Métodos
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Avaliação da atividade antileucêmica dos alcaloides (19S)-heyneanina (2), coronaridina (1), isovoacangina (5), isovoacristina (6) e voacangina (4):
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
6, 12 e 24h células coradas
Controle: 
12, 24, 36 e 48h.
Laranja de Acrinida
1 µg/mL
Contagem: apoptóticas, necróticas e normais
Brometo de Etídio
1 µg/mL
Nos tempos de 6, 12 e 24 h as células foram coradas e as células apoptóticas, necróticas e normais foram contadas. Para o medicamento contendo sulfato de vincristina como controle positivo, foram analisados os tempos de 12, 24, 36 e 48 h.
As células cultivadas com as diferentes drogas e em diferentes tempos foram coradas com uma solução de 1 μg/mL de laranja de acridina e 1 μg/mL de brometo de etidio. 
19
	3. Materiais e Métodos
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Avaliação da atividade antileucêmica dos alcaloides (19S)-heyneanina (2), coronaridina (1), isovoacangina (5), isovoacristina (6) e voacangina (4):
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Contagem: 
300 células.
Discriminação:
Apoptóticas;
Necróticas;
Normais.
Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Microscopia_de_fluoresc%C3%AAncia
Após a montagem em lâmina e lamínula, as células foram levadas ao microscópio de fluorescência e contadas aproximadamente 300 células em vários campos
escolhidos aleatoriamentee discriminando-se as células apoptóticas, necróticas e normais.
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	4. Resultados
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Avaliação da atividade antileucêmica dos alcaloides majoritários:
Capacidade de induzir a apoptose;
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Voacangina
Controle
Corpos Apoptóticos
Núcleo Picnótico
	4. Resultados
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Avaliação da atividade antileucêmica dos alcaloides majoritários:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Dentre os alcaloides majoritários testados [coronaridina (1), (19S)-heyneanina (2), isovoacangina (5), isovoacristina (6) e voacangina (4)] apenas a voacangina (4) e isovoacangina (5) apresentaram resultados satisfatórios de mortalidade celular (Tabela 1). Pode-se observar que a morte celular ocorreu em 100% pelo processo de apoptose. A voacangina (4) apresentou 80% de apoptose na concentração de 100 μmol, num período de 24 h, enquanto que a isovoacangina (5) apresentou 80% de células apoptóticas num período de 6 h na concentração de 100 μmol. Em todos os tempos estudados não foi observado número significativo de células coradas pela laranja de acridina o que sugere que nenhum dos alcaloides estudados foi capaz de induzir morte celular por necrose. A semelhança estrutural entre as duas substâncias seria um ponto de partida para a avaliação da atividade, visto que ambas são substituídas no anel aromático por um grupo metoxila.
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	4. Resultados
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Avaliação da atividade antileucêmica dos alcaloides majoritários:
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
	5. Conclusões
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Isolamento de nove alcaloides indólicos monoterpênicos;
Voacangina (4) e isovoacangina (5): efetivos frente às células leucêmicas humanas da linhagem THP-1 (até mais efetivos que o controle);
Ponto de partida para futuros estudos com outras linhagens de células cancerígenas.
Isolamento, identificação e avaliação da atividade antileucêmica de alcaloides indólicos monoterpênicos de Tabernaemontana salzmannii A. DC., Apocynaceae
Universidade Federal da Paraíba
Programa de Pós-Graduação em Produtos 
Naturais e Sintéticos Bioativos
Disciplina: Produtos Naturais I - Alcaloides
Docente: Dr. Emídio Vasconcelos Leitão Cunha
Mestrando: Anderson Vieira
João Pessoa, 2015.
Contato: anderson_avp@hotmail.com
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