Introdução à Microbiologia: Equipamentos e Meios de Cultura

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MICROBIO PRÁTICA
Alça de Drigalski: usada para espalhar o meio de cultura na placa.
Bico de Bunsen: é a chama de fogo, usada para flambagem.
Placa de Petri: recipiente cilíndrico e achatado, que serve para colocar meios de cultura sólidos.
Swab: material parecido com um cotonete, porém maior. Usado para coletar amostras de 
microrganismos em superfícies.
Agulha e Alça de inoculação: é um instrumento laboratorial utilizado em microbiologia para a 
inoculação de meios de cultura de microorganismos.
Pipeta Eletrônica: A pipeta é um material de laboratório muito utilizado, e sua função principal é 
transportar quantidades precisas de material líquido. São usadas, por exemplo, em diversos exames 
médicos e no estudo da biologia molecular
Jarra de anaerobiose: cultivar microorganismos na ausência de oxigênio
Avaliação do nível de contaminação
Onde pode ter contaminação? Ar condicionado, superfícies, maçaneta, nas mãos, no próprio ar. Fazer
avaliação da contaminação do ar: deixar recipiente aberto no ar. Fazer avaliação da contaminação de 
superfícies: swab. 
As células microbianas, em condições nutritivas adequadas, multiplicam-se, originando, sobre uma 
superfície sólida, uma população macroscopicamente visível, denominada colônia. As características 
morfológicas mais evidentes das colônias de bactérias e de fungos são tamanho, aspecto (textura), 
pigmentação (verso e reverso), superfície (lisa ou rugosa, côncava ou convexa, uniforme, umbilicada 
ou radiada) e bordas (regulares, irregulares ou serrilhadas). O tamanho e o aspecto das colônias 
auxiliam na diferenciação entre bactérias e fungos, como descrito no quadro que se segue.
MEIOS DE CULTURA
 São substratos adequados ao crescimento, multiplicação e desenvolvimento dos micro-organismos 
fora de seu hábitat natural. 
Grande variedade de tipos representação de diferentes habitats (solo, águas, sítios do organismo); 
Variam em relação as exigências nutritivas do microrganismo a ser cultivado (Fonte de energia, Fonte
de C e N, Fonte de minerais, Fatores de crescimento, etc.) 
Atentar para condições ambientais (fatores físicos), como pH, temperatura, atmosfera e pressão 
osmótica.
MEIOS DE CULTURA- COMPOSIÇÃO:
* Água → destilada ou deionizada.
* Uma base nutritiva → caldo de carne ou extrato de carne, extrato de levedura, etc → macro e 
micronutrientes: compostos orgânicos (carboidratos, lipídios, proteínas), sais inorgânicos (Na+, K+, 
Mg+2,), vitaminas, etc.
* Uma substância nutritiva suplementar → peptona (produzidas por meio de hidrólise enzimática de 
proteínas, composta de mistura de peptídeos e aminoácidos, e fontes de nitrogênio).
* Um fator isotinizante → NaCl, necessário para manter o meio isotônico.
* Um tampão → amenizar a variação dos valores de pH, mantendo o meio estável (compensar a 
evolução de CO2 e ácidos do metabolismo). Ex: carbonato de cálcio.
* Uma substância solidificante (se for meio sólido)→ agar (extrato polissacarídico de algas marinhas.
É resistente à ação dos microorganismos. Funde completamente a 100° C mas forma gel a menos de 
45° C).
* Substâncias especiais → corantes, antissépticos, antibióticos (meios seletivos).
Quais seriam as utilidades dos meios de cultura?
- Estoque microbiano;
- Isolamento e crescimento;
- Triagem e identificação;
-Estudos científicos
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA
 Quanto à origem:
a) Naturais: se estão prontos na natureza. Ex: leite, sangue.
b) Artificiais: aqueles que são elaborados. Ex: ágar nutriente.
 Quanto à composição:
a) Complexos: não apresentam composição química definida. Ex: agar sangue, agar chocolate, meios 
com extrato de carne, extrato de levedura.
b) Sintéticos: tem composição química definida. Ex: meios utilizados no cultivo de quimioautotróficos
(Nitrosomonas).
 Quanto ao estado físico:
a) Líquidos: Não contém ágar 
b) Sólidos: Contém percentagem significativa de ágar (1,5%)
c) Semi-sólidos: Pequena percentagem de ágar (0,5% a 0,75%).
 Quanto à finalidade:
a) Meios Básicos: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microrganismos pouco
exigentes. Ex: agar nutriente, TSA (trypticase soy agar), LB (Luria-Bertani).
b) Meios Enriquecidos: permitem o desenvolvimento de microrganismos fastidiosos, pois são 
adicionados ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de 
leveduras. Ex: agar sangue e agar chocolate.
c) Meios de Manutenção: destinados a manter a viabilidade de uma cultura. Ex: meio BHI (Brain 
Heart Infusion) com glicerol.
d) Meios de Transporte: meio isento de nutrientes, que contém agentes redutores, tais como 
tioglicolato ou cisteína. Geralmente mantém um pH favorável que previne a desidratação de 
secreções durante o transporte e evita a oxidação enzimática dos patógenos presentes. Ex: meio de 
Stuart, meio de Cary Blair, caldo tioglicolato.
e) Meios Seletivos: favorecem o desenvolvimento de determinados microorganismos, em detrimento
de outros, pela adição de substâncias inibidoras. Ex: agar manitol salgado (NaCL 7,5%).
f) Meios Diferenciais e meios seletivos e diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de 
micro-organismos com características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo 
ou uma espécie. Ex: agar SS, agar MacConkey, agar EMB.
Coloração de gram 
Usa primeiro o corante cristal violeta pra corar juntamente com o iodo (forma um complexo junto 
com o cristal violeta) depois descora com álcool (descora só as gram negativas) e por último usar o 
contracorante fucsina ou safranina. Pq descora a gram negativa e não descora a gram positiva? Por 
causa da espessura da parede celular. Quando tratamos com o iodo e cristal violeta, forma um 
complexo grande e como o peptideoglicano da gram + é muito mais espesso esse complexo tem 
mais dificuldade de passar. Já a parede da gram -, é só um peptideoglicano delgado e a membrana 
externa e qndo lava com álcool ela absorve a membrana externa e fica uma pequena camada de 
peptideoglicano pra sair o corante, ele sai facilmente.
Bactéria roxa: gram +. Nesse caso a bactéria tem parece celular gram + com peptideoglicano espesso 
e membrana citoplasmática, com a presença de ácidos teicoicos (regulam a atividade das autolisinas 
– que fazem a quebra do peptideoglicano na divisão celular).
Bactéria rosa: gram –. Nesse caso a bactéria tem parede celular gram – com peptideoglicano fino, 
membrana externa e membrana citoplasmática, sem ácidos teicoicos. A membrana externa é 
dividida em face interna (parecida com a membrana plasmática – fosfolipideos) e face externa, a 
qual tem lipopolissacarideos (LPS).
Formas das bactérias: cocos, bacilos ou bastonetes, espiroquetas, vibriões, espirilos.
Arranjos das bactérias: estafilo (em cachos), estrepto (arranjo em cadeia), sarcinas, diplo (diplococos, 
por ex.), isolados.
A: Diplococos Gram-negativos
B: Cocos ou diplococos Gram-positivos
C: Estreptococos Gram-positivos
D: Bacilo Álcool-Ácido Resistente
E: Espiroquetas Gram-negativas
F: Cocobacilos Gram-negativos
G: Estafilococos Gram-positivos
H: Bactérias pleomórficas (geralmente bastões) Gram-positivas
Preparo do esfregaço:
a- Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de 
Bunsen;
b- Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço; 
c- Flambar a alça bacteriológica deixá-la esfriar e colocar na lâmina uma gota de solução salina 
fisiológica;
d- Flambar a agulha bacteriológica, deixar esfriar próximo a chama, abrir a placa com a cultura 
teste e tocar a colônia escolhida para retirada da amostra, 
e- Esfregar o material com movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se obter um 
esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;
 f- Deixar secar nas proximidades da chama;
g- Fixar o esfregaço passando alâmina (lado oposto ao esfregaço) na chama do bico de Bunsen 
(rapidamente).
 Coloração por Gram
Cobrir a área do esfregaço com a solução de cristal-violeta por cerca de 1min.;
Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
Cobrir o esfregaço com a solução de safranina1 por cerca de 30 segundos;
Lavar com água corrente;
Deixar secar ao ar .
Processo de identificação de microrganismos 
Tipos de testes: molecular (PCR), microbiológicos (cultivo em meios, microscopia, etc) e bioquímicos 
(testes metabólicos).
Pra fazer um teste: primeiro isola o microrganismo (coleta com swab e coloca pra crescer num meio 
de cultura sólido) e coloca num meio seletivo ou diferencial. 
Identificação de enterobactérias: na aula prática, isolamos o microrganismo (como ta escrito ali em 
cima). Tinha 3 meios de cultura, que tinha o açúcar lactose e se o microrganismo fermentava lactose,
dava pra ver pela mudança de ph. Daí foi um meio diferencial, porque deu pra ver caraterística 
metabólica da bactéria. Mas esses meios também eram seletivos pq tinham agentes que impediam 
crescimento de gram positiva: os sais biliares. Então, pode usar meios seletivos ou diferenciais pra 
começar um processo de identificação microbiológica. Isso foram testes presuntivos.
Depois fizemos um teste confirmatório, pra confirmar a habilidade de fermentação, num tubo que 
tinha 3 tipos de açúcar: lactose, sacarose e glicose. E dava pra ver outra coisa nesse meio que não 
vimos nas placas: a produção do gás H2S, o tubo ficava preto. Até agora então observamos 
características metabólicas, como habilidade de fermentar açúcar e habilidade de produzir H2S. O 
último teste de confirmação foi nuns tubinhos, o teste se chama série bioquímica (passo final do 
processo de identificação) e é usado pra observar diversas características metabólicas (habilidades 
fermentativas, produção de ácidos, gases, etc).
Tipos de hemólise (saber ver qual é): 
alfa hemólise – hemólise parcial, fica esverdeada porque acumula bilirrubina.
 Beta hemólise – hemólise completa, fica translúcida ou amarela. 
Gama hemólise - fica sem cor, transparente.
Métodos de esterilização e desinfecção
Autoclave: método de esterilização do tipo calor úmido.
Estufa: método de esterilização do tipo calor seco.
Em sala, usa-se para esterilização a chama direta (flambagem dos instrumentais).
Esterilização: mata todos os microrganismos, inclusive esporos bacterianos.
Desinfecção: eliminação de microrganismos, mas sem destruir os esporos bacterianos.
Diferença entre desinfecção e antissepsia: desinfecção é a diminuição de microrganismos de 
superfícies inertes e antissepsia é a diminuição de microrganismos de tecidos vivos.
Assepsia: diminuição de micro-organismos de superfícies inertes
Comparação de 3 agentes de desinfecção/antissepsia: álcool 70%, álcool iodado e clorexidine. Os mais
eficientes primeiro é o álcool iodado, clorexidine e por último álcool 70%. Álcool iodado e álcool 70%
tem uma atividade sinérgica, são dois elementos de desinfecção e juntos são muito mais eficientes 
do que de maneira separada.
Identificação de cocos gram +
Existem duas famílias de cocos gram +: streptococaceae e micrococaceae (que são cocos de outros 
tipos que não sejam estrepto, como estafilococos por ex.)
Como diferenciar as duas famílias: teste de catalase (se é estrepto ou estafilo por ex.). Se der catalase
positiva é micrococaceae e catalase negativa é streptococaceae.
Como deu catalase positiva, fizemos outro teste: DNAse e manitol salgado. Com DNAse positivo e 
manitol positivo (quando fermentou o manitol, ficou com cor amarela) é Stafilococcus. Pra saber se é
Stafilococcus aureus, faz o teste de coagulase (que é positivo pra stafilococcus aureus) e forma um 
coágulo no tubo. (saber identificar)
DNAse +, manitol + e coagulase = é Stafilococcus aureus.
Na placa de DNAse: colocava ácido clorídrico (HCl) pra poder ver, a placa ficava translúcida e o resto 
ficava escuro.
Antibiograma 
É um teste pra saber a sensibilidade ao antibiótico. Só pode fazer o antibiograma com culturas puras.
Tem que isolar o microrganismo, semeia (liquido pra solido) a placa com swab e espalha pra ter um 
tapete de células. Colocamos os 4 discos na placa contendo antibióticos diferentes. Esperamos haver 
o crescimento de bactérias pra ver se aparecia o halo de inibição de crescimento, se tiver halo a 
bactéria é sensível ao antibiótico, se não tiver halo a bactéria é resistente. Eu posso olhar o halo e 
dizer que a bactéria é sensível ao antibiótico? Não, porque nada me garante que a última dose que é 
eficiente eu consigo atingir na prática clinica. 
Risco de cárie
Quais itens tenho que avaliar pra ver se o paciente tem risco de cárie: frequência de ingestão de 
carboidratos, fluxo salivar, capacidade tamponante da saliva, presença de fluoretos no ambiente 
bucal, tipo de dieta (se é rica ou pobre em carboidratos), faixa etária, CPOD (dentes cariados, 
perdidos ou obturados), etc.
PROCEDIMENTOS DE BIOSSEGURANÇA:
1) Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos na estante, na entrada do laboratório, e 
nunca sobre as bancadas de trabalho.
2) Usar jaleco adequado e limpo.
3) Não usar calçados abertos.
4) Prender os cabelos
5) Lavar as mãos com detergente antes e depois da aula prática.
6) Limpar a bancada antes do trabalho e após finalizar as análises.
7) Nunca comer, beber ou fumar no laboratório!
8) Evitar colocar a mão na boca, olhos e ouvidos durante a aula.
9) Nunca aplicar maquiagem/cosméticos ou manipular lentes de contato no laboratório
10) Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. E trabalhar na zona de segurança!
11) Transportar e manter os tubos de cultura em uma estande adequada para evitar acidentes e 
contaminações de pessoas e ambientes.
12) Nunca pipetar nada com a boca!
13) Avisar o professor em caso de contaminação acidental, ferimentos ou cortes ocorridos durante a 
aula.
14) Depositar todo o material contaminado utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando 
sobre a bancada.
TÉCNICAS ASSÉPTICAS PARA O CULTIVO DE AMOSTRAS
Inoculação
Os meios de cultura devem ser esterilizados antes do uso, geralmente o método utilizado é o calor 
em autoclave. Uma vez que um meio de cultura tenha sido preparado, este pode receber um inoculo
de uma cultura. Quando o inóculo (material colocado no meio de cultura), é colocado dentro ou 
sobre um meio (Agar), as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar produzindo uma 
colônia isolada. Mas para isto deve-se empregar técnicas assépticas para evitar a contaminação 
durante a sua manipulação. A transferência asséptica de uma cultura para outra é realizada com o 
auxilio de uma agulha de inoculação ou alça de platina, previamente esterilizada em uma chama.
Cada colônia resulta, em princípio, da multiplicação de uma só bactéria, pelo que diferentes 
espécies/géneros apresentarão colónias diferentes. Na generalidade, estas diferenças são mais 
visíveis em meios selectivos.
1. Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha de semeadura esgota-se o 
material por meio de estrias na superfície do meio.
2. Técnica da semeadura em superfície: o inóculo é espalhado na superfície do Agar com o auxílio de 
uma alça de vidro (alça de Drigalsky).
3. Método de pour-plate: uma suspensão de células é misturada com Agar fundido a 45º C, que se 
verte em uma placa de Petri. Quando o Agar se solidifica, as células são nele imobilizadas e crescem, 
formando colônias.
CULTIVO DE AERÓBIOS
Estes microrganismos requerem oxigênio para sua sobrevivência. Após a semeadura em placas ou 
tubos com meio de cultura, estes são mantidos em estufaa 37º C em presença de oxigênio do ar 
atmosférico. Sempre com as placas de petri no sentido invertido.
CULTIVO DE ANAERÓBIOS
Para o cultivo de microrganismos na ausência de oxigênio são utilizados meios reduzidos, que são 
meios de cultura com a adição de um agente redutor (ex.: tioglicolato de sódio), capaz de absorver o 
oxigênio ou gerar H2 e CO2.
Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma jarra juntamente com um 
envelope que contém substâncias químicas que geram hidrogênio e dióxido de carbono, pode ser 
utilizado também uma vela acessa. Este sistema é inadequado para o cultivo de anaeróbios estritos.