Catalise enzimatica

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Aula de Bioquímica I
Tema:
Exemplos de Mecanismos de Catálise Enzimática
Prof. Dr. Júlio César Borges
Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br
Enzimas Proteolíticas: Proteases
 Renovação de proteínas
- Reciclagem de Aminoácidos  novas proteínas
- Energia Livre a partir de aminoácidos
- Digestão
 Regulação celular
- Desenvolvimento - Coagulação sanguínea - Inflamação
 Hidrólise de ligações peptídicas
- Adição de uma molécula de água
- t1/2 para hidrólise em pH neutro  10 a 1000 anos
 Ressonância
Carbono da Carbonila é menos eletrófilo
 Menor suscetibilidade a ataque nucleófilo
SERINA-PROTEASES
 Mecanismo envolve a participação de uma Ser particularmente reativa
- Funciona como um poderoso nucleófilo para atacar o C da Carbonila da ligação peptídica
- Catálise covalente  formação de um intermediário ligado à Enzima
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina
- Cliva ligações Peptídicas do lado carboxílico de aminoácidos hidrófobos volumosos
Nomenclatura de especificidade para 
interações Proteases-substrato
Pn= posição dos radicais Amino-cidível
Pn’= posição dos radicais Carboxi-cidível
Sn= Local na enzima para o radical Amino
Sn’= Local na enzima para o radical Carboxi
Sequência substrato da Quimotripsina
Marcação covalente com DIFP
(diisopropylphosphofluoridate)
 Apenas a Ser reativa ligou ao DIFP
- 1 de 20 Ser na Quimotripsina
Estudos de Cinética enzimática
Uso de substrato cromogênico: Clivagem de uma ligação Éster libera produto amarelo
SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
 Estudos de Cinética enzimática
Stopeed-flow (fluxo interropido) 
 Reação em 2 fases
SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
 Reação em 2 fases
Reação em duas etapas
1º) Acilação  Formação de 
Acil-Enzima
2º) Desacilação  Saída do 
grupo abandonador
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina
Quimotripsinogênio  produzido no pâncreas e 
ativado no estômago  Ativação proteolítica
SERINA-PROTEASES
 Sítio ativo é formado pela  Tríade catalítica 
- Asp, His e Ser  forma rede de H-bound que reduz pKa da Ser catalítica
 Hiper-polarização da OH da Ser
- Formação de um íon alcóxido
reativo  poderoso nucleófilo
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina  Estrutura protéica
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina  Estrutura protéica
 Mecanismo envolve:
- Catálise ácido-base
- Catálise nucleofílica
+
SERINA-PROTEASES
SERINA-PROTEASES
Sistema de revezamento de cargas
SERINA-PROTEASES
 Mecanismo envolve:
- Catálise eletrostática
- Catálise por tensionamento  ajuda a formar a estrutura tetraédrica
- Intermediário tetraédrico é estabilizado pelo “Buraco Oxi-ânion”
1
Subtilisina
Carboxipeptidase II
SERINA-PROTEASES
 Tríade catalítica
- Importância foi estudada por mutagênese sítio específica
- Atividade analisada por Cinética Enzimática
Subtilisina
Mutantes S221A, H64A e D32A e Triplo Mutante  Menor atividade catalítica em 106 x
 Mantém KM constante  Afinidade E + S inalterada
 Triplo mutante é ainda 103 vezes mais ativo do que Tampão
Explicação  O mecanismo de catálise por tensionamento é mantida.
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina, Tripsina, Elastase e TEV  Evolução Divergente
 Apresentam ~ 40% de identidade na seqüência
 Estrutura terciária similar
 Mecanismo de catálise similar
 Diferem na especificidade por substratos
Superposição da 
Quimotripsina e Tripsina 
 Alta similaridade estrutural
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina, Tripsina e Elastase  Evolução Divergente
Bolsão S1
Principal fator de 
especificidade destas 
enzimas
SERINA-PROTEASES
Tripsina Bovina
- Tríade catalítica
- Substrato  Arg no bolsão
- Asp enterrado no cerne da Estrutura
- 5 Pontes dissulfeto
SERINA-PROTEASES
- Quimotripsina – Subtilisina – Carboxipeptidase
II e ClpP protease
 Sem correlação na estrutura primária e terciária
 Evolução convergente
 A Natureza parece ter descoberto de maneira 
independente o mesmo mecanismo catalítico pelo 
menos Quatro vezes
Outras PROTEASES
1- Ativação do nucleófilo 2- Polarização da lig. Peptídica
3- estabilização do intermediário tetraédrico
Cisteino-proteases
Serino-proteases
Metalo-proteases
Aspartato-proteases
INIBIDORES DE PROTEASES
 Muitos medicamentos são inibidores de proteases
Ex: Captopril: 
Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina: antihipertensivos
INIBIDORES DE PROTEASES
 Muitos medicamentos são inibidores de proteases
 Aspartato proteases
INIBIDORES DE PROTEASES
 Muitos medicamentos são inibidores de proteases
Inibidores da aspartil protease do HIV
ANIDRASE CARBÔNICA
“Tornando mais rápida uma reação rápida”
Não-catalisada  V = 1,3 x 10-1 (s-1)
Catalisada  V = 1,0 x 10+6 (s-1)
 Catálise depende da 
presença de 1 íon Zn2+, 
coordenado por 3 His, 
localizado no fundo do 
Sítio Ativo à 15 Angstrons
da superfície da enzima
ANIDRASE CARBÔNICA
Catálise por Zn2+ ocasiona a ativação de uma molécula de H2O
 Dependência da V em função do pH
- Catálise Básica
 Zn2+ reduz o pKa da H2O de 15,7 
para 7,0
- Aumento da [HO—] local mesmo em 
pH = 7,0
- Íon HO— é um nucleófilo mais 
poderoso do que a H2O
15,7
Efeito do pH na Atividade da 
Anidrase carbônica
ANIDRASE CARBÔNICA
Catálise ocorre em 4 etapas
- Catálise por Orientação - Catálise base geral
Próton liberado é captado pela His64
ANIDRASE CARBÔNICA
 Mecanismo de Catálise apoiado pelo Análogo sintético de coordenação do Zn2+
- Em pH 9,2, o complexo sintético mostra V hidratação do CO2 100 x maior
O Análogo sintético reduz o pKa da H2O = 8,7
ANIDRASE CARBÔNICA
 Regeneração da Enzima depende da liberação do próton  passo limitante
 V da hidratação do CO2
= 1,3 x 10+6 (s-1)
-1-111
1
-1-1-11 sM10sM10 é H do difusão a Se +−
+ ≤→= k
)sM(1x10M)1x10(M1x10 1-1-117-1
7-
1
1 +
−
∗=∴== k
k
kK
?
-14
1 s1x10≤k
- A liberação do H+ é fator limitante para a Velocidade da Reação
 O meio celular é tamponado!!!!  buffer com pKa = 7.0
- A Keq será = 1
ANIDRASE CARBÔNICA
A Velocidade da reação depende da presença de um tampão para receber os prótons 
liberados da H2O para formar o nucleófilo OH—
-1-19
11 sM10 a' e' limita meio do difusãoA 
+
−− kk
’.[B]kpor dada será prótons de retirada de A taxa 1
-163-1-19
1 s10)10(*)sM(10 ]'.[
+−+ == MBk
Concentração de Tampão da ordem de mM 
(1.10-3 M) são suficientes para alcançar 
Velocidades de 1.10+6 s-1
ANIDRASE CARBÔNICA
 O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima 
 Sem contato com o meio externo
 O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial
His64  “LANÇADEIRA DE PRÓTONS”
na estrutura da proteína
ANIDRASE CARBÔNICA
 O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima 
 Sem contato com o meio externo
 O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Enzimas de Restrição
 Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias
- Mecanismo de defesa contra infecção viral
Endonucleases de Restrição tipo II
Clivam dentro da seqüência de 
reconhecimento
 Grande importância na 
Engenharia Genética, Biologia 
Molecular e Biotecnologia
 Permitem a construção de 
moléculas de DNA específicas
- Clonagem de DNA
 Emprego em testes de 
paternidade
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Especificidade das Enzimas de Restrição: Altíssima
- Atuar somente na sequência de reconhecimento e NÃO devem degradar o DNA endógeno
 Reconhecemsequências específicas – Sítios de restrição
- Seqüência palindrômica = permite a mesma leitura em ambos os sentidos
 Reconhecem apenas o DNA Exógeno
 Metilases
 Enzimas específicas que modificam o DNA endógeno no mesmo sítio de reconhecimento
 Para cada Enzima de Restrição existe uma Metilase correspondente
- Enzima de Restrição + Metilase: Sistema de restrição-modificação
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Mecanismo da Hidrólise
Presença de Intermediários ligados à enzima?
Mecanismo 1  Catálise covalente
2 Passos  sem inversão da configuração do P.
Mecanismo 2  Hidrólise direta
1 Passo  Inversão da configuração do P.
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Mecanismo da Hidrólise
1 Passo  com inversão da configuração do P
 Sem intermediários reacionais
 Sem catálise covalente
 Envolve hidrólise direta 
Uso de fosfotiatos  marcador de 
estereoisomeria
EcoRV
 Dependência de Magnésio – Co-fator
- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado
1º  DNA
2º  H20
Íon Magnésio (Co-fator)
 Coordenado por 6 ligantes
- 3 H2O
- 2 Asp
- 1 O do Pi
 Ativa uma H2O para Ataque 
Nucleofílico no grupo fosfato
 Catálise por íon Metálico 
- Posicionamento
- Catálise Eletrostática
- Catálise ácido-base
Ordem de ligação à EcoRV
1º: DNA
2º: Co-fator Mg2+
3º: H20 reativa
EcoRV
 Interação EcoRV-DNA ocorre por simetria Bilateral
 Sequência de reconhecimento é uma 
sequência invertida
 Enzima dimérica age nas duas fitas do DNA
Interação EcoRV-DNA
A Enzima envolve o DNA
Metilação no DNA endógeno
EcoRV
 Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar
- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico
EcoRV
 Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar
- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico
 Distorção do DNA tem um grande custo entrópico 
que é compensado pelas interações produtivas 
com DNA específico
Catálise por tencionamento
 Distorção do DNA ajuda a posicionar o Pi
próximos aos grupos Asp reativos
EcoRV
 Complexo catalítico é montado somente após ser garantida a 
especificidade da interação Enzima-DNA  Distorção do DNA
- Reação só progride se a especificidade for garantida
- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado
A Enzima usa a Energia livre de ligação 
com o DNA para deformar o Substrato e 
preparar o complexo catalítico para a 
reação.
Mg2+  é coordenado pelo Pi a ser clivado e 
Asp posicionados próximos na conformação 
distorcida
DNA cognato = específico
DNA não-cognato = inespecífico
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO TIPO II
Sem identidade Sequencial 
Com identidade Estrutural
São proteínas homólogas  transferência gênica horizontal
O gene foi disseminado por um plasmídio após a divergência evolutiva das bactérias
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