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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA ANIMAL (ZMZ-1301) Docente: Prof. Dr. Edson Roberto da Silva Componentes do grupo: Carolina Zanetti de Paula Gabriela Lopes Miranda Marina Del Monte Micheli Midori de Cerqueira C.A. Vitória Mattos Pereira Pirassununga 2015 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1 2. CURVA DE TITULAÇÃO DA GLICINA ............................................................................ 1 2.1. Materiais e métodos ...................................................................................................... 2 2.2.Resultados ....................................................................................................................... 3 2.3. Conclusões ..................................................................................................................... 5 3. MANIPULAÇÃO DE ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS ............................................. 6 3.1. Materiais e métodos ...................................................................................................... 6 3.2.Resultados ....................................................................................................................... 8 3.3. Conclusões ................................................................................................................... 14 4. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM MEIO AQUOSO – MÉTODO DE BRADFORD ....................................................................................................................... 15 4.1. Materiais e métodos .................................................................................................... 15 4.1.1 Preparação da Curva Padrão ............................................................................. 17 4.1.2 Preparação do Branco ......................................................................................... 18 4.1.3 Preparação da Amostra ....................................................................................... 18 4.1.4 Quantificação ........................................................................................................ 18 4.2.Resultados ..................................................................................................................... 19 4.3. Conclusões ................................................................................................................... 20 5. CATALISE E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA ARGINASE DE LEISHMANIA AMAZONENSIS ................................................................................................................ 21 5.1. Materiais e métodos .................................................................................................... 21 5.2.Resultados ..................................................................................................................... 24 5.3.Conclusões .................................................................................................................... 25 6. DETERMINAÇÃO DA GLICOSE – MÉTODO ENZIMÁTICO-COLORIMÉTRICO . 26 6.1. Materiais e métodos .................................................................................................... 26 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 6.2.Resultados ..................................................................................................................... 29 6.3.Conclusões .................................................................................................................... 31 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 32 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 33 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS TABELAS TABELA 2.1: Variação de pH x NaOH TABELA 3.1: Resumo das características dos aminoácidos de interesse TABELA 4.1: Dados para curva padrão de albumina TABELA 4.2: Absorbância das amostras de fígado bovino TABELA 4.3: Resumo dos cálculos para determinar a quantidade de proteína na amostra TABELA 5.1: Preparo da reação de inibição enzimática e controles TABELA 5.2: Análise do produto (uréia) formado pela hidrólise de L-arginina TABELA 5.3: Leituras de absorbância das amostras de interesse TABELA 6.1: Diluição seriada do Padrão de Glicose TABELA 6.2: Diluição para determinação da glicose nas Amostras 1 e 2 TABELA 6.3: Leitura de Absorbância para curva padrão TABELA 6.4: Concentração de glicose nas amostras de interesse UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS FIGURAS FIGURA 3.1: Estrutura tridimensional da Hemoglobina FIGURA 3.2: Grupo heme FIGURA 3.3: Pontos de hidrogênio em α-Hélice FIGURA 3.4: Arginase L FIGURA 3.5: α-Hélice em Arginase L FIGURA 3.6: Folha β-Pregueada em Arginase L FIGURA 3.7: Pontes de hidrogênio em Folha β-Pregueada FIGURA 3.8: Distância entre aminoácidos na α-Hélice da Arginase L FIGURA 3.9: Distância entre aminoácidos na Folha β-Pregueada da Arginase L UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS GRÁFICOS GRÁFICO 2.1: Volume (NaOH) x pH GRÁFICO 2.2: Volume (NaOH) x ∆pH GRÁFICO 2.3: Volume (NaOH) x ∆2pH GRÁFICO 4.1: Curva Padrão da Albumina GRÁFICO 6.1. Curva Padrão de Glicose UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS QUADROS QUADRO 2.1: Materiais utilizados para titulação da glicina QUADRO 3.1: Download da estrutura das proteínas de interesse QUADRO 4.1: Síntese de Materiais e Métodos – Método de Bradford QUADRO 5.1: Síntese de Materiais e Métodos – Inibição Enzimática QUADRO 6.1: Procedimentos – Determinação da Glicose UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 1 1. INTRODUÇÃO Durante o primeiro semestre de 2015, foram realizados 06 experimentos práticos de maneira a complementar o estudo da disciplina de Bioquímica Animal (ZMZ-1301). Abaixo, segue a relação dos experimentos realizados: 1. Curva de titulação da glicina: determinação de pKa e efeito tampão (09/03/2015); 2. Manipulação de estrutura 3D de proteínas (16/03/2015); 3. Determinação de proteínas em meio aquoso – Método de Bradford (23/03/15) 4. Inibição enzimática (27/04/2015); 5. Determinação de Glicose - Método enzimático-colorimétrico (25/05/2015); Cabe lembrar que todos os experimentos foram supervisionados pelo do Prof.Dr. Edson Roberto da Silva. As considerações e resultados ora apresentados são baseados nas informações obtidas durante a execução dos trabalhos e em consultas bibliográficas. Este relatório descreve as atividades conduzidas, bem como detalha os métodos empregados, conclusões e recomendaçõesformuladas. 2. CURVA DE TITULAÇÃO DA GLICINA A glicina é um dos componentes que constitui os aminoácidos apolares, onde também são encontrados: alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina etriptofano. Esta substância é um aminoácido que apresenta um pKa característico, que pode ser determinado experimentalmente através da titulação com ácido ou com uma base forte. Esta constante pode ser identificada através da curva de titulação, uma vez que nestes pontos a capacidade tamponante é máxima. Titulação é uma técnica comum de laboratório em análise química quantitativa, usado para determinar a concentração de um reagente conhecido. A substância de interesse em qualquer determinação recebe o nome de analito. A espécie química com concentração definida recebe o nome de titulante, que é, em geral, uma solução obtida a partir de um padrão primário, podendo ser um sal ou uma substância gerada na solução que se deseja valorar. A solução a ter sua concentração determinada recebe o nome de titulado. O principal objetivo deste experimento foi reconhecer as modificações na estrutura de um aminoácido neutro (glicina) por efeito da variação do pH, identificando os grupos tamponantes do aminoácido glicina e os valores de pH onde eles ostentam a maior capacidade tamponante, comparando os valores obtidos de pH experimentalmente aos dados bibliográficos. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 2 Este relatório detalha os procedimentos e resultados do experimento realizado para a titulação da substância glicina. 2.1. Materiais e métodos O método consiste em reagir completamente um volume conhecido de uma amostra com um volume determinado de um reagente de natureza e concentração conhecida (solução padrão). No processo de titulação ácido-base, faz-se reagir um ácido com uma base para que se atinja o ponto de equivalência. À medida que é adicionado o titulante ao titulado, o pH da solução (titulante+titulado) vai variar, sendo possível construir um gráfico desta variação, ao qual se dá o nome de curva de titulação. O ponto de equivalência pode variar dependendo da concentração inicial do titulante e do titulado. Para a realização do experimento utilizou-se os seguintes materiais: 1. Solução de glicina a 100mM; 2. Hidróxido de sódio (NaOH) com concentração de 10M; 3. Pipeta de 100uL; 4. Béquer; 5. PHmetro marca Bell modelo W3B. O QUADRO 2.1 apresenta os materiais utilizados. QUADRO 2.1: Materiais utilizados para titulação da glicina Neste experimento, adicionou-se hidróxido de sódio à solução de glicina por meio de uma pipeta de 100μl. Ao todo, foram realizados 21 procedimentos totalizando 2.000μl de NaOH na solução de Béquer Pipeta Phmetro UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 3 glicina. O procedimento consistiu em realizar a medição de pH da solução de glicina, utilizando-se pHmetro eletrônico. A cada adição de NaOH, o pH foi novamente medido, de maneira a construir uma curva de variação. Salienta-se que não houve controle de temperatura ambiente durante o experimento. 2.2.Resultados Os resultados obtidos no experimento do sistema tampão são apresentados na TABELA 2.1. Note que o pH variou de 6,86 (glicina pura) a 11,63 (2.000ul de glicina), o que significa que passou de um pH aproximadamente neutro para básico, demonstrando a ionização do NaOH. TABELA 2.1: Variação de pH x NaOH V(uL) NaOH pH ∆pH1 ∆pH2 0 6,86 - - 100 9,41 2,55 - 200 9,40 0,01 2,54 300 9,42 0,02 0,01 400 9,44 0,02 0,00 pKa 500 9,49 0,05 0,03 600 9,59 0,10 0,05 700 9,65 0,06 0,04 800 9,82 0,17 0,11 900 9,99 0,17 0,00 1.000 10,30 0,31 0,14 1.100 10,74 0,44 0,13 1.200 10,95 0,21 0,23 1.300 11,14 0,19 0,02 1.400 11,24 0,10 0,09 1.500 11,34 0,10 0,00 1.600 11,42 0,08 0,02 1.700 11,49 0,07 0,01 1.800 11,54 0,05 0,02 1.900 11,58 0,04 0,01 2.000 11,63 0,05 0,01 Com base na variação do pH calculada na terceira e quarta coluna da tabela pode-se inferir que o pka do grupo amina da glicina para o experimento foi de 9,44, compatível com o verificado na literatura (9,6). De maneira a melhor entender o comportamento da curva de titulação da glicina foram confeccionados os GRÁFICOS 2.1, 2.2 e 2.3, ressaltando-se que as variações calculadas no ApH1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 4 e ApH2, são apresentados em módulo. GRÁFICO 2.1: Volume (NaOH) x pH 9,41 9,44 10,74 0 2 4 6 8 10 12 14 0 500 1.000 1.500 2.000 pH Volume de NaOH (uL) V(NaOH) x pH Conforme verifica-se, a adição das primeiras 100 µL de hidróxido de sódio foi suficiente para elevar em 2,55 o pH, transformando uma solução com tendência neutra (6,86) em uma solução básica (9,41), sendo este o primeiro pico verificado no gráfico. O segundo pico, menos proeminente, ocorre quando o montante de base adicionada totaliza 1.100 μL , elevando o pH para 10,74. Neste contexto, verifica-se que o valor do pKa encontrado está em uma zona de crescente mínimo ou nulo. 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 0 200 400 600 800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 ∆ pH Volume de NaOH (uL) GRÁFICO 2.2: V(NaOH) x ∆pH 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 0 200 400 600 800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 ∆ 2 p H Volume de NaOH (uL) GRÁFICO 2.3:V(NaOH) x ∆²pH Os GRÁFICOS 2.2 e 2.3 são muito semelhantes, comprovando que as maiores variações ocorreram com a adição de 100µL de hidróxido de sódio à solução de glicina. Ambos gráficos ainda confirmam um segundo pico entre o volume de 1.000 e 1.220 μl da solução básica. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 5 Note que os gráficos diferem apenas em relação ao eixo Y, ou seja, verifica-se que o GRÁFICO 2.3 está deslocado um pouco mais para “baixo” que o GRÁFICO 2.2 no segundo pico. 2.3. Conclusões De acordo com Lehninger, os pKas da glicina são: pKa1 igual a 2,34 e o pKa2 igual a 9,60. Conforme verificou-se, uma vez que o experimento iniciou-se com pH igual a 6,86, o primeiro pka não pode ser definido. Em relação ao pKa2, no experimento obteve-se valor igual a 9,44, sendo este inferior ao dado bibliográfico, entretanto, uma vez que tal alteração foi inferior a 2%, considera-se que o experimento foi satisfatório para obtenção do pKa na reação. Ressaltando-se que tais variações podem ocorrer em virtude de alterações das concentrações de íons na solução ou mesmo em decorrência da sensibilidade do sensor do pHmetro. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 6 3. MANIPULAÇÃO DE ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS Proteínas são formadas a partir de três ou quatro estruturações, sendo que considera-se a estrutura secundária como sendo tridimensional. Dentre os métodos mais conhecidos para caracterização das estruturas, pode-se mencionar a cristalografia por difração de raio-x, espectroscopia de RMN e modelagem molecular comparativa. Atualmente, existem bancos de dados nos quais são disponibilizadas as estruturas tridimensionais de diversas moléculas, as quais, ao serem trabalhadas em softwares específicos ampliam os conhecimentos do aluno, permitindo que seja possível localizar e entender como se relacionam os diversos componentes das moléculas de interesse (pontes de hidrogênio, pontes de sulfeto, estruturas primárias,secundárias, grupos funcionais, entre outros). O objetivo deste experimento foi colocar o aluno em contato com as principais ferramentas para compreensão de estruturas tridimensionais e, se familiarizar com a plataforma do software USF CHIMERA e principais ferramentas de busca. 3.1. Materiais e métodos De acordo com o roteiro da aula prática, pode-se dividir o experimento em duas partes. A primeira envolvia a pesquisa de estruturas de compostos químicos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina e prolina) em site indicado (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Nesta etapa, os compostos foram pesquisados e planilhados. Na segunda parte do experimento, as estruturas tridimensionais da hemoglobina de Canis familiares e arginase de Leihmania deveriam ser estudas com auxílio do programa USF CHIMERA, um programa para visualização interativa e analises de estruturas moleculares presentes em um banco de dados. Nesta etapa, foi realizado o download das proteínas em banco de dados especifico (http://www.rcsb.org/pdb) e em formato PDB File text, conforme mostrado no QUADRO 3.1. Utilizando o programa CHIMERA observou-se o grupo heme ligado à estrutura proteica. Para melhor visualização ocultou-se as formas em hélice representadas pelo formato Ribbo, prosseguindo com as seguintes etapas: 1. Selecionou-se o grupo heme; 2. Inverteu-se a seleção; 3. Ocultou-se as hélices da estrutura secundária; 4. . Explorou-se a estrutura do grupo heme da hemoglobina localizando o íon ferro. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 7 QUADRO 3.1: Download da estrutura das proteínas de interesse UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 8 3.2.Resultados Para a apresentação da primeira parte do experimento optou-se por montar a TABELA 3.1. TABELA 3.1: Resumo das características dos aminoácidos de interesse COMPOSTO CAS NUMBER FÓRMULA MOLECULAR DESCRIÇÃO pKa ESTRUTURA 3D GLICINA 56-40-6 C2H5NO2 Aminoácido não essencial, encontrado em gelatinas. Muito conhecido por ser um inibidor de neurotransmissores. pka1:2,37 pKa2: 9,6 ALANINIA 56-41-7 C3H7NO2 Aminoácido não essencial abundante no plasma, está envolvido no metabolismo do açúcar, fornecendo energia aos tecidos. Além disso tem a função de melhorar o sistema imune. pka1:2,4 pKa2: 9,69 VALINA 72-18-4 C5H11NO2 Aminoácido essencial funcionando como estimulante. Promove o crescimento muscular e a reparação de tecidos. pka: 2,3 LEUCINA 61-90-5 C6H13NO2 Aminoácido essencial e importante para formação da hemoglobina. pka1:2,36 pKa2: 9,63 ISOLEUCINA 73-32-5 C6H13NO2 Isomero da leucina importante na formação da hemoglobina, bem como na regulação da glicemia sanguinea. pka1:2,36 pKa2: 9,68 METIONINA 63-68-3 C5H11NO2S Aminoácido essencial contendo enxofre e importante em diversas funções do organismo. pka1:2,28 pKa2: 9,21 PROLINA 344-25-2 C5H9NO2 Aminoácido não essencial presente no colágeno. pka1:1,99 pKa2: 10,6 Conforme verifica-se, valina, leucina, isoleucina e metionina são aminoácidos essências, enquanto que glicina, alanina e prolina não são. Além disso, o que se observa é que os aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina possuem seus valores de pka bem semelhantes. Note ainda que, com exceção da prolina, todos os demais aminoácidos possuem cadeia aberta, podendo ou não ser ramificada. A segunda parte do experimento, o qual usou os dados do Chimera, os resultados serão discutidos em dois tópicos: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 9 Hemoglobina A hemoglobina é uma proteína globular, de estrutura quaternária, que contém 4 cadeias polipep- tídicas (cadeias de globina) e um grupo heme ligado a cada uma das cadeias de globina. A função da hemoglobina é absorver e transportar oxigênio no sangue e liberá-lo no tecido. Isso ocorre gra- ças à capacidade de seus átomos de ferro se ligarem com o oxigênio, reversivelmente. De maneira geral, considera-se como sendo formada por duas cadeias de globina do tipo alfa e duas cadeias de globina do tipo beta, sendo assim um tetrâmero de cadeias. Isso faz que haja diferentes combinações entre essas cadeias, determinando os 6 tipos de hemoglobinas produzidas na fase pré-embrionária e pós nascimento. A cada fase de desenvolvimento a síntese de hemoglobina vai se adaptando às mudanças sofridas pelo corpo. Segundo as imagens obtidas pelo programa CHIMERA foi possível visualizar a estrutura da Hemoglobina em diferentes graus de aprofundamento. De acordo com a FIGURA 3.1, é possível verificar as estruturas secundárias de α-Hélice, cujo formato em espiral contribui para o modelo compactado característico da Hemoglobina. Além dessas estruturas secundárias verificam-se também os quatro grupos Hemes, distribuídos um por cadeia peptídica, inferindo-se que a Hemoglobina possui quatro cadeias peptídicas-α1, α2, β1 e β2, ou seja, possui estrutura quaternária. FIGURA 3.1: Estrutura tridimensional da Hemoglobina Os grupos hemes da hemoglobina podem ser visualizados na FIGURA 3.2. Cada grupo é constituído por uma molécula de Porfina, cujo interior apresenta um átomo de Ferro (bolinha vermelha ao centro dos grupos), transportado até o grupo heme pela ferritina. Através de receptores específicos, o complexo ferro-transferrina liga-se a membrana da hemácia. A membrana então se invagina em alguns pontos, formando algumas vesículas com o ferro que penetrou e se desligou da transferrina, que por sua vez volta ao plasma sem o ferro para poder UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 10 transportar outro átomo de ferro. O oxigênio fica preso entre o Fe2+ e o anel imidazólico de Histidina distal, sendo responsável pela atração e retenção de O2 pela Hemoglobina Cada grupo Heme é capaz de transportar uma molécula de oxigênio molecular (O2), assim cada proteína Hemoglobina transporta quatro moléculas de O2. Tal arranjo possibilita um transporte muito eficiente de oxigênio, o que justifica o fato de serem abundantemente encontrados nos Eritrócitos (células anucleadas do sangue, responsáveis pelo transporte de oxigênio dos pulmões aos tecidos nos organismos mais desenvolvidos). FIGURA 3.2: Grupo heme Conforme já mencionado, a estrutura α-Hélice, é a estrutura secundaria verificada na Hemoglobina. De acordo com FIGURA 3.3, tal estrutura é caracterizado pelo seu formato espiral, sendo que, examinado mais profundamente, é possível assinalar as pontes de hidrogênio (feitas entre os grupos aminos e carboxilas dos aminoácidos) que se encontram dispostas paralelamente em relação ao eixo da estrutura secundária α-Hélice. FIGURA 3.3: Pontos de hidrogênio em α-Hélice Cabe lembrar que defeitos ocasionados na sintese da hemoglobina são estremamente Grupos Heme Grupos Heme Ferro UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 11 prejudiciais ao organismo, acarretando doenças. As doençasda hemoglobina podem ser divididas em dois tipos de alteração: quantitativas e qualitativas. As alterações quantitativas (talassemias) são doenças em que há diminuição da sintese de hemoglobina, devido a maior produção de determinado tipo de globina. Já as alterações qualitativas ocorrem devido a mutações genicas pontuais, sendo responsavel pela produção de hemoglobinas anormais, por exemplo, Hb-S. As hemoglobinas S apresentam aminoacido valina ao invés de glutamina e, é responsavel por uma doença denominada drepanocitose, na qual as hemaceas adquirem forma de foice (anemia falsiforme) . Arginase L A arginase é uma metaloenzima contendo manganês e presente em mamíferos e protozoários, estando envolvida no ciclo da uréia. Ela catalisa a hidrolise da L-arginina em L-ornitina e ureia e compete com a oxido nítrico sintase (NOS II) pelo mesmo substrato. Além da síntese da ureia, essa proteína também tem propriedades de vasodilatação. Essa proteína apresenta-se sob duas isoformas: arginase1(hepática) e arginase 2 (presente em tecidos extra-hepáticos e mitocôndria). A Arginase L (FIGURA 3.4), responsável por catalisar o 15º e último passo do ciclo da uréia nos mamíferos, é formada por dois tipos de estruturas secundárias: a α-Hélice e a Folha β-Pregueada. FIGURA 3.4: Arginase L De maneira a melhor compreender as diferentes estruturas, detalhou-se a α-Hélice (FIGURA 3.5) e a Folha β-Pregueada (FIGURA 3.6). Conforme já mencionado, a estrutura da α-Hélice é formada por pontes de hidrogênio formadas com grupo amina e carbonila. A estrutura helicoidal permite uma utilização mais eficiente de pontes de hidrogênio interna, o que faz com que essa conformação seja a mais abundante. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 12 Apesar disso, nem todos os polipeptideos podem formar α-Hélice estável, isso porque a cadeia lateral dos aminoácidos (grupo R) pode influenciar na estabilidade. De modo geral, se uma cadeia de polipeptídio apresentar muitos resíduos de lisina e/ou arginina, próximos uns dos outros, os grupos R, positivamente carregados, tenderão a se repelirem, impedindo a estabilidade da estrutura. FIGURA 3.5: α-Hélice em Arginase L FIGURA 3.6: Folha β-Pregueada em Arginase L Na Folha β-Pregueada as pontes de hidrogênio são estabelecidas entre átomos da mesma molécula (intracadeia) ou entre cadeias polipeptídicas diferentes (intercadeia). Neste caso, a estrutura formada lembra uma folha de papel dobrada em zigue-zague. Conforme FIGURA 3.7, as ligações de hidrogênio são perpendiculares ao eixo da estrutura Folha β-Pregueada e ocorre entre cadeias polipeptídicas diferentes, formando-se uma estrutura mais distendida que a α-Hélice. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 13 FIGURA 3.7: Pontes de hidrogênio em Folha β-Pregueada De maneira a melhor caracterizar as diferenças nos diversos tipos de estrutura da arginase, foram feitas as FIGURAS 3.8 e 3.9, as quais esquematizam a distância das pontes de hidrogênio formadas entre os aminoácidos nas cadeias de interesse. Note que, na α-Hélice da Arginase, a ligação de hidrogênio feita entre as unidades pepdíticas da estrutura dista 4.A, enquanto que na Folha β-Pregueada tal distância é de 90.A. FIGURA 3.8: Distância entre aminoácidos na α-Hélice da Arginase L UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 14 FIGURA 3.9: Distância entre aminoácidos na Folha β-Pregueada da Arginase L 3.3. Conclusões Com base neste estudo e na manipulação da estrutura tridimensional de proteínas verificou-se que as interações entre peptídeos são fundamentais na exibição da forma final das proteínas, sendo que, pequenas alterações podem, não somente modificar a forma como também a função das proteínas. A distância entre os aminoácidos que fazem a ligação de hidrogênio delimita a estrutura secundária da proteína. Neste caso, percebeu-se pequenas distâncias entre as pontes de hidrogênio foram responsáveis pela formação de estrutura helicoidal (α-Hélice), enquanto que distâncias maiores configuram a estrutura da folha β-pregueada. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 15 4. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM MEIO AQUOSO – MÉTODO DE BRADFORD O método de Bradford11 é uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de “Coomassie brilliant blue” BG-250, sendo considerado um método de espectrofotometria. Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm. O principal objetivo deste experimento foi estabelecer o teor de proteínas solúveis em meio aquoso a partir do preparado de amostra contendo fígado bovino cru. Uma vez que proteínas desempenham um papel extremamente importante em processos biológicos (atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores, entre outros), a metodologia para a determinação de proteínas totais é de grande interesse para profissionais ligados tanto à área de indústria alimentícia/nutrição como em laboratórios de análises químicas. 4.1. Materiais e métodos Para determinação de proteínas solúveis em meio aquoso através do Método de Bradford, foram utilizados os seguintes materiais: 1. Balança; 2. 2,5 g de fígado bovino; 3. Solução Tampão TE (100mM Tris;EDTA 2 mM ph 7,4); 4. Solução de Albumina (0,1mg/mL); 5. Solução de Bradford; 6. Homogeneizador (liquidificador); 7. Uma (01) Pipeta; 8. Provetas; 9. Centrífuga; 10. Cinco (05) tubos de ensaio; 11. Cinco (05) microtubos do tipo “Eppendorf”; 12. Espectrofotômetro Femto – Cirrus 80MB. O QUADRO 4.1 apresenta registro fotográfico dos materiais utilizados. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 16 QUADRO 4.1: Síntese de Materiais e Métodos – Método de Bradford Liquidificador e pipeta para processamento da amostra Centrifugação do preparado de fígado bovino Sobrenadante da amostra preparada UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 17 A seguir são apresentados os métodos utilizados no desenvolvimento do experimento. 4.1.1 Preparação da Curva Padrão No preparo da curva padrão de albumina, foi realizado uma diluição seriada. Neste caso, utilizou-se 04 microtubos (P1 a P4). Em P1 adicionou-se 400 µL de albumina a 0,1mg/mL. Nos demais microtuboulos foram adicionados 200 UL de solução tampão. Em todos os tubos adicionou- se 1ml da solução de Bradford. O P1 foi adicionado ao P2, posteriormente ao P3 e P4, resultado na solução padrão desejada. Tal procedimento é esquematizado abaixo. Cabe lembrar que foram utilizadas ponteiras limpas para cada diluição de maneira a controlar a UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 18 representatividade do experimento, evitando-se contaminação cruzada. 4.1.2 Preparação do Branco O branco do experimento foi preparado utilizando-se 1mL da solução de Bradford a 100μl de água. 4.1.3 Preparação da Amostra No preparo da amostraforam pesados 2,5g de fígado bovino, o qual foi transferido para uma proveta, onde adicionou-se 250 ml de solução tampão. A mistura foi transferida para o liquidificador, onde permaneceu até que seu conteúdo estivesse suficientemente homogêneo. Posteriormente, foram pipetadas 5ml de preparado que foram dispostos em tubos de ensaio e, acondicionados na centrifuga. O preparado permaneceu na centrifuga por 15 minutos a uma rotação de 4.000 rpm. Esse procedimento foi realizado pelos monitores do laboratório, que entregaram aos alunos apenas o prepara pronto. Para o experimento utilizou-se o sobrenadante da amostra preparada, a qual sofreu diluição seriada. Para diluição seriada utilizou-se 04 tubos de ensaio (A1 a A4). No tubo A1 adicionou-se 2ml de sobrenadante da solução de fígado bovino e, nos demais tubos (A1 a A4) adicionou-se 1 ml de solução tampão em cada. Em todos os tubos foi adicionado 1ml da solução de Bradford. O conteúdo do A1 (1ml) foi transferido para o A2 e homogeneizado. A mistura de A2, foi adicionada a A3 e posteriormente em A4, resultado em uma solução 8 vezes mais diluída do que o preparo inicial. Cabe lembrar que não houve controle de temperatura ambiente durante o experimento. 4.1.4 Quantificação Para quantificação das amostras utilizou-se um espectrofotômetro (Femto – Cirrus 80MB). O conteúdo dos tubos referente à curva padrão (P1 a P4), branco e amostras (A1 a A4) foram transferidos para cubetas próprias para posicionamento no espectrofotômetro, garantindo-se que o frasco não tivesse qualquer tipo de interferência (impressões digitais, sujeira, gotículas). Para este experimento utilizou-se o comprimento de onda padrão de 595 nm. A leitura no espectrofotômetro, iniciou-se com o branco, o qual apresentou leitura zero de absorbância. Tal procedimento foi repetido para todos os tubos (A1 a A4 e P1 a P4), sendo anotadas as suas leituras de absorbância. Os resultados da curva padrão de albumina (P1 a P4) foram plotados em planilha Excel para confecção da curva padrão, a partir da qual pode-se definir uma função e coeficiente linear da reta, dados essenciais para calcular a concentração de proteína da amostra. O cálculo da concentração de proteína (C) foi realizado utilizando-se a seguinte fórmula: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 19 C= Absorbância___ Coeficiente linear 4.2.Resultados A TABELA 4.1 apresenta a compilação dos dados obtidos para confecção da curva padrão de albumina. TABELA 4.1: Dados para curva padrão de albumina AMOSTRA CONCENTRAÇÃO (mg/mL) ABS P1 0,1000 0,400 P2 0,0500 0,226 P3 0,0250 0,106 P4 0,0125 0,060 Note que a concentração de albumina variou de 0,1 mg/L (P1) a 0,0125 mg/l (P4), sendo que nestas faixas de concentração a absorbância variou de 0,4 a 0,06, respectivamente. A partir destes dados confeccionou-se o GRÁFICO 4.1, o qual apresenta a curva padrão do experimento. GRÁFICO 4.1: Curva Padrão da Albumina y = 4,1186x R² = 0,991 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 A b so rb ân ci a Concentração de Albumina (mg/ml) Curva de Calibração (albumina) Conforme verifica-se, a curva padrão da albumina é uma reta crescente que estabelece uma função de primeiro grau (y=4,118x) com coeficiente linear igual a 0,991, tais dados serão usados a seguir para definição da porcentagem de proteína da amostra de fígado bovino. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 20 A TABELA 4.2 apresenta as leituras de absorbância das amostras de fígado bovino. TABELA 4.2: Absorbância das amostras de fígado bovino AMOSTRA ABS A1 0,740 A2 0,608 A3 0,493 A4 0,304 Uma vez que ocorreu a diluição seriada da amostra bovina, considera-se que a amostra tenha sido diluída 8 vezes, sendo assim os dados de interesse (A4) deverão ser multiplicados por 8 para dar prosseguimento aos cálculos. A TABELA 4.3 apresenta o resumo dos cálculos realizados, note que, de acordo com os dados, 1g de bife de fígado bovino apresentam 5,9g de proteínas solúveis. TABELA 4.3: Resumo dos cálculos para determinar a quantidade de proteína na amostra X = quantidade de proteina bovina na amostra y = 8 vezes a absorbância de A4 A4=0,304 Logo, em 1g de figado de boi esta presente 59 mg de proteina. como foram homogenizados 2,5 g de proteina em 250 ml, conclui-se que existe 147,5 mg de proteina no preparado.0,590X (mg/mL)= CALCULO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEINA NA AMOSTRA DE FIGADO BOVINO (2,5g) y = 4,1186XEquação Padrão: 4.3. Conclusões De acordo com a TABELA Brasileira de Composição de Alimentos (TACO), em cada 100 g de bife de fígado bovino cru são esperadas aproximadamente 20,7 g de proteínas totais. Conforme cálculos realizados, neste experimento, em 100g de fígado bovino cru seriam encontrados 5,9g de proteínas solúveis em meio aquoso. Isso significa cada 100g de fígado bovino possui 28,5% de proteínas solúveis em meio aquoso e 71,5% de proteínas insolúveis. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 21 5. CATALISE E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA ARGINASE DE LEISHMANIA AMAZONENSIS Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catalise, reduzindo a velocidade ou paralisando reações enzimáticas. As enzimas catalisam praticamente todos os processos celulares, por isso os inibidores enzimáticos estão entre os mais importantes agentes farmacêuticos conhecidos. A arginase (L-arginina aminohidrolase) é uma metaloenzima que catalisa a hidrólise de L-arginina em L-ornitina e ureia (KREBS & HENSELEIT, 1932), estando presente em grandes quantidades no fígado de mamíferos e, em pequenas quantidades em animais uricotélicos (aves e répteis), plantas, protozoários e bactérias (HELLERMAN & PERKINS, 1935; HIRSCH-KOLB et al., 1971). A arginase hepática é a enzima-chave do ciclo da uréia, uma via metabólica essencial para a remoção de amônia, uma base altamente tóxica resultante da degradação de proteínas (HERZFELD & RAPER, 1976). A quercetina (3,5,7,3’- 4’-pentahidroxi flavona), um flavonóide obtido por meio de dieta alimentar, atua inibindo a arginase, favorecendo maiores concentrações de L-arginina no organismo, as quais propiciam melhora nas funções associadas com a ativação dos macrofágos. Entre fatores que influenciam a atividade catalítica da arginase estão o pH e a natureza do metal bivalente de ativação. A curva de pH da enzima é uma função particular do metal ativador. Diferentes curvas de pH são obtidas com Mn2+ e Co2+ como ativadores (MOHAMED, 1950). Nos tecidos onde o ciclo da uréia é incompleto, a arginase regula a concentração de L-arginina e L-ornitina disponível para reações de biossíntese, entre elas a biossíntese de poliaminas, fundamentais para proliferação de células e tecidos. O objetivo deste experimento foi determinar a porcentagem de inibição da arginase, proveniente da Leishmania amazonenses, na presença de quercetina. A metodologia, resultados e conclusões são apresentados abaixo. 5.1. Materiais e métodos Para realização deste experimento foram utilizados os seguintes materiais: 1. Enzima Arginase recombinante de Leishmania amazonensis; 2. Quercetina 100 µM; 3. Arginina 500 mM (ph 9,5); 4. Reagente R1 (Uréia Enzimática) 5. Reagente R2 (Urease e Tampão Fosfato); 6. Micropipeta; 7. Equipamento para banho maria (marca Quimis); 8. 5 (cinco) tubos de ensaio; UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 229. 3 (três) microtubos; 10. Espectrofotômetro (Femto – Cirrus 80MB). Os 3 microtubos de ensaio foram nomeados: CN (Controle Negativo), CP (Controle Positivo) e TI (Teste de Inibição), sendo posteriormente preparados de acordo com a TABELA 5.1. TABELA 5.1: Preparo da reação de inibição enzimática e controles Tubo Água (µL) L-arginina 500mM (µL) Quercetina (µL) Arginase (µL) CN (controle Negativo) 410 100 0 0 CP (Controle Positivo) 400 100 0 10 TI (Teste de Inibição) 300 100 100 10 Todos os microtubos foram incubados em equipamento de banho maria por 15 minutos (temperatura de 37°C). Durante o tempo de incubação, foram pipetadas 1.000 µL do Reagente R1 em 05 tubos de ensaio (T1 a T5), sendo que nestes tubos foram preparadas amostras conforme apresentado na TABELA 5.2. TABELA 5.2: Análise do produto (uréia) formado pela hidrólise de L-arginina Tubo R1 (µL) Amostra T1 10 µL do Tubo de CN T2 10 µL do Tubo de CP T3 10 µL do Tubo de TI T4 10 µL de Uréia T5 10 µL de de Uréria Padrão 1.000 Os preparos T1 a T5 foram incubados por 10 minutos (a 37ºC). Após incubação, adicionou-se 1.000 µL de reagente R2 em todos os tubos, os quais foram novamente incubados por outros 10 minutos. O preparo foi transferido para cubetas apropriadas para leitura utilizando-se o espectrofotômetro. O experimento deveria ter sido zerado com a amostra T1, entretanto, como a coloração de T1 não foi padrão, utilizou-se a amostra T4 para zerar o espectrofotômetro, sendo que posteriormente, prosseguiu-se com a leitura nos demais tubos (T2 a T5). O cálculo da concentração do inibidor e o percentual de inibição foi realizado com base na seguinte equação: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 23 Inibição (%): 100 – A (TI) * 100 A (CP) Onde A representa a absorbância. Cabe lembrar que devido aos procedimentos realizados, A (TI) refere-se a leitura da amostra T3, enquanto que a A (CP), equivale a absorbância da amostra T2. Além disso, salienta-se que em pH alcalino e na presença de Salicilato e Hipoclorito de Sódio, a Amônia origina um composto esverdeado, cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de Uréia na amostra analisada. O QUADRO 5.1 apresenta as principais imagens relacionadas ao procedimento do experimento. QUADRO 5.1: Síntese de Materiais e Métodos – Inibição Enzimática Materiais básicos utilizados: micropipetas, reagente (R1 e R2) e microtubos UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 24 Materiais básicos utilizados: equipamento de banho-maria 5.2.Resultados Abaixo são apresentadas síntese de linhas de raciocínio que serão utilizadas para compreensão dos resultados do experimento: Tal como pode ser verificado na TABELA 5.3, as leituras de absorbância variaram de 0 nm (T4) a 1,782 nm (T2), sendo que a amostra T4 pode ser interpretada como controle. (1) L-arginina → L-ornitina + Uréia (em presença de Arginase); (2) Uréia → Amônia + CO2 + Oh- (em presença de Urease); (3) Quercetina inibe Arginase. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 25 TABELA 5.3: Leituras de Absorbância das amostras de interesse Tubo CONTEUDO Absorbância (nm) T1 R1 (Uréia = 70mg/dl) + Água + L-arginina + R2 (Urease) 0,435 T2 R1 (Uréia = 70mg/dl) + Água + L-arginina + Arginase + R2 (Urease) 1,782 T3 R1 (Uréia = 70mg/dl) + Água + L-arginina + Quercitina + Arginase + R2 (Urease) 0,317 T4 R1 (Uréia = 70mg/dl) + R2 (Urease) 0,000 T5 Uréria Padrão + R1 (Uréia = 70mg/dl) + R2 (Urease) 0,643 Note que o conteúdo de T2 e T3 variaram apenas quanto a presença de quercetina, entretanto, a leitura de absorbância no tubo com quercetina (T3) foi inferior ao tubo sem o composto (T2). Uma vez que tanto a coloração como a absorbância dos preparos estavam diretamente relacionados à presença de amônia, os resultados demonstram que em presença de quercetina há menos produção de amônia, pois a quercetina inibe a arginase e, sem esta enzima, não ocorre a reação (1) e (2), consequentemente a disponibilidade de amônia (composto envolvido na coloração da reação) é afetada. Com base nestes resultados, e utilizando-se a equação já apresentada no subitem 5.1 “Materiais e Métodos”, verificou-se que em presença de quercetina e nas condições descritas, a Arginase é inibida em aproximadamente 82,2%. 5.3. Conclusões No experimento realizado, demonstrou-se que a presença de quercetina inibe a arginase, sendo assim, apesar de haver reagentes nos frascos, as transformações L-arginina → L-ornitina + Uréia e Uréia → Amônia + CO2 + Oh- são afetadas (inibidas). A produção de amônia verificada no tubo T3 e que forneceu 0,317 nm de absorbância, poderia estar relacionada a transformação da Ureia (Reagente 1) em Amônia pela ação da Urease pois a presença de quercetina não afeta a Urease. Outra possibilidade é que tal valor seja correspondente às reações catalisadas pelos quase 18% de arginase que não teriam sido inibidos pela quercetina. Uma vez que nas condições descritas, a quercetina foi capaz de inibir pouco mais de 82% de arginase, considera-se a quertcina um inibidor enzimático eficaz da arginase. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 26 6. DETERMINAÇÃO DA GLICOSE – MÉTODO ENZIMÁTICO-COLORIMÉTRICO A glicose é um monossacarídeo amplamente encontrado na natureza, composto por 6 carbonos, podendo associar-se a determinadas moléculas, para formar outros compostos complexos (glicolipídídicos e glicoproteicos). Sua principal função é o fornecimento de energia para o corpo participando nas vias metabólicas (glicólise, ciclo de Krebs), sendo que em combinação com outras moléculas também assume funções estruturais (glicoproteínas de membrana). Neste experimento, a determinação da concentração de glicose foi realizada através do método enzimático-colorimétrico. Neste caso o peróxido de hidrogênio, em presença de Peroxidade (POD) reage com a 4-amoniantipirina e fenol, formando um cromógeno vermelho cereja cuja intensidade de cor é proporcional à concentração de glicose. Abaixo é apresentada a reação geral: Estudos clínicos comprovam que a quantidade de glicose circulante no sangue altera o metabolismo podendo levar a quadros de hipoglicemia, hiperglicemia, entre outros. Por esse motivo, o presente experimento teve como objetivo determinar a concentração de glicose visto sua importância principalmente para a avaliação de quadros clínicos. 6.1. Materiais e métodos Para determinação da glicose através do método enzimático-colorimétrico foram utilizados os seguintes materiais: 1. Micropipeta; 2. Quatro tubos de ensaio; 3. Água; 4. Padrão de Glicose; 5. Amostra 1 e 2; 6. Reagente de Trabalho (fenol aminoantipirina) 7. Equipamento para banho maria (marca Quimis); 8. Espectrofotômetro (Femto – Cirrus 80MB). As amostras 1 e 2 são preparos de glicose, cujas concentrações foram alvo deste experimento. Inicialmente foi obtido uma curva padrão de glicose, a qual foi compara com as Amostras 1 e 2. O experimento foi dividido em três procedimentos, conforme descrito abaixo: Glicose +O2+H2O → Ácido Glucônico + H2O2 → Fenol Aminoantipirina → composto colorido UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 27 Procedimento 1: Preparo da Curva Padrão Os tubos de ensaio foram nomeados (P1 a P4) para posterior realização da diluição seriadado Padrão de Glicose, conforme apresentado na TABELA 6.1. TABELA 6.1: Diluição seriada do Padrão de Glicose TUBO ÁGUA (μL) PADRÃO GLICOSE 100 mg/dl P1 - 40 μL P2 20 20 μL de P1 P3 20 20 μL de P2 P4 20 20 μL de P3* * Obs: depois de homogeneizado, foi descartadi 20 μL do tubo P4 Após diluição, foram adicionados 2mL de Reagente de Trabalho aos tubos (P1 a P4) os quais foram homogeneizados e incubados por 10 minutos a 37°C em equipamento de banho maria. Procedimento 2: Preparo da Reação para Determinação da Glicose Foram pipetadas 2mL de reagente de Trabalho aos tubos de Branco, Padrão, Amostra 1 e 2, conforme sintetizado na TABELA 6.2: TABELA 6.2: Diluição para determinação da glicose nas Amostras 1 e 2 TUBO REAGENTE DE TRABALHO (mL) PADRÃO GLICOSE 100 mg/dl AMOSTRA 1 AMOSTRA 2 B (Branco) 2 - - - P (Padrão) 2 20 μL - - A1 (Amostra 1) 2 - 20 μL - A2 (Amostra 2) 2 - - 20 μL Após o preparo, as amostras foram homogeneizadas e incubadas por 10 minutos a 37°C em equipamento de banho maria. Procedimento 3: Análise das Amostras e Curva Padrão A análise das amostras e da curva padrão foram realizadas com espectrofotômetro utilizando comprimento de onda de 505 nm. O aparelho foi zerado utilizando-se o Branco e, posteriormente foi realizada a medição da curva padrão e das amostras. O cálculo do fator de calibração foi realizado primeiramente com base na equação de Lambert-Beer: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 28 Glicose (mg/dl)= absorbância da amostra x 100 Absorbância do padrão Posteriormente, as leituras de absorbância foram planilhadas em Excell para montagem da curva padrão. Com base na curva, foi obtida a equação da reta, a partir da qual, também pode-se calcular as concentrações de glicose para comparação com os valores obtidos pelo método de Lambert-Beer. O QUADRO 6.1 apresenta os principais aspectos dos procedimentos realizados. QUADRO 6.1: Procedimentos – Determinação da Glicose Equipamento de banho-maria Espectrofotômetro (Femto – Cirrus 80MB) UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 29 Padrão preparado (P1 a P4) Amostras preparadas 6.2.Resultados Conforme se verificou na TABELA 6.3, os valores de absorbância (ABS) variaram entre 0,057 nm (P4) a 0,403 nm (P1), sendo que a leitura de ABS da amostra de Branco confirmou que os resultados estão dentro do padrão de aceitabilidade, uma vez que apresentou valor nulo tal qual esperado. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 30 TABELA 6.3: Leitura de Absorbância para curva padrão AMOSTRA ABSORBÂNCIA (nm) GLICOSE (mg/dl) P1 0,403 100,00 P2 0,184 50,00 P3 0,056 25,00 P4 0,057 12,50 B (Branco) 0,000 0,00 P (Padrão) 0,377 100,00 Com base nestes dados, dados confeccionou-se o GRÁFICO 6.1, no qual verificou-se a configuração de uma reta linear crescente cuja equação traduz-se em y = 0,0039x, com coeficiente linear (R²) igual a 0,9741, denotando forte correlação entre os pontos da reta. GRÁFICO 6.1. Curva Padrão de Glicose y = 0,0039x R² = 0,9741 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0 20 40 60 80 100 120 Ab so rb ân ci a (nm ) Glicose (mg/dl) A equação da reta foi utilizada para calcular a concentração de Glicose nas amostras de interesse (A1 e A2), comparando-se os valores ao obtido pela Lei de Lambert-Beer. Os resultados estão resumidos na TABELA 6.4. TABELA 6.4: Concentração de glicose nas amostras de interesse Lei de Lambert-Beer Equação da Reta A1 (Amostra 1) 0,206 54,64 52,82 A2 (Amostra 2) 1,247 330,77 319,74 AMOSTRA ABSORBÂNCIA (nm) GLICOSE (mg/dl) UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 31 Note que, a amostra A2 apresenta concentração aproximadamente 6 vezes maior que a de A1. Além disso, verifica-se que apesar de terem sido obtidas com metodologias distintas, não houveram variações significativas nas concentrações de glicose calculadas. 6.3.Conclusões O método enzimático-colorimétrico utilizado para a determinação da glicose mostrou-se eficiente uma vez, mesmo durante os procedimentos laboratoriais, pode-se estimar que colorações de vermelho mais intenso estariam relacionadas com maiores concentrações de glicose. Tais resultados foram comprovados com o cálculo da glicose. Neste caso, a amostra A2, com maiores concentrações de glicose também apresentou coloração de vermelho mais intenso. Em relação aos cálculos, conforme apresentado neste experimento, não houve variação significativa entre a Lei de Lambert-Beer e a equação da reta, uma vez a variação entre os métodos foi cerca de 3,33%. Nestas condições, apesar da metodologia de curva padrão e equação da reta demonstrar-se com maior precisão pois possuem mais pontos amostrais, a utilização da Lei de Lambert-Beer é, além de simples, perfeitamente aceitáveis no cotidiano. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 32 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS A disciplina de bioquímica faz parte da grade curricular de diversos cursos de graduação, estando inserida no ciclo de conteúdos básicos, sem a qual é difícil compreender fenômenos e processos patológicos e fisiológicos de forma plena. Neste contexto, as aulas práticas são extremamente enriquecedoras de conteúdo, pois além de familiarizam o aluno com as principais técnicas, aparatos laboratoriais e metodologias, possibilitam o aprimoramento do pensamento técnico-cientifico durante a elaboração dos relatórios. Com base nos cinco (05) experimentos realizados, o que mais chama atenção é que a partir da utilização do espectrofotômetro, bem como com a confecção de curvas padrões que forneçam uma equação de reta, é possível realizar o cálculo das concentrações das principais substâncias envolvidas nos processos bioquímicos do organismo. Além disso, ficou demonstrado que certos exames padrões, tais como a determinação da glicose ou de uréia, são relativamente simples de serem executados, dado a sua importância no diagnóstico de anomalias. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 33 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRADFORD, M. (1976), Analytical Biochemistry. 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