ANÁLISES CLÍNICAS imunoensaios reduzido!

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Imunoensaios
• Sorologia
• Testes sorológicos ou Imunoensaios
são técnicas para a detecção e/ou 
quantificação de antígenos e 
anticorpos, ou outras substâncias que 
desempenhem o papel de antígeno no 
ensaio, tais como drogas, hormônios, 
DNA, RNA, citocinas.
• Os testes sorológicos tem se tornado cada vez 
mais refinados e de execução simples. 
• Rigoroso controle e cuidadosa interpretação.
• Utilizados com sucesso na pesquisa de 
anticorpos. 
• Auxiliares importantes em processos visando 
um diagnóstico individual e de pesquisa 
epidemiológica.
Imunoensaios
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Imunoensaios
• Últimos anos
▫ Tecnologia mais refinada e acessível
▫ Testes mais sensíveis e específicos
• Novas metodologias de produção de insumos
▫ Anticorpos monoclonais
▫ Produção de Ags recombinantes
Imunoensaios
• Resultado dos testes diagnósticos
▫ Resultado de probabilidade que reflete a situação 
clínica do paciente no momento da colheita da 
amostra
▫ Interpretação em função dos limites do teste 
utilizado
▫ Auxílio para o diagnóstico clínico e terapêutica
• Tipos de resultados
▫ Negativo-positivo
▫ Normal-anormal
▫ Inconclusivos
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• Detecção de doenças infecciosas
▫ Detecção do agente infeccioso (antígeno)
 Testes diretos
▫ Detecção dos anticorpos anti-agente
 Testes indiretos
Amastigota de Leishmania no interior de um MacrófagoEnsaio de Imunodifusão em Gel de Ágar
Imunoensaios
Reação de Montenegro: teste
reativo paraleishmaniose. Imagem
obtida após 72 horas da injeção. A
área avermelhada, outrora bem
mais intensa e rígida, reduziu-se,
contudo a erupção cutânea central
acentuou-se
Reação de Montenegro: teste
reativo para leishmaniose. Imagem
obtida após 48 horas da aplicação.
Uma área avermelhada intensa e
rígida pode facilmente ser
observada, bem como o início de
uma erupção cutânea. O teste
acusou uma área efetivamente
afetada de 38 mm.
Imunoensaios
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Validação de um teste de diagnóstico
• A validade de um teste diagnóstico é a expressão 
do grau de acerto entre o teste e o que ele se 
propõe a medir
▫ Sempre realizada contra o desempenho de outro teste 
consagrado como válido (em geral mais invasivo ou de 
maior custo) –
▫ GOLD STANDARD TEST (PADRÃO-OURO)
 Utilizado para definir o verdadeiro estado 
do paciente
Gold standard test (padrão ouro)
• Deve ser definitivo (direto) e independente do 
teste que está sendo avaliado
• Ex.: Demonstração direta de T. cruzi
▫ Demonstração no microscópio, cultivo, PCR
Xenodiagnóstico – paciente sendo picado
propositalmente por barbeiros não-
infectados para pesquisa de T. cruzi no
intestino do inseto após 4 semanas
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Importante!
Falso negativo (F-) = indivíduos doentes 
no teste padrão ouro, mas que são 
considerados negativos ou normais no teste 
em avaliação.
Falso positivo (F+)= indivíduos não 
doentes no teste padrão ouro, mas que são 
considerados doentes no teste em avaliação.
Parâmetros de confiabilidade 
dos testes de diagnóstico
Sensibilidade Especificidade
Valor Preditivo Positivo Valor Preditivo Negativo
Acurácia
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Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Sensibilidade (S) = proporção de indivíduos 
verdadeiramente positivos (tanto no padrão ouro 
quanto no teste em avaliação) entre os doentes.
(E) = proporção de indivíduos 
verdadeiramente negativos ou normais (tanto no 
padrão ouro quanto no teste em avaliação) entre 
os não doentes.
Especificidade
Grandezas inversamente proporcionais
Testes de alta sensibilidade= pode ter falsos positivos
Testes de alta especificidade= pode ter falsos negativos
• Proporção de todos os pacientes com a doença
que apresentam resultados positivos no teste.
Capacidade de detecção dos verdadeiros
positivos.
• Um teste sensível raramente deixa de encontrar
pessoas com a doença
▫ Testes sensíveis apresentam poucos falso-
negativos
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Sensibilidade
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• Testes sensíveis são utilizados quando:
▫ O ônus de não fazer o diagnóstico é alto
 Ex.: Rastreamento de doenças em doadores de 
sangue
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Sensibilidade
• Testes sensíveis são utilizados quando:
▫ A doença é grave e não pode passar despercebida
▫ A doença é tratável
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Sensibilidade
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• Testes sensíveis são utilizados quando:
▫ Resultados falso-positivos não causam prejuízos 
psicológico, econômico ou social para o indivíduo
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Sensibilidade
• Capacidade de um teste diagnóstico em
identificar os verdadeiros negativos nos
indivíduos verdadeiramente hígidos
• Testes específicos identificam somente (ou
quase) os que têm a doença em investigação
▫ Testes específicos identificam poucos falso-
positivos
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Especificidade
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• Testes específicos são utilizados quando:
▫ O ônus do diagnóstico errôneo é alto (Ex.: Linfoma de 
Hodgkin) – Rádio e quimioterapia desnecessários
▫ A doença é importante, mas difícil de tratar ou incurável
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Especificidade
• Testes específicos são utilizados quando:
▫ O fato de saber que não tem a doença tem 
importância sanitária e psicológica
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Especificidade
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• Testes específicos são utilizados quando:
▫ Resultados falso-positivos geram traumas
psicológicos, econômicos ou sociais
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Especificidade
• É afetada em casos de
▫ Detecção de IgM contra diferentes epítopos
 Aumento de falsos positivos
• Correção do problema
▫ Síntese de Ags recombinantes
 Redução da sensibilidade
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Especificidade
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“Verdadeiros positivos”
• Proporção de indivíduos verdadeiramente positivos 
em relação aos diagnosticados positivos pelo teste
Azul – Negativo
Vermelho - Positivo
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
- Indivíduo doente
Valor Preditivo Positivo
“Verdadeiros negativos”
• Proporção de indivíduos verdadeiramente 
negativos em relação aos diagnosticados negativos 
pelo teste
Azul – Negativo
Vermelho - Positivo
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
- Indivíduo saudável
Valor Preditivo Negativo
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Prevalência e Valores Preditivos
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Quanto menor for a prevalência da doença, 
menor será o valor preditivo positivo 
(verdadeiros positivos) e maior o valor 
preditivo negativo (verdadeiros negativos) e 
vice-versa
Prevalência e Valores Preditivos
• Se a prevalência é baixa, ainda que o teste
seja muito específico, muitos falso-positivos
serão encontrados pelo grande número de
sadios na população
• Se a prevalência é alta, ainda que o teste seja
muito sensível, muitos falso-negativos serão
encontrados pelo grande número de doentes na
população
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
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• Proporção de acertos, ou seja, o total de
verdadeiramente positivos e verdadeiramente
negativos em relação à amostra estudada
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Azul – Negativo
Vermelho - Positivo
- Indivíduo doente
- Indivíduo saudável
Acurácia
• Testes acurados são necessários quando:
▫ A doença é importante, mas curável
▫ Há a possibilidade de consequências graves na
identificação de falsos positivos e falsos negativos
Parâmetrosde Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Acurácia
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Reprodutibilidade de um Teste 
Diagnóstico
• Influenciada por
▫ Qualidade dos reagentes
 Validade, armazenamento
▫ Condições técnicas e operacionais do 
laboratório (metrologia)
 Equipamentos calibrados (pipetas)
 Desgaste de equipamentos (lâmpada de 
espectrofotômetro, microscópios)
▫ Erros humanos (subjetividade)
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
Reprodutibilidade de um Teste 
Diagnóstico
• Prevenção de erros
▫ Avaliação da reprodutibilidade intrateste
 Realização do teste em duplicata ou triplicata
▫ Introdução de soros de referência como rotina 
diagnóstica (soroteca)
Parâmetros de Confiabilidade dos Testes Diagnósticos
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Testes em Série e em Paralelo
•Testes em Série:
▫ O primeiro teste é realizado, e se o resultado for 
positivo, o segundo teste é realizado, e assim por
diante. 
▫ Exemplo: Na Aids.
 Um teste de ELISA é realizado inicialmente, e se for 
positivo um teste de Western Blot é realizado a seguir. 
 Os testes em série
aumentam a especificidade
do diagnóstico.
Testes em Série e em Paralelo
• Testes em paralelo:
▫ Dois ou mais testes são realizados, e qualquer
resultado positivo identifica um caso.
▫ Os testes em paralelo têm por objetivo aumentar
a sensibilidade de um programa de triagem.
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Tipos de Imunoensaios – técnicas
Tipos de Imunoensaios
IMUNOPRECIPITAÇÃO
IMUNOAGLUTINAÇÃO
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
ENZIMOIMUNOENSAIO
IMUNOENSAIOS FLUORESCENTES
IMUNOENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTES
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 Ag solúvel – proteína, glicoproteína
 Baixa sensibilidade
 Ag particulado – hemácias, bactérias...
Necessidade de 
imunocomplexos visíveis 
para detecção
IMUNOPRECIPITAÇÃO
IMUNOAGLUTINAÇÃO
• Permitem identificar e até quantificar 
precipitados resultantes da interação 
antígeno- anticorpo. 
IMUNOPRECIPITAÇÃO
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IMUNOPRECIPITAÇÃO
 Detecção de Acs produzidos contra Ags solúveis.
Concentrações relativas de Ag e Ac 
interferem no resultado
- Obtenção de curva clássica
• Ag em concentração 
constante
• Ac em concentrações 
decrescentes
• Curva parabólica
Pré-zona, zona de 
equivalência, pós-zona
• Segundo o princípio da nefelometria, as reações 
de precipitação entre antígeno e anticorpo em 
soluções diluídas produzem um aumento da 
reflexão da luz, que pode ser diretamente medida 
pela dispersão da luz incidente. 
IMUNOPRECIPITAÇÃO
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Teste do Anel ou “Ring Test”
• Usado em laboratórios de pesquisa para saber se 
um animal está produzindo Ac contra um Ag
▫ Ex: Produção de Anticorpo anti-cavalo em 
humanos(produção de soro antiofíodico)
• Rápido e simples
▫ Adição do soro
▫ Adição do Ag
▫ Formação de linha visível 
em minutos
IMUNOPRECIPITAÇÃO
Imunodifusão
• Princípio da Imunodifusão
1. As moléculas livres se difundem no ágar
2. Quando o Ag encontra o Ac, formam-se imunocomplexos com alto PM
3. Por isso os imunocomplexos ficam aprisionados no gel, gerando
turvação o que permite visualização
IMUNOPRECIPITAÇÃO
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Imunodifusão
• Pode ser utilizada para verificar a purificação de 
Ags
Ag X precipitou próximo ao poço 
por estar em baixas concentrações 
ou devido ao seu alto PM, que 
impediu a migração 
Ag Y e Z apresentam diferentes PM, e a 
solução antigênica não estava purificada. 
Geralmente se utiliza apenas um Ag nos 
imunoensaios
IMUNOPRECIPITAÇÃO
Variações da Imunodifusão
• Simples
▫ O Ag ou Ac está fixado no gel
• Dupla
▫ Tanto o Ag quanto o Ac migram em direção um ao outro
• Linear ou Unidimensional
▫ Movimento das moléculas é realizado por gravidade ou 
eletroforese
• Radial
▫ Movimento ao acaso em todas as direções a partir do poço 
em que se coloca a amostra
IMUNOPRECIPITAÇÃO
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Imunodifusão Radial Dupla
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▫ Um Ag particulado se associa com o Ac específico, 
precipitando
▫ Necessidade de proporções ideais de Ac e de Ag
Aglutinação: Ausência de Acs Aglutinação: Presença de Acs
IMUNOAGLUTINAÇÃO
Partículas Naturais Partículas
Sintéticas
Passiva
Conjugação
Prévia Ag
HEMAGLUTINAÇÃO BACTÉRIAS LÁTEX, ETC
Passiva
Conjugação
Prévia Ag ou Ac
Antígenos
superfície
membrana
Antígenos ou
Receptores
superfície
membrana
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AGLUTINAÇÃO EM PLACA
Aglut.
Positiva
Aglut.
Negativa
GRUMOS
SINAL: GRUMOS
IMUNOAGLUTINAÇÃO
Aglutinação Direta
Células Bacterianas (Salmonella)
+
Soro contendo Ac 
específico para a bactéria
Aglutinação das bactérias
IMUNOAGLUTINAÇÃO
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• Baseia-se na propriedade Ags virais aglutinarem 
espontaneamente determinados tipos de 
hemácias
▫ Rubéola
▫ Sarampo
▫ Influenza
▫ Enterovírus
Hemaglutininas 
virais
IMUNOAGLUTINAÇÃO
Inibição de Aglutinação Direta
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Inibição de Aglutinação DiretaAglutinação Mediada por Partículas Virais (Resultado Negativo)
Inibição da Aglutinação pelos Acs Anti-vírus (Resultado Positivo)
Hemácias
Hemácias
+
Partículas Virais no Soro com 
Ausência de Ac Específico
Aglutinação
+
Partículas Virais
Soro contendo Ac 
específico para o vírus
IMUNOAGLUTINAÇÃO
Radioimunoensaio
• Emprega moléculas de Ag ou Ac marcadas com 
radioisótopos
▫ 125I mais empregado – meia-vida de 57,5 dias
 Resultado é dado pela quantificação da radioatividade
• Radioimunoensaios
▫ Termo para ensaios com Ag marcado do tipo 
competitivo
• Ensaios Imunorradiométricos
▫ Ensaios com Ac marcado do tipo sanduíche
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
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Radioimunoensaios
• Principais desvantagens
▫ Meia-vida dos reagentes
▫ Risco operacional
▫ Necessidade de medidas especiais e de elevado 
custo de biossegurança
▫ Descarte especial de material
Tipos de RIA para quantificação de 
Moléculas (Ags)
• Competição com Ag Marcado
• Método de Competição com Ac Marcado
• Sanduíche
▫ Captura de Antígeno
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Ag radioativamente marcado Ag da amostra
Ac específico para Ag
Lavagem
Competição com Ag Marcado
RIA de Competição com Ac Marcado
• Também utilizada para quantificar moléculas 
antigênicas
• Técnica
▫ Acs são marcados com radioisótopos
▫ Ag padrão é fixado na fase sólida
▫ Amostra contendo ou não Ag é inserida 
juntamente com os Acs marcados
▫ Incubação, lavagem e leitura
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RIA de Competição com Ac Marcado
• Resultado
▫ Quanto maior a quantidade de Ag na amostra, 
maior a formação de imunocomplexos que são 
removidos na lavagem
▫ A [Ag] é inversamente proporcional à leitura de 
radioatividade
 Quanto menor a radioatividade, maior a 
concentração de Ag presente na amostra
Ag da amostra ou da 
fase sólida
Ac radioativamente marcado
Ag da fase sólida
Ag da amostra
Método de Competição com Ac Marcado
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Ag da amostra ou da 
fase sólida
Ac radioativamente marcado
Lavagem
RIA Sanduíche (Captura de Ag)
• Procedimento ocorre em 2 etapas
▫ Ac específico para o Ag é fixo na fase sólida
▫ Incuba-se a amostra – lavagem
▫ Incuba-se um segundo Ac específico 
marcado – lavagem
 O epítopo de ligação do 2º Ac deve ser 
diferente do epítopo ligado ao 1º Ac
• Ensaio do tipo Imunorradiométrico
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Ag da amostraAc radioativamente marcado
Ac da fase sólida
Lavagem
Ag da amostraAc radioativamente marcado
Ac da fase sólida
Lavagem
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• É similar aos radioimunoensaios , exceto que é a 
atividade enzimática que é quantificada e não a 
radioatividade.
• Requer um processo secundário para obter o 
sinal através das reações catalíticasdas enzimas.
• Substituição dos radioimunoensaios
▫ Estabilidade dos reagentes
▫ Mesma sensibilidade
▫ Uso de radioativos desnecessário
ENZIMOIMUNOENSAIO
Enzyme-multiplied Immunoassay
Technique – EMIT
• Princípio
▫ Quando o Ac fica livre
 Ligação ao conjugado 
 Inativação da enzima
 Impedimento estérico
▫ Bloqueio do sítio de ligação da enzima ao substrato
 Impedimento alostérico
▫ Alteração da conformação da enzima
▫ Quando o Ac se liga ao hapteno
 Conjugado fica livre
 Na adição do substrato, ocorre reação
ENZIMOIMUNOENSAIO
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Todos os reagentes 
são inseridos de 
uma vez
Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Estérica
Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Estérica
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Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Estérica
Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Estérica
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Todos os reagentes 
são inseridos de 
uma vez
Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Alostérica
Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Alostérica
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Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Alostérica
Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Alostérica
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Ac monoclonal anti-hapteno
Conjugado – Enzima hapteno (Ex.: Glicose e 
fosfato desidrogenase – G6PDH)
Substrato – NAD (Nicotinamida adenina dinucleotídeo) –
convertido em NADPH (NAD hidróxido)
Droga ou hapteno pesquisado 
Alteração 
Alostérica
ELISA
• Enzyme-linked Immunosorbent Assay
▫ Desenvolvido em 1970
▫ Difundido comercialmente em 1985
 Ensaio anti-HIV
• Princípio
▫ Imobilização de Ag ou Ac em fase sólida
▫ Uso de conjugado (Ag ou Ac ligado a enzima)
▫ Substrato forma produto colorido
 Leitura visual ou espectrofotômetro
ENZIMOIMUNOENSAIO
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ELISA – VIDEO – DIRETO E INDIRETO
• Baseia-se na imobilização de um dos 
componentes, em fase sólida, e na utilização de 
um conjugado ligado a uma enzima. Como o 
substrato forma um produto colorido, a 
alteração de cor é monitorada visualmente ou 
por meio de espectrofotômetro que relaciona a 
quantidade de substância dosada à intensidade 
de cor. 
Características do ELISA
• Elevada sensibilidade e especificidade
• Rapidez e baixo custo
• Objetividade da leitura
• Possibilidade de automação.
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ELISA
• Aplicações
▫ Detecção de Ag ou Ac
▫ Diagnóstico de HIV, Hepatites, Toxoplasmose, 
Rubéola, Doença de Chagas, Sífilis, Herpes, e etc.
TIPOS DE ELISA
• Pesquisa de Ags
▫ Competitivo com Ag marcado
▫ Competitivo com Ac marcado
▫ Captura de Ag ou sanduíche
• Pesquisa de Acs
▫ Indireto 
▫ Captura de Ig classe específica
▫ Sanduíche
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ELISA Competitivo com Ag Marcado 
• Utiliza Ac marcado em quantidade limitada
• O Ac marcado deve ligar-se com a mesma avidez ao 
Ag da amostra e ao Ag marcado
• Resultado negativo (cor)
• Resultado positivo (sem cor)
▫ Há muito Ag na amostra que vai se ligar em grande 
quantidade ao Ac adsorvido
▫ O Ag marcado não se liga e é retirado na lavagem
▫ Adição de substrato - pouca coloração ou mesmo 
ausência de cor
Ag da amostra
Ac para o Ag
Ac da fase sólida
Ag conjugado à enzima
Substrato
Sem Ag na amostra
Lavage
m + 
Substrat
o
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Ag da amostra
Ac para o Ag
Ac da fase sólida
Ag conjugado à enzima
Substrato
Com Ag na amostra
Lavage
m + 
Substrat
o
ELISA Competitivo com Ac Marcado 
• Teste ideal para medidas de hormônios, 
marcadores tumorais e Ags de patógenos
• Imunoensaio
▫ O Ag é adsovido
▫ Adiciona-se uma solução contendo a amostra e o 
Ac marcado à microplaca
▫ Incubação e lavagem
▫ Adição do substrato
▫ Leitura
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Ag da amostra e Ag da 
fase sólidaAc Marcado com 
Enzima Substrato
Sem Ag na amostra
Lavage
m + 
Substrat
o
Ag da amostra e Ag da 
fase sólida
Ac Marcado com 
Enzima Substrato
Com Ag na amostra
Lavage
m + 
Substrat
o
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Elisa de Captura de Ag ou Sanduíche
ELISA Indireto
• Conjugado – Anti-Ig humana marcada
▫ Pesquisa de Ig específica para inúmeros patógenos
• Técnica
▫ Amostra é incubada com suporte já contendo o Ag 
adsorvido
▫ Incubação do soro contendo ou não Ac
▫ Lavagem para retirada do excesso de Ac
▫ Incubação com o conjugado anti-Ig
▫ Lavagem para retirar o excesso de conjugado
▫ Adição do substrato cromogênico
▫ Solução de parada
▫ Leitor de ELISA
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ELISA Indireto – positivo - cor
Captura de Ig de Classe Específica
• Elevada sensibilidade
▫ Impede interferência de IgG específica (presente 
em elevada quantidade)
• Ex.: Teste de IgM ou IgE específico
▫ Adsorção de anti-IgM ou anti-IgE em placa
▫ Amostra é incubada seguindo-se à lavagem
▫ Incubação com Ag específico para a IgM ou IgE 
pesquisada marcado com enzima
▫ VARIAÇÃO – Ag não-marcado é incubado, 
lavagem, adição de um 2º Ac para o Ag marcado
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Ag pesquisado marcadoAc Anti-IgM
Substrato
Lavage
m
Ac IgM da Amostra
Lavage
m
Adição do Soro
Adição do Ag
Adição do Substrato
Ag pesquisado Ac Anti-IgM
Lavagem 
Ac IgM da Amostra
Lavage
m
Adição do Soro
Adição do Ag
Ac Anti-Ag marcado
Substrato
Lavage
m 
Adição do Ac 
marcado
Adição do Substrato
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Introdução
• Testes de Imunofluorescência
▫ Uso de fluorocromos como reveladores
 Absorvem a luz num comprimento de onda baixo e
emitem a luz em comprimento de onda maior
IMUNOENSAIOS FLUORESCENTES
Classificação dos Testes de 
Imunofluorescência
• De acordo com o componente marcado
▫ Antígeno ou anticorpo
• Método competitivo ou não-competitivo
• Homogêneos (fase líquida) ou heterogêneos
(fase sólida)
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Aspectos Técnicos da 
Imunofluorescência
• Realizada em lâminas de vidro
▫ Detecção do Ag ou Ac em células e tecidos
▫ Marcação do revelador com fluorocromos
• Uso mais limitado que a imunoperoxidase
▫ Necessidade de infraestrutura complexa
▫ Não pode ser adaptada à microscopia eletrônica
▫ Análise deve ser rápida (↓ gradativa da 
fluorescência)
Aspectos Técnicos da 
Imunofluorescência• Imunofluoresência está sendo gradativamete
substituída por testes imunoenzimáticos na
rotina laboratorial
▫ Devido à
 Necessidade de microscopia
 Subjetividade de leitura
 Impossibilidade de automação
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Reagentes Utilizados na 
Imunofluorescência
• Acs marcados com elevada especificidade
• Ags ou amostras fixadas às lâminas de 
microscopia
• Uso de glicerina alcalina na lâmina (pH 8,5)
▫ Auxilia na máxima emissão de fluorescência
• Azul de Evans ou Vermelho Congo
▫ Facilitam a visualização da fluorescência
Imunofluorescência Direta
• Detecção direta do Ag em células ou tecidos
▫ Uso de Ac específico marcado com fluorocromo
• Exemplo: Marcação de Linfócitos T CD4+ e CD8+
▫ Células colhidas do sangue ou linfonodo
▫ Fixação em lâminas de microscopia
▫ Incubação com Acs monoclonais
 Ac anti-CD4+ + fluoresceína e Ac anti-CD8+ + 
rodamina
▫ Lavagem para retirar Acs não fixados
▫ Contagem dos linfócitos verdes e vermelhos
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Ac anti-CD4+ Ac anti-CD8+
Imunofenotipagem
de Linfócitos
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Imunofluorescência Indireta
• Uso de Ac anitiimunoglobulina marcado 
com fluorocromo para a detecção de Acs
que se fixaram em Ags agregados à lâmina
• Vantagem em relação à imunofluorescência
direta
▫ Uso de um mesmo conjugado para vários 
sistemas
▫ Impossível marcar na técnica direta os Acs de 
cada paciente com fluorocromo
▫ Uso de 2 anticorpos aumenta a sensibilidade
Imunofluorescência Indireta
• Técnica
▫ O Ag é fixado à lâmina
▫ O soro do paciente é incubado na lâmina
▫ Lavagem para retirar os Acs que não se ligaram
▫ Incubação do sistema com o conjugado
▫ Lavagem para retirar o conjugado não ligado
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Soro contendo Acs Soro sem Acs
Lavagem
Anti-IgG marcada 
- Conjugado
Anti-IgG marcada -
Conjugado
Lavagem
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Positivo Negativo
Aplicações da Imunofluorescência
• Detecção de Influenza
• Adenovírus
• Herpesvírus
• Treponema pallidum
• Chlamydia
• E. coli
• Streptococcus b-hemolítico
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Fluorescência Polarizada (FPIA)
• Aplicações
▫ Detecção de drogas e proteínas de baixo peso 
molecular
Ac monoclonal anti-hapteno Hapteno a ser identificado (Ex.: droga) – identificada na amostra
Hapteno marcado (conjugado)
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Ac monoclonal anti-hapteno Hapteno a ser identificado (Ex.: droga) – identificada na amostra
Hapteno marcado (conjugado)
Amostra
Positiva
Amostra
Negativa
A amostra 
é inserida
Ac monoclonal anti-hapteno Hapteno a ser identificado (Ex.: droga) – identificada na amostra
Hapteno marcado (conjugado)
Amostra
Positiva
Amostra
Negativa
O Ac se liga 
ao hapteno
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Ac monoclonal anti-hapteno Hapteno a ser identificado (Ex.: droga) – identificada na amostra
Hapteno marcado (conjugado)
Amostra
Positiva
Amostra
Negativa
O conjugado 
é inserido na 
amostra, 
que é 
analisada
Ac monoclonal anti-hapteno Hapteno a ser identificado (Ex.: droga) – identificada na amostra
Hapteno marcado (conjugado)
Amostra
Positiva
Amostra
Negativa
A polarização é 
inversamente 
proporcional à 
concentração de Ag 
não marcado
Abbott Imx
Immunoassay Analyzer
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• Devido à elevada sensibilidade, os ensaios de
quimiluminescentes são muito usados para a
determinação quantitativa de hormônios, 
marcadores tumorais, peptídeos e drogas
IMUNOENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTES
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IMUNOENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTES
ECLIA
• A eletroquimioluminescência ocorre quando é
aplicada uma corrente elétrica em um eletrodo de
platina, cria um campo elétrico que fazendo com 
que todos os materiais nesse campo reajam.
IMUNOENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTES