PCR: Amplificação de Genes

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Universidade de São Paulo – Instituto de Física de São Carlos – Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares 
Biologia Celular e Molecular I – 2013 
 
Aula Prática 02: REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 
 
A. Reação em cadeia da polimerase (PCR) 
 
A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction) foi desenvolvida por Kary 
Mullis nos anos 80 e lhe propiciou o prêmio Nobel de Química em 1994. A PCR permite amplificar um gene de cópia 
única em milhões de cópias, a partir de uma pequena quantidade do DNA original (DNA molde). 
O pré-requisito essencial é a determinação da região do gene que será amplificada. Em seguida, são 
desenhados e sintetizados um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers) complementares às regiões 
flanqueadoras da sequência a ser amplificada em cada fita do DNA. Geralmente, primers específicos possuem 
tamanho entre 17 a 30 nucleotídeos, teor de GC entre 40 a 60% e não são auto-complementares ou 
complementares entre si. 
O processo é composto de três etapas: desnaturação, hibridização (“anelamento”) e extensão, que juntas 
correspondem a um ciclo da reação. Normalmente são realizados de 25 a 35 ciclos para cada reação na qual a taxa 
de amplificação é exponencial, 2 nº de ciclos. 
 
1) Desnaturação: a 94 °C, as fitas do DNA são separadas. 
2) Hibridização: geralmente entre 45 a 65 °C, os primers hibridizam com suas sequências complementares no DNA 
molde desnaturado. 
3) Extensão: a 72 °C, a DNA Polimerase, na presença íons Mg2+ e dNTPs (desoxinucleotídeos), sintetiza uma nova fita 
de DNA a partir da extremidade 3’ OH do primer que se encontra hibridizado ao DNA molde. A descoberta da 
enzima Taq DNA Polimerase, oriunda da bactéria Thermus aquaticus, que vive em fontes hidrotermais, permitiu 
automatizar o processo utilizando-se os termocicladores. A enzima Taq possui uma atividade ótima a 72 °C, mas 
permanece estável até 94 °C. 
 
Além da amplificação para clonagem molecular, a técnica de PCR possui outras aplicações como: teste de 
paternidade, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, medicina forense, testes de organismos transgênicos, 
análise de polimorfismo de DNA, sequenciamento de DNA e várias aplicações no uso das metodologias do DNA 
recombinante. 
 
 Procedimento 
 
A partir do DNA genômico de Streptomyces clavuligerus, será amplificado por PCR o gene cas2, que codifica 
a proteína clavaminato sintase (CAS). A clavaminato sintase é uma proteína Fe (II)/2-oxoglutarato oxigenase 
importante na biossíntese do ácido clavulânico, um produto do metabolismo secundário utilizado na indústria 
farmacêutica como antibiótico. 
 
1) Coloque os regentes para degelar no banho de gelo e realize todo o preparo das amostras no gelo para evitar que 
as reações se iniciem prematuramente. 
2) Em um tubo de 0,2 mL, prepare a reação no volume final de 50 µL conforme discriminado na tabela a seguir. 
Pipete os reagentes na mesma sequência em que eles aparecem na tabela. 
 
 
 
 
 
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Reagente Quantidade Concentração Final 
Água milli-Q estéril 30 µL - 
Tampão da Pfu DNA Polimerase (5X) 10 µL 1 X 
MgCl2 (50 mM) 2,5 µL 2,5 mM 
dNTPs (10 mM) 1 µL 0,2 mM 
Primer forward (10 µM) 1 µL 0,2 µM 
Primer reverse (10 µM) 1 µL 0,2 µM 
DMSO (dimetil sulfóxido) 2,5 µL 5% 
DNA molde (DNA genômico) 1 µL 0,1 – 1 µg 
Pfu DNA Polimerase (1 U/µL) 1 µL 1U 
 
3) Coloque o tubo no termociclador sob as seguintes condições de reação: 
 
Etapa Temperatura Tempo 
Desnaturação inicial 95 °C 5 min 
35 ciclos 
(Desnaturação, hibridização e extensão) 
94 °C 30 s 
69 °C 1 min 
72 °C 90 s 
Extensão final 72 °C 10 min 
Armazenamento 4 °C ∞ 
 
 
A figura a seguir esquematiza os dois primeiros ciclos de reação. 
 
 
 
 
 
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Questões 
 
1) Compare as etapas da reação da PCR (desnaturação, hibridização e extensão) com as etapas da replicação do 
DNA na célula, destacando as diferenças e semelhanças. 
2) Por que a PCR resulta em um fragmento de DNA de tamanho determinado? 
3) Em uma PCR convencional, partindo de uma molécula de DNA, qual o número de moléculas após 30 ciclos? 
4) Se fosse colocado apenas um dos primers, qual seria o número de moléculas após 2 ciclos? E após 30 ciclos? 
 
Informações adicionais 
 
 No site NCBI (National Center for Biotechnology Information), estão disponíveis sequências de genes, RNA e 
proteínas de diversos organismos. No link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6840451 encontram-se os registros 
para o gene cas2 (Gene ID: 6840451). 
 Para mais informações sobre as técnicas, consultar: Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory 
Manual. 3th Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2001. 
 
B. Eletroforese do produto de PCR 
 
Através de eletroforese em gel de agarose, verificaremos se o gene foi amplificado e se o tamanho do 
produto de PCR está correto. Se positivo, procederemos, na próxima prática, à purificação do produto de PCR a 
partir do gel de agarose para posterior ligação a um vetor de clonagem. 
 
1) Retire 5 µL do produto de PCR e adicione 1 µL de tampão de amostra (solução contendo: 20% (m/v) de Ficoll 
400; 0,1 M de EDTA pH 8,0; 0,1% (m/v) de SDS e 0,25% (m/v) de azul de bromofenol). 
2) Aplique a mistura em uma canaleta do gel de agarose 0,8%, contendo o corante Sybr Safe e, em seguida, 
aplique a voltagem de 110 V por aproximadamente 40 min.. Utilize o transluminador para analisar o gel no 
comprimento de onda de 470 nm.