Engenharia Enzimatica

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Escola Superior de Tecnologia 
Unidade Departamental de Engenharias 
Licenciatura em Engenharia Química e Bioquímica 
 
 
Engenharia Enzimática 
Professora Drª Dina Mateus 
 
 
 
 
Métodos de Imobilização de biocatalisadores 
Determinação das constantes cinéticas na atividade de invertase em 
células de Sacharomyces bayanus livres e imobilizadas 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório elaborador por: 
Ana Emídio nº 20215 
Mª Inês Emídio nº 19896 
 
 
 
Tomar, janeiro/2019
 I 
 
 
 
Resumo 
 
 Na execução do presente trabalho laboratorial, primeiramente, foram 
demonstrados métodos de imobilização de células e enzimas. O método demonstrado foi 
por oclusão em gel, nomeadamente em alginato. 
 Na segunda parte do trabalho, foram determinados os parâmetros cinéticos da 
reação de hidrólise da sacarose, pela ação da enzima invertase, segundo a cinética de 
Michaelis-Menten. Foram usadas como fonte da enzima células da levedura 
Sacharomyces bayanus, quer em estado livre e quer em estado imobilizado (primeira 
parte do trabalho). 
 A execução deu-se com recurso a reatores com temperatura controlada, 
utilizando-se diferentes concentrações de sacarose, sempre com adição de células da 
levedura. Extraíram-se amostras em determinados momentos da reação que foram 
posteriormente analisadas no espectrofotómetro. Determinaram-se as concentrações de 
frutose e glucose para cada extração, aferindo-se assim, as velocidades da reação para 
cada momento. 
 Determinadas as velocidades da reação para cada instante de tempo, recorreu-se 
à linearização de Lineweaver-Burk e determinaram-se os parâmetros cinéticos. 
 Para as células livres o valor de vmáx determinado foi de 0,013489 g/(L.min) e KM 
de 10,489262 g/L. 
Já para as células imobilizadas, vmáxi obteve valor de 0,012474 g/(L.min) e KMi de 
16,576026 g/L.
 
 
Índice 
1. Introdução Teórica ................................................................................................ 1 
2. Parte Experimental ................................................................................................ 4 
2.1. Imobilização de enzimas por oclusão em gel .................................................. 4 
2.2. Determinação das constantes cinéticas ........................................................... 4 
2.2.1. Ensaios com células livres ......................................................................... 4 
2.2.2. Ensaios com células imobilizadas .............................................................. 5 
3. Resultados e Discussão.......................................................................................... 6 
3.1. Ensaios com células livres ............................................................................. 6 
3.2. Ensaios com células imobilizadas ................................................................ 14 
3.3. Cálculo Fator de Efetividade Global ............................................................ 22 
4. Conclusão ........................................................................................................... 24 
5. Bibliografia ......................................................................................................... 25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1 
 
1. Introdução Teórica 
 
 As enzimas são biocatalisadores de natureza proteica que participam nas reações 
químicas que ocorrem nos seres vivos. Os biocatalisadores são também eficientes do 
ponto de vista energético pois operaram a temperaturas e pressões moderadas, bem como 
gamas moderadas de valores de pH (Cabral, Aires Barros, & Gama, 2003). 
 Uma enzima catalisa uma reação química sem se consumir e sem alterar o 
equilíbrio químico característico dessa reação. Esta, atua diminuindo a energia de 
ativação da reação de forma a que a reação ocorra mais rapidamente. A sua atuação pode 
ser demonstrada na forma de um gráfico: 
 
Figura 1: Modo de atuação de um biocatalisador 
 
 Os biocatalisadores apresentam elevado grau de especificidade, uma vez que, cada 
tipo de enzima catalisa reações especificas. Porém, a sua utilização nas mais diversas 
indústrias é cada vez mais frequente. 
 A enzima invertase, presente nos seres vivos, é responsável pela hidrólise da 
sacarose como mostra a reação: 
 
Figura 2: Reação de hidrólise da sacarose pela enzima invertase 
 
 As células da levedura Sacharomyces bayanus servem de fonte para a enzima 
invertase. 
 
 2 
 A cinética das reações enzimáticas pode ser descrita pela equação de Michaelis-
Menten: 
 
Figura 3: Equação de Michaelis-Menten 
 Onde v0 representa a velocidade inicial da reação, S0 a concentração inicial de 
substrato, vmax e KM são constantes cinéticas. 
 A representação gráfica da equação de Michaelis-Menten pode ser: 
 
Figura 4: Representação gráfica da equação de Michaelis-Menten 
 As constantes vmáx e KM podem ser determinadas através da medição das 
velocidades iniciais da reação a diferentes concentrações de substrato (Mateus, 2019). 
 Frequentemente, recorre-se à representação gráfica de Lineweaver-Burk que 
resulta da linearização da equação de Michaelis-Menten, onde 1/v0 é função de 1/S0. Esta 
representação tem a seguinte forma: 
 
Figura 5: Representação gráfica de Lineweaver-Burk 
 3 
 Na grande maioria das aplicações industriais os biocatalisadores são utilizados na 
forma imobilizada (Mateus, 2019). 
 A imobilização de catalisadores biológicos consiste no seu confinamento a uma 
região restrita (biorreator), garantindo a retenção da atividade catalítica e assegurando a 
sua possibilidade de utilização de forma repetida ou contínua (Cabral, Aires Barros, & 
Gama, 2003). 
 A utilização de biocatalizadores imobilizados tem demonstrado ser eficaz para 
obtenção de elevados níveis de atividade catalítica (expressa em unidades mássicas ou 
molares), especificidade elevada e redução de ocorrência de reações secundárias. 
 O método de imobilização em gel consiste no aprisionamento das células ou 
moléculas de enzima nas malhas de uma matriz polimérica, insolúvel em água (Mateus, 
2019). 
 Habitualmente, o modelo cinético de Michaelis-Menten é também aplicado a 
catalisadores biológicos imobilizados: 
 
Figura 6: Equação de Michaelis-Menten para biocatalisadores imobilizados 
 
 Onde vmáxi e KMi representam as constantes cinéticas da enzima imobilizada. 
 Conhecidos os valores das constantes, segue-se o cálculo de um fator de 
efetividade global para o sistema imobilizados. O fator de efetividade global é 
representado pela letra  e reflete os efeitos da transferência de massa externa e interna 
(Mateus, 2019). 
 
Figura 7: Equação para cálculo fator de efetividade global 
 
 4 
2. Parte Experimental 
 
2.1. Imobilização de enzimas por oclusão em gel 
 Neste método, as enzimas (ou células) são incorporadas numa solução aquosa de 
alginato de sódio, à qual se adiciona seguidamente a uma solução de iões cálcio, 
provocando assim, a gelificação do alginato por troca de iões sódio e cálcio. 
 
2.2. Determinação das constantes cinéticas 
2.2.1. Ensaios com células livres 
2.2.1.1. Reagentes 
 Utilizou-se uma solução de reagente DNS já preparado. 
 Utilizou-se soluções de sacarose de concentrações conhecidas de 5, 10, 20, 30, 40, 
60, 100 e 200 g/L em tampão acetato a pH 7,5. 
 Como fonte da enzima utilizou-se uma suspensão de células da levedura de 
Sacharomyces bayanus a 2% (p/v). 
 
2.2.1.2. Materiais 
 Na medição rigorosa de volumes foram utilizadas micropipetas automáticas da 
Jencons Sealpette,Accupet Pro e Labsystems. 
 De forma a garantir temperatura constante no interior do reator, utilizou-se banho 
termostatizado da marca Grant W38. 
 Para dar início ao procedimento, as soluções teriam de atingir uma dada 
temperatura de reação e, para tal, utilizou-se a placa de aquecimento LABINCO. 
 Para homogeneizar as soluções antes da leitura no espectrofotómetro, utilizou-se 
o vórtice da marca Heidolph REAX. 
 Para leitura das absorvâncias, utilizou-se o espectrofotómetro da marca DR 
LANGE. 
 Utilizou-se material de vidro corrente de laboratório. 
 
2.2.1.3. Procedimento 
 Uma vez que não foram preparadas soluções, seguiu-se o protocolo. 
 
 
 5 
 
2.2.2. Ensaios com células imobilizadas 
2.2.2.1. Reagentes 
 Utilizou-se uma solução de reagente DNS já preparado. 
 Utilizou-se soluções de sacarose de concentrações conhecidas de 10, 20, 40, 60, 
80, 100, 150 e 200 g/L em tampão acetato a pH 7,5. 
 Como fonte da enzima, imobilizada utilizou-se uma suspensão de células da 
levedura Sacharomyces bayanus a 2% (p/v), imobilizada por oclusão em gel de 
alginato. 
 
2.2.2.2. Materiais 
 Na medição rigorosa de volumes foram utilizadas micropipetas automáticas da 
Jencons Sealpette, Accupet Pro e Labsystems. 
 De forma a garantir temperatura constante no interior do reator, utilizou-se banho 
termostatizado da marca Grant W38. 
 Para dar início ao procedimento, de forma a que as soluções atingissem a 
temperatura de reação, utilizou-se a placa de aquecimento LABINCO. 
 Para homogeneizar as soluções antes da leitura no espectrofotómetro, utilizou-se 
o vórtice da marca Heidolph REAX. 
 Na leitura das absorvâncias, utilizou-se o espectrofotómetro da marca DR 
LANGE. 
 Utilizou-se material de vidro corrente de laboratório. 
 
2.2.2.3. Procedimento 
 Uma vez que não foram preparadas soluções, seguiu-se o protocolo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 6 
3. Resultados e Discussão 
3.1. Ensaios com células livres 
 
 A reação de hidrólise da sacarose foi conduzida a 45ºC. As soluções de substrato 
foram preparadas em tampão acetato com pH 7,5. 
 Os valores das absorvâncias medidas a 540 nm no espectrofotómetro estão 
representadas na seguinte tabela: 
 
Tabela 1: Abs a 540 nm 
 
Nota: * 7 minutos 
 ** 1,34 minutos 
 *** 5,20 minutos 
 - Não foi registado qualquer valor 
 
 
 Conhecidos os valores das absorvâncias, seguem-se os cálculos das concentrações 
de glucose e frutose. Para tal, recorre-se à reta de calibração da glucose que pode ser 
extraída do seguinte gráfico (Mateus, 2019): 
 
Concentração 
Sacarose (g/L) 
Tempo (minutos) 
0 1 2 3 4 5 
5 0,000 0,003 0,003 -0,003 0,003 0,007* 
10 0,040 0,057** 0,049 0,061 0,070 0,080 
20 0,026 0,055 0,076 0,052 0,064 0,071*** 
30 0,001 0,022 0,018 0,022 0,024 0,036 
40 0,038 - 0,091 - 0,091 0,010 
60 0,039 0,067 0,071 0,085 0,093 0,103 
80 0,056 0,083 0,045 0,102 0,121 0,132 
100 0,047 0,077 0,092 0,108 0,110 0,134 
200 0,057 0,088 0,118 0,115 0,117 0,127 
 Abs a 540 nm 
 7 
 
Gráfico 1: Reta de calibração da glucose 
 
 A equação da reta de calibração da glucose é expressa pela expressão: 
y = 1,8099𝑥 + 0,0418 (1) 
 Onde y representa a concentração de glucose em g/L e x o valor da absorvância a 
540nm. Assim, as concentrações de glucose e frutose estão representadas na seguinte 
tabela: 
 Tabela 2: Concentração de glucose e frutose em g/L 
 
 
Concentração 
Sacarose (g/L) 
Tempo (minutos) 
0 1 2 3 4 5 
5 0,04180 0,04723 0,04723 0,03637 0,04723 0,05447* 
10 0,11420 0,14496** 0,13049 0,15220 0,16849 0,18659 
20 0,08886 0,14134 0,17935 0,13591 0,15763 0,17030*** 
30 0,04361 0,08162 0,07438 0,08162 0,08524 0,10696 
40 0,11058 0,20650 0,20650 0,23003 
60 0,11239 0,16306 0,17030 0,19564 0,21012 0,22822 
80 0,14315 0,19202 0,12325 0,22641 0,26080 0,28071 
100 0,12687 0,18116 0,20831 0,23727 0,24089 0,28433 
200 0,14496 0,20107 0,25537 0,24994 0,25356 0,27166 
 Concentração Glucose e Frutose (g/L) 
 8 
 
Nota: * 7 minutos 
 ** 1,34 minutos 
 *** 5,20 minutos 
 - Não foi registado qualquer valor 
 
 Seguem-se as representações gráficas da variação da concentração de glucose e 
sacarose ao longo do tempo, para a determinação das velocidades da reação para cada 
concentração de sacarose: 
 
Gráfico 2: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 5 g/L de sacarose 
 
 
Gráfico 3: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 10 g/L de sacarose 
 
y = 0,0019x + 0,0431
R² = 0,7262
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
5 g/L Sacarose
Série1
Série2
Linear (Série1)
y = 0,0136x + 0,1147
R² = 0,9105
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
10 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
 9 
 
Gráfico 4: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 20 g/L de sacarose 
 
Gráfico 5: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 30 g/L de sacarose 
 
Gráfico 6: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 40 g/L de sacarose 
y = 0,0161x + 0,0892
R² = 0,9933
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
20 g/L Sacarose
Série1
Série2
Linear (Série1)
y = 0,0116x + 0,0458
R² = 0,9556
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
30 g/L Sacarose
Série1
Série2
Linear (Série1)
y = 0,0215x + 0,1294
R² = 0,8054
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
40 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
 10 
 
Gráfico 7: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 60 g/L de sacarose 
 
Gráfico 8: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 80 g/L de sacarose 
 
Gráfico 9: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 100 g/L de sacarose 
y = 0,0213x + 0,1267
R² = 0,9423
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
60 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
y = 0,0262x + 0,1526
R² = 0,9746
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
80 g/L Sacarose
Série1
Série2
Linear (Série1)
y = 0,0284x + 0,142
R² = 0,9495
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
100 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
 11 
 
Gráfico 10: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 200 g/L de sacarose 
 
 Uma vez que, a reação apresenta dois produtos, glucose e frutose, é necessário 
dividir o declive por dois para determinar a velocidade da reação. Tal é possível, devido 
à massa molar da glucose e da frutose ser igual e de se encontrarem na mesma proporção. 
 Assim, as velocidades da reação são apresentadas na seguinte tabela: 
Concentração do 
meio 
Declives Velocidade 
5 0,0019 0,00095 
10 0,0136 0,0068 
20 0,0161 0,00805 
30 0,0116 0,0058 
40 0,0215 0,01075 
60 0,0213 0,01065 
80 0,0262 0,0131 
100 0,0284 0,0142 
200 0,0237 0,01185 
Tabela 3: Velocidades da reação 
 
y = 0,0237x + 0,1625
R² = 0,9153
0,000,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 1 2 3 4 5 6
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
200 g/L Sacarose
Série1
Série2
Linear (Série1)
 12 
 Determinadas as velocidades da reação, é possível aplicar a linearização de 
Lineweaver-Burk. 
 Os parâmetros necessários para a linearização estão na seguinte tabela: 
Concentração meio 
(S) 
1/S Velocidade (v) 1/v 
5 0,2 0,00095 1052,6316 
10 0,1 0,0068 147,0588 
20 0,05 0,00805 124,2236 
30 0,033333 0,0058 172,4138 
40 0,025 0,01075 93,0233 
60 0,016667 0,01065 93,8967 
80 0,0125 0,0131 76,3359 
100 0,01 0,0142 70,4225 
200 0,005 0,01185 84,3882 
Tabela 4: Parâmetros linearização Lineweaver-Burk 
 
 Obtém-se, portanto, o seguinte gráfico para a linearização: 
 
Gráfico 11: Linearização de Lineweaver-Burk 
y = 777,59x + 74,132
R² = 0,9067
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
180,0
200,0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
1
/v
1/S
Linearização Lineweaver-Burk
Série1
Série2
Linear
(Série1)
 13 
 Pela análise do gráfico, determinaram-se as constantes cinéticas da reação: 
KM/vmáx 777,59 
1/vmáx 74,132 
Vmáx (g/(L.min)) 0,013489 
KM (g/L) 10,489262 
Tabela 5: Constantes cinéticas da reação 
 
 Determinadas as constantes, é possível traçar o gráfico correspondente à cinética 
de Michaelis-Mentes para a reação de hidrólise da sacarose pela ação da invertase. 
 
Gráfico 12: Cinética de Michaelis-Menten 
 
 A relação entre a velocidade inicial da reação e o aumento da concentração 
aumenta, mas não de forma linear. Esta, tende a estabilizar com recurso a soluções com 
maior concentração de enzima. Tal é verificado pela cinética de Michaelis-Menten, como 
demonstrado graficamente, confirmando o sucesso da atividade experimental. 
• Cálculo da atividade especifica da enzima: 
 
𝑎𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = 
𝑔 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜
𝑔 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
 x min 
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0 50 100 150 200 250
v
S
Cinética de Michaelis-Menten
 14 
vmáx = 0,013489 g/(L.min) 
Ce = 2% (p/v) 
2 g -------- 100 mL 
x g -------- 1000 mL 
x = 20 g/L 
 
𝑎𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = 
0,013489 𝑔/(𝐿.min)
20 𝑔/𝐿
 x min = 0,00067445 
 
3.2. Ensaios com células imobilizadas 
 A reação de hidrólise da sacarose foi conduzida a 45ºC. As soluções de substrato 
foram preparadas em tampão acetato com pH 7,5. 
 Os valores das absorvâncias medidas a 540 nm no espectrofotómetro estão 
representadas na seguinte tabela: 
Tabela 6: Abs a 540 nm 
Concentração 
Sacarose (g/L) 
Tempo (minutos) 
0 3 6 9 12 15 
10 0,068 0,094 0,121 (I) 0,135 (II) 0,137 (III) 0,152 
20 0,061 0,082 0,105 0,108 0,155 0,186 (IV) 
40 0,100 0,110 0,19 (V) 0,242 (VI) 0,174 0,155 (VII) 
60 0,181 0,172 0,184 (VIII) 0,250 0,277 0,344 
80 0,286 0,067 0,112 0,220 0,253 0,269 
100 0,133 0,124 0,223 0,198 0,325 0,390 
150 0,186 0,186 (IX) 0,236 (X) 0,292 (XI) 0,34 (XII) 0,393 (XIII) 
200 0,135 0,129 0,201 (XIV) 0,258 (XV) 0,285 0,367 (XVI) 
 Abs 540 nm 
 15 
Nota: I – 6,66 minutos VIII – 6,96 minutos 
 II – 9,96 minutos IX – 3,96 minutos 
 III – 12,58 minutos. X – 6,96 minutos 
 IV – 15,36 minutos XI – 9,96 minutos 
 V – 6,3 minutos XII – 12,96 minutos 
 VI – 9,28 minutos XIII – 15,96 minutos 
 VII – 15,36 minutos XIV – 15,36 minutos 
 
 
 Conhecidos os valores das absorvâncias, seguem-se os cálculos das concentrações 
de glucose e frutose. Para tal, recorre-se à novamente reta de calibração da glucose, gráfio 
1. 
 A equação da reta de calibração da glucose é expressa pela expressão: 
y = 1,8099𝑥 + 0,0418 (1) 
Onde y representa a concentração de glucose em g/L e x o valor da absorvância a 
540nm. Assim, as concentrações de glucose e frutose estão representadas na seguinte 
tabela: 
Tabela 7: Concentração glucose e frutose (g/L) 
Concentração 
Sacarose (g/L) 
Tempo (minutos) 
0 3 6 9 12 15 
10 0,16487 0,21193 0,26080 (I) 0,28614 II 0,28976 III 0,31690 
20 0,15220 0,19021 0,23184 0,23727 0,32233 0,37844IV 
40 0,22279 0,24089 0,38568 V 0,47980 VI 0,35672 0,32233 VII 
60 0,36939 0,35310 
0,37482 
VIII 
0,49428 0,54314 0,66441 
80 0,55943 0,16306 0,24451 0,43998 0,49970 0,52866 
100 0,28252 0,26623 0,44541 0,40016 0,63002 0,74766 
150 0,37844 0,37844 0,46894 X 0,57029 XI 0,65717 XII 0,75309 XIII 
200 0,28614 0,27528 
0,40559 
XIV 
0,50875 XV 0,55762 0,70603 XVI 
 Concentração glucose e frutose (g/L) 
 16 
Nota: I – 6,66 minutos VIII – 6,96 minutos 
 II – 9,96 minutos IX – 3,96 minutos 
 III – 12,58 minutos. X – 6,96 minutos 
 IV – 15,36 minutos XI – 9,96 minutos 
 V – 6,3 minutos XII – 12,96 minutos 
 VI – 9,28 minutos XIII – 15,96 minutos 
 VII – 15,36 minutos XIV – 15,36 minutos 
 
 
Seguem-se as representações gráficas, para da variação da concentração de 
glucose e sacarose ao longo do tempo, de forma a se determinarem as velocidades da 
reação para cada concentração de sacarose: 
 
Gráfico 14: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 10 g/L de sacarose 
y = 0,0096x + 0,1794
R² = 0,9498
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0 5 10 15 20
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
10 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
 17 
 
Gráfico 15: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 20 g/L de sacarose 
 
Gráfico 16: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 40 g/L de sacarose 
 
Gráfico 17: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 60 g/L de sacarose 
y = 0,0144x + 0,1433
R² = 0,9547
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0 5 10 15 20
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
20 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
y = 0,0128x + 0,2336
R² = 0,6442
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0 5 10 15 20
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
40 g/L Sacarose
Série1
Série2
Linear (Série1)
y = 0,0203x + 0,3108
R² = 0,8394
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0 5 10 15 20
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
60 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
 18 
 
Gráfico 18: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 80 g/L de sacarose 
 
Gráfico 19: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 100 g/L de sacarose 
 
Gráfico 20: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 150 g/L de sacarose 
y = 0,0329x + 0,0793
R² = 0,9237
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0 5 10 15 20
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
80 g/L Sacarose
Série1
Série2
Linear (Série1)
y = 0,0321x + 0,2212
R² = 0,8805
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 5 10 15 20
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
100 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
y = 0,0253x + 0,3245
R² = 0,9426
0,00
0,100,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 5 10 15 20
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
150 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
 19 
 
 
Gráfico 21: Variação da concentração ao longo do tempo no meio 200 g/L de sacarose 
 
 Uma vez que, a reação apresenta dois produtos, glucose e frutose, é necessário 
dividir o declive por dois para determinar a velocidade da reação. Tal é possível, devido 
à massa molar da glucose e da frutose ser igual e de se encontrarem na mesma proporção. 
 Assim, as velocidades da reação são apresentadas na seguinte tabela: 
Concentração do 
meio 
Declives Velocidade 
10 0,0096 0,0048 
20 0,0144 0,0072 
40 0,0128 0,0064 
60 0,0203 0,01015 
80 0,0329 0,01645 
100 0,0321 0,01605 
150 0,0253 0,01265 
200 0,0285 0,01425 
Tabela 8: Velocidades da reação 
 
Determinadas as velocidades da reação, é possível aplicar a linearização de Lineweaver-
Burk. 
y = 0,0285x + 0,2338
R² = 0,9525
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 5 10 15 20
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 (
g
/L
)
Tempo (minutos)
200 g/L Sacarose
Série1
Linear (Série1)
 20 
 Os parâmetros necessários para a linearização estão na seguinte tabela: 
Concentração meio 
(S) 
1/S 
Velocidade 
(v) 
1/v 
10 0,1 0,0048 208,3333 
20 0,05 0,0072 138,8889 
40 0,025 0,0064 156,25 
60 0,016667 0,01015 98,5222 
80 0,0125 0,01645 60,7903 
100 0,01 0,01605 62,3053 
150 0,00667 0,01265 79,0514 
200 0,005 0,01425 70,1754 
Tabela 9: Parâmetros linearização Lineweaver-Burk 
 
 
 Obtém-se, portanto, o seguinte gráfico para a linearização: 
 
 
Gráfico 22: Linearização Lineweaver-Burk 
 
 
 
 
y = 1328,9x + 80,17
R² = 0,8342
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
1
/v
1/S
Linearização Lineweaver-Burk
Série1
Série2
Linear (Série1)
 21 
 Pela análise do gráfico, determinaram-se as constantes cinéticas da reação: 
KMi/vmáxi 1328,9 
1/vmáxi 80,17 
Vmáxi (g/(L.min)) 0,012474 
KMi (g/L) 16,576026 
Tabela 10: Constantes cinéticas da reação 
 
 Determinadas as constantes, é possível traçar o gráfico correspondente à cinética 
de Michaelis-Mentes para a reação de hidrólise da sacarose pela ação da invertase. 
 
 
Gráfico 23: Cinética de Michaelis-Menten 
 
 
 A relação entre a velocidade inicial da reação e o aumento da concentração 
aumenta, mas não de forma linear. Esta, tende a estabilizar com recurso a soluções com 
maior concentração da enzima. Tal é verificado pela cinética de Michaelis-Menten, como 
demonstrado graficamente, confirmando o sucesso da atividade experimental. Porém, 
pela análise do gráfico podem observar-se desvios em certos pontos experimentais, 
devidos a erros de execução do operador ou possíveis mal funcionamentos dos aparelhos. 
• Cálculo da atividade especifica da enzima: 
 
𝑎𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = 
𝑔 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜
𝑔 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
 x min 
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
0,018
0 50 100 150 200 250
v
S
Cinética de Michaelis-Menten
 22 
vmáxi = 0,012474 g/(L.min) 
Ce = 2% (p/v) 
2 g -------- 100 mL 
x g -------- 1000 mL 
x = 20 g/L 
 
𝑎𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = 
0,012474 𝑔/(𝐿.min)
20 𝑔/𝐿
 x min = 0,0006237 
 
 
3.3. Cálculo Fator de Efetividade Global 
 
 A expressão que permite calcular o fator de efetividade global é: 
 
 
 (2) 
 
 
 
 Assim, os valores das velocidades, quer para células livres quer para imobilizadas 
e respetivo cálculo do fator de efetividade global, utilizando a expressão 2, são 
apresentados na seguinte tabela: 
 
 
 
 
 
 
 23 
Tabela 11: Fator de efetividade global 
 
 
 É necessário salientar que o fator de efetividade global apresenta, para algumas 
concentrações de sacarose, valores superiores a 1. Isto acontece devido à ocorrência erros 
experimentais, uma vez que o fator de efetividade global, teoricamente, está 
compreendido entre 0 – 1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Concentração meio 
(g/L) 
Velocidade C. Livres 
(g/L) 
Velocidade C. 
Imobilizadas (g/L) 
  
10 0,0068 0,0048 0,70588235 
20 0,00805 0,0072 0,89440994 
40 0,01075 0,0064 0,59534884 
60 0,01065 0,01015 0,95305164 
80 0,0131 0,01645 1,25572519 
100 0,0142 0,01605 1,13028169 
200 0,01185 0,01425 1,20253165 
 24 
4. Conclusão 
 
 A relação entre a velocidade inicial da reação e o aumento da concentração 
aumenta, mas não de forma linear. Esta, tende a estabilizar com recurso a soluções com 
maior concentração da enzima. Tal é verificado pela cinética de Michaelis-Menten, que 
em ambos os ensaios, foi comprovado. 
 Comparativamente, a velocidade máxima para a enzima na forma livre tende a ser 
superior à velocidade máxima para a enzima imobilizada. Obtiveram-se os valores de 
vmáx para as células livres 0,013489 g/(L.min) e de 0,012474 g/(L.min) para as células 
imobilizadas. Já para a constante KM, obteve-se o valor de 10,489262 g/L para as células 
livres e de 16,576026 g/L para as células imobilizadas. Estes resultados estão de acordo 
com o esperado, ainda que com ocorrência de erros experimentais. 
 A velocidade máxima é superior para células livres pois, a enzima na sua forma 
livre, está mais disponível para se ligar ao substrato e formar produtos do que na forma 
imobilizada. 
 A utilização de enzimas na forma imobilizada, ainda que apresente vantagens, 
vem com a possibilidade de ocorrência de efeitos de transferência de massa, 
conformacionais e de partição. 
 A escolha do tipo de células a utilizar dependerá de vários fatores e terá de ser 
feita uma análise/estudo sobre possíveis vantagens e desvantagens de forma a ser 
escolhido o tipo indicado ao processo. 
 
 25 
5. Bibliografia 
 
1) Cabral, J., Aires Barros, M. e Gama, M. (2003). Engenharia Enzimática. Lisboa: 
Lidel – Edições Técnicas 
 
2) Mareus, D. (0). Sebentas de Engenharia Enzimática. Acedido em ... em www.e-
learning.ipt.pt