ENZIMOLOGIA

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ENZIMOLOGIA
É o estudo das enzimas.
Enzimas: catalisadores das reações dos sistemas biológicos.
Catalisadores: moléculas que aceleram uma reação para atingir o equilíbrio, sendo regenerado no ciclo do processo. 
Características: atividade, seletividade e boa estabilidade ao longo do tempo de reação. 
 
 
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 Propriedades fundamentais dos catalisadores:
- Não altera a composição de equilíbrio nem o valor da 
constante de equilíbrio da reação.
- Não tem relação estequiométrica com os produtos 
formados.
- Diminui a energia de ativação da reação.
- O grau de aceleração da reação é função da concentração 
do catalisador.
 
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Histórico: Bioquímica X Enzimologia
1700 – estudos da digestão da carne por secreções do estômago
1833 – Payen e Persoz: conversão do amido em açúcar pela saliva
1850 - Pasteur descreve que leveduras catalisam conversão de açúcar em álcool “fermentos” - Vitalismo.
1878 – Kuhne cria o nome Enzima
en: dentro – zyme: levedura
1897 - Buchner provou que extratos de levedura convertiam açúcar em álcool 
Final do Vitalismo e início da Bioquímica
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1926 – J.B.Summer cristaliza a primeira proteína, urease e demonstra que a atividade enzimática é uma característica de moléculas definidas.
Quebra de paradigma nos estudos iniciais de enzimas: Toda enzima é uma proteína.
1930 - John Northrop e Wendell Meredith Stanley confirmaram as enzimas como proteínas pelo estudo da tripsina, quimotripsina e pepsina.
Década de 50 – séc. XX
– 75 enzimas → isoladas e cristalizadas;
– Ficou evidenciado caráter protéico.
 Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas.
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Vantagens da Utilização de Enzimas:
- Alta capacidade catalítica; 
- seletivas quanto ao substrato;
- atuam em condições de pH e temperatura moderadas;
- altamente específicas;
- biodegradáveis;
Seletividade: 
Quimiseletividade: atua em um único tipo de grupo funcional
Ex. a enzima que hidrolisa ligação éster não mostra nenhuma possibilidade de reação com o grupo aldeído
Regioseletividade: devido a sua estrutura tridimensional, enzimas distinguem os grupos funcionais situados em diferentes regiões da mesma molécula de substrato
Ex. enzima hidrolisa lig. α 1,6 e não α 1,3
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Algumas aplicações industriais de enzimas
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Enzimas
- Maioria das enzimas são proteínas.
 Exceto:
Ribozimas: pequenos RNAs com atividade catalítica: rompe ligação fosfodiéster de moléculas de RNA seletivamente. Participam do ciclo vital de alguns vírus Importantes no mundo pré-biótico RNA com múltiplas funções
 Abzimas: anticorpos catalíticos ou Cabs Reconhecem e se ligam não-covalentemente ao seu antígeno complementar e catalisam a quebra ou outras reações químicas que envolvem o antígeno
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Algumas enzimas requerem cofatores ou coenzimas para sua atividade
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Grupo prostético: cofatores ou coenzimas ligados covalentemente a enzima
Holoenzima: enzima cataliticamente ativa ligada ao seu íon metálico e/ou coenzima
Apoenzima ou apoproteína: parte protéica
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Classificação das enzimas: 
ATP + D-glicose → ADP + D-glicose 6-fosfato
Enzima: ATP:glicose fosfotransferase (hexoquinase)
Enzyme Commission number (E.C.number) é 2.7.1.1.
(2) Nome da classe: transferase
(7) Subclasse: fosfotransferase
 Fosfotransferase com um grupo hidroxil como aceptor
(1) D-glicose como aceptor do grupo fosforil
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Sítio ativo: local ou bolso da enzima onde ocorre a catálise enzimática
Substrato: molécula que se liga na enzima e é modificada por ela
Domínio catalítico da E
Outros domínios
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Reação enzimática
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Função da catálise: aumentar a velocidade da reação, mas não afeta equilíbrio da reação
Enzimas não afetam ΔG ou a Keq da reação
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Enzimas aumentam a velocidade das reações diminuindo a energia de ativação
Enzimas são altamente específicas: selecionam os substratos
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Para uma reação:
Constante de equilíbrio:
Relação entre ΔG°’ e K’eq
Velocidade da reação:
Quantidade de S que reage por unidade de tempo
k : constante de proporcionalidade - probabilidade da reação em condições específicas 
k: constante de reação de primeira-ordem (depende apenas de S): s-1
Relação entre constante de velocidade e energia de ativação
Relação inversa e exponencial
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Energia de ativação: quantidade de energia mínima necessária para uma molécula de S passar por um estado de transição e se tornar uma molécula de P.
É um ponto intermediário onde as ligações do S são modificadas o suficiente para possibilitar sua conversão em P.
Velocidade da reação depende do número de moléculas de S que alcançam o estado de transição por unidade de tempo.
Duas maneiras de aumentar a velocidade da reação:
- aumentar a temperatura
- abaixar a energia de ativação: enzimas
 
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Enzima participa da reação, mas não sofre transformação.
Poucas moléculas de E catalisam conversão de milhares de moléculas de S em P
Emil Fischer (1894) hipótese do modelo template ou chave-fechadura: sítio ativo da enzima é complementar em tamanho, forma e natureza química à molélula de S
Hipótese de Koshland (mais moderna): enzima flexível ou ajuste induzido: sítio ativo não precisa estar sob forma geométrica rígida, mas deve existir um arranjo espacial preciso e específico dos grupos R dos aa, o qual é induzido pelo contato com o S.
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Interações fracas entre e E e S são otimizadas no estado de transição
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Mudança conformacional na hexoquinase induzida pela ligação da glicose em seu sítio ativo, faz com que a enzima seja ativada.
Ajuste induzido
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Sítio ativo: ocupa pequena parte da molécula de E
Sítio ativo existe em torno de aproximadamente 12 aa em volta do bolso, destes apenas 2 ou 3 aa participam da ligação com S e catálise.
Por que as E são moléculas grandes ao invés de peptídeos pequenos?
Necessidade não apenas dos grupos R de ligação e catálise, mas também de distâncias fixas das ligações e dos ângulos - grupos R assumem relação espacial necessária.
Resíduos de aa catalíticos: centro catalítico
Resíduos de aa não-catalíticos: mantém estrutura terciária da enzima
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Qual é a fonte de energia para a redução da energia de ativação e aumento da velocidade das reações específicas catalisadas enzimaticamente?
	- ligações covalentes transientes entre grupos catalíticos ou íons metálicos do sítio ativo da enzima com a molécula do substrato
	- interações fracas entre enzima e substrato: ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e iônicas
Formação de ES: acompanhada de liberação de energia livre para estabilização do complexo
Energia derivada da formação ES: energia de ligação ΔG ligação
“Energia de ligação é a principal fonte de energia livre usada pelas enzimas para diminuir a energia de ativação das reações”
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Moderna noção de catálise enzimática foi primeiro proposta por Michael Polanyi (1921) e Haldane (1930), e elaborada por Linus Pauling in 1946: para catalisar uma reação, uma enzima precisa ser complementar ao estado de transição da reação.
Fatores responsáveis pela eficiência catalítica:
Proximidade
Orientação
Concentração de S no volume do sítio ativo
Sítios ativos das E permitem o alinhamento dos orbitais de S e dos grupos catalíticos de E de forma otimizada para entrar no estado de transição
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Múltiplas interações fracas entre E e S liberam energia livre (Energia de ligação) que diminui a Energia de ativação e dirige a catálise enzimática.
Energia de ligação também fornece a especificidade da enzima: capacidade de distinção entre a molécula de substrato e um análogo ou competidor.
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ES: grupos funcionais cataliticamente posicionados ajudam na clivagem e formação de ligações por vários mecanismos:
 Catálise ácido-básica: envolvetransferência de prótons
 Catálise covalente: envolve formação de ligação covalente transiente entre S e E
 Catálise por íon metálico: envolve interação entre ion metálico ligado a enzima e S
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Cinética Enzimática
- Ramo da Enzimologia que estuda os fatores que afetam a velocidade das reações catalisadas por enzimas.
Fatores mais importantes: 
- Concentração de enzima
- Concentração de ligantes (Substrato, Inibidor, Ativador)
- pH
- Força iônica
- Temperatura
Análise cinética → Modelo da reação → Equação de velocidade
Teste experimental
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Sistema Unirreacional Simples 
Reação enzimática mais simples: substrato único se transforma em produto único ( Sistema Uni Uni )
ES e EP complexos centrais
Simplificando: apenas um complexo central
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Considerando:
Velocidade inicial da reação no sentido de formação de produto: Baixa concentração de produto acumulado
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Reação pode 
ser escrita como:
 
Equação de velocidade pode ser deduzida por dois caminhos:
1- Tratamento em Condições de Equilíbrio Rápido (Henri, Michaelis e Menten)
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Se:
 [E]T = [E] + [ES]
V = K2 [ES]
Dividindo: V = K2 [ES] 
 [E]T [E] + [ES]
No equilíbrio: Ks (constante de dissociação de ES)
Ks = K-1 = [E] [S] [ES] = [E] [S] 
 K1 [ES] Ks
Substituindo para [ES], multiplicando primeiro termo por 1/K2 e cancelando [E]:
 V = [S]/ Ks 
 K2 [E]T 1 + [S]/Ks
 
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Se: V = K2 [ES], então K2 [E]T = Vmax
Vmax quando toda enzima estiver presente sob forma de ES
 __V__ = [S] / Ks V = V0 
 Vmax 1 + [S] / Ks
 __V0__ = __[S]__ ou V0 =_ Vmax [S]_
 Vmax Ks + [S] Ks + [S]
Equação de Henri, Michaelies e Menten: fornece a velocidade instantânea ou inicial relativa a Vmax para uma dada [S]
Equação só é válida se V = V0, velocidade medida num tempo pequeno o suficiente para que [S] permaneça praticamente constante. Não mais que 5% do substrato deve ser usado durante o tempo de ensaio.
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2- Tratamento em Condições de Estado Estacionário (Briggs e Haldane)
Se velocidade com que ES forma E + P é rápida quando comparada a velocidade com que ES se dissocia em E + S
E, S e ES não estão em equilíbrio
Se [S] >>>>>[E]
Após mistura de E e S será estabelecido um estado estacionário
Estado estacionário: [ES] permanece constante 
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Equação de velocidade:
V = K2 [ES]
Dividindo: V = K2 [ES] 
 [E]T [E] + [ES]
Se ES é constante: 
Vel de formação de ES = Vel decomposição d ES
k1 [E] [S] = k-1 [ES] + k2 [ES]
k1 [E] [S] = (k-1 + k2 ) [ES] [ES] = k1 [E] [S] 
 (k-1 + k2 )
Grupo de 3 constantes de velocidade pode ser definido por uma única constante: Km (constante de Michaelis)
Km = k-1 + k2 [ES] = [S] [E] 
 k1 Km
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Substituindo na equação de velocidade:
 __V__ = [S] / Ks 
 Vmax 1 + [S] / Ks
 V = _ [S]_
Vmax Km + [S] 
V0 =_ Vmax [S]_
 km + [S] 
Forma da equação de velocidade deduzida no estado estacionário é idêntica a deduzida para condições de equilíbrio rápido.
Apenas as constantes de velocidade são diferentes.
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Constante de Michaelies, Km, expressa a relação entre as concentrações reais no estado estacionário ao invés de concentrações no equilíbrio.
Km = k-1 + k2 = [S] [E] 
 k1 [ES] 
Se k2 é muito pequeno comparado a k-1
Km se reduz a Ks 
Km função mais complexa: composta pelas constantes de velocidade de todas as etapas da reação
Km relaciona a velocidade da reação com a [S] 
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Cinética enzimática
E + ↑[S] : pre–steady state (curto - μs)
	 steady state : [ES] constante
Equação de Michaelis-Menten:
Quando 
Efeito da [S] na velocidade da reação catalisada enzimaticamente
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Dependência entre Vo e [S]
Por que determinar a Km ?
Em ↓ [S], Km > >[S] 
V0 muito sensível variação S
[S] no denominador torna-se insignificante 
V0 = Vmax [S] /Km
V0 < < < Vmax
Potencial catalítico de E desperdiçado
 
Em ↑ [S], [S] > > Km 
Km no denominador torna-se insignificante 
V0 = Vmax
V0 não pode exceder Vmax
Diferença entre V0 a [s] = Km e V0 a [s] = 1000Km é de 2x
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Km é uma constante para uma dada enzima e seu valor numérico fornece um meio de comparação entre enzimas
	Km = k-1 + k2 
 	k1 
Vmax depende da [E] na reação, portanto não é uma constante
k2 [E]T = Vmax
- Se conhece o valor de Km pode-se ajustar as condições da reação de modo que [S] > Km e assim determinar Vmax
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A que fração de Vmax se chega quando:
[S] = 4 Km [S] = 5 Km [S] = 6 Km [S] = 10 Km
Para a reação enzimática, calcule Vmax e Km
Qual seria a V para [S] = 2,5 10-5 M e a [S] = 5,0 10-5 M?
Qual seria a V para [S] = 5,0 10-5 M e se a concentração da enzima fosse o dobro?
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Vmax é raramente medido: Não é possível adicionar quantidade suficiente de substrato para saturar a enzima
Então como determinar Vmax e Km?
Duplo recíproco da equação de Michaelis-Menten ou Equação de Lineweaver-Burk
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Equação linear: Y = aX + b 
Y = 1 X = 1
 V0 [S]
Inclinação = Km
 Vmax
Intercepto = 1
 Vmax
Qdo: 1 = 0
 [S]
 1 = 0
 V0 
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Para cálculo de Km e Vmax corretos:
[S] deve ser próxima ao valor de Km
[S] muito alta: curva horizontal
Permite calcular Vamx mas inclinação próxima de 0. Difícil determinar Km com precisão
[S] muito baixa: curva intercepta os eixos próximos da origem. Não permite determinar Vmax e Km com precisão.
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Gráfico recírproco de Lineweaver-Burk : diagnóstico primário
Críticas: 
- aumentos iguais de [S] que fornecem pontos igualmente espaçados no gráfico V x [S] não fornecem pontos igualmente espaçados no duplo-recíproco
- pequenos erros na determinação de V serão maiores quando calcula seus recíprocos
Outros gráficos lineares podem ser mais adequados para fornecer estimativas mais precisas dos valores de Km e Vmax
Gráfico de Hanes-Woolf: [S]/ V x [S]
Gráfico de Woolf-Augustinsson-Hofstee: V x V/[S]
Gráfico de Eadie-Scatchard: V/[S] x V
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Número de Turnover ou Número de Renovação – Kcat
Atividade molecular ou molar: número de moles de substrato transformado por min por mol de enzima sob condições ótimas
Considerando que muitas enzimas são oligômeros com muitas subunidades ativas: número de moles de substrato transformado por min por mol de subunidade ativa ou centro catalítico
Quando enzima está saturada: maioria na forma EP
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Constante de especificidade: compara a eficiência catalítica de diferentes enzimas - kcat/Km 
Taxa de conversão de ES para EP
Quando [S] < < < Km
se reduz a 
V0 dependerá de Et e S
kcat/Km: M-1 s-1
Limite superior de kcat/Km depende da taxa com que E e S podem difundir juntos no sistema aquoso
Limite: 108 - 109 M-1s-1
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Inibição enzimática
Classes de inibidores: 
 Irreversíveis
 Reversíveis 
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Inibições Reversíveis
Inibição Competitiva
Na presença do inibidor:	Vmax constante
			KM ap aumenta
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Enzima distribuída entre três espécies diferentes:
[E]t = [E] + [ES] + [EI]
Vmax não é afetado pelo inibidor competitivo
Kmap é aumentado 
EI nãoapresenta afinidade por S
E não altera afinidade por S
Aumento de Km resulta da distribuição da E entre as formas de afinidade total (E) e nenhuma afinidade (EI)
A medida que [I] aumenta:
Kmap aumenta
Vmax permanece a mesma, embora na presença do inibidor competitivo, maior [S] é necessária para atingir qualquer fração de Vmax
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Inibição Competitiva
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Inibição Competitiva – Duplo-recíproco
Eixo x
-1 (sem I) 
Km
-1 
Km (1 + [ I ] ) (com I)
 Ki 
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Ki – constante de inibição
Equivale a [I] que duplicará a inclinação do gráfico 1/v x 1/[S]
Calculado no gráfico dos duplos recíprocos:
Interseção no eixo x: -1 / Km (1 + [ I ] ) 
 Ki 
 
Inclinação da reta : Km (1 + [ I ] ) / Vmax
 Ki 
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Na presença do inibidor:	Vmax diminui
			KM ap diminui do mesmo valor
Inibição Acompetitiva - Incompetitiva
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Inibição acompetitiva rara em sistemas unirreacionais, mas comum em sistemas multirreacionais
Para qualquer [I]:
[S] infinitamente grande não levará E a forma ES, ESI não produtivo estará sempre presente
Assim: Vmax diminui na presença do inibidor
 Kmap diminui (ES + I → ESI utiliza parte de ES,
 E + S → ES mais para direita) 
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Inibição Acompetitiva – Duplo-recíproco
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Na presença do inibidor:	Vmax diminui
			KM ap constante
 Inibição não-competitiva
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Inibidor não competitivo não tem efeito na ligação do S a E
S e I se ligam a E de forma reversível, aleatória e independente em sítios diferentes
I se liga a E e a ES
S se liga a E e a EI
Em qualquer [I]:
[S] infinitamente alta não consegue levar toda E a forma ES
parte de E ficará na Forma ESI não produtiva
Vmax diminui
Km permanece constante
Para qualquer [I], E e EI que podem ligar-se a S, apresentam a mesma afinidade por S
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Inibição não-competitiva
Expressão complexa contendo termos quadráticos 
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Inibição não-competitiva – Duplo-recíproco
 
α = α’ 
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Inibição não-competitiva clássica só é obtida em condições de equilíbrio rápido
Km = Ks
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Inibição mista linear 
Uma forma de inibição não-competitiva
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Inibição mista-linear – Duplo-recíproco
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Inibidor Competitivo – Dixon plot
111/v
[I]
- Ki
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Salicilato (aspirina) inibe a ação catalítica da glutamate desidrogenase. 
Plotar os dados: 1) v x [S] e 2) 1/v x 1/[S] em um gráfico. 
Estimar os valores de Vmax e Km na presença e ausência deste inibidor.
Determine o tipo de inibição (competitiva ou não competitiva)
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Outro tipo de inibidor da glutamate desidrogenase foi testado. Fazer os mesmos calculos para este inibidor. Determine o tipo de inibição ( competitiva ou não-competitiva).
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Voce purificou uma nova enzima e quer determinar suas propriedades cinéticas na presença e ausência de dois inibidores (I-1 e I-2).
Condições experimentais: Volume de reação 1 ml, pH 7,5, 0.1 M KCl; concentração de substrato 1-20 mM; quantidade de enzima 0,2 micrograma (MM determinada por SDS-PAGE 100.000 g/mol); co- substratos adicionados em excesso; tempo de incubação 5 min a 25°C.
Dados obtidos:
A. Construa o gráfico  v vs [S] e estime os valores de Km e Vmax para cada conjunto de dados. Que tipo de competidores são I-1 and I-2?
B. No gráfico 1/v and 1/[S], determine Km and Vmax para cada conjunto de dados. Compare com os dados obtidos em A.
C. A partir de Vmax da enzima sem inibidor, voce pode estimar o turnover number em moléculas/seg?
D. Para fazer um ensaio com esta enzima, qual a concentração de substrato voce usaria?
 
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Uma enzima tem Km de 4,7 10-5 M. Se a Vmax da reação é 22 μmoles L-1 min-1, qual seria a velocidade observada em presença de substrato 2 10-4 M e 5 10 -4 M de um 
a) inibidor competitivo, 
b) inibidor não-competitivo 
c) inibidor acompetitivo. 
O Ki em todos os casos é 3 10-4 M.
d) qual é o grau de inibição nos três casos?
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Para cada um dos seguintes conjuntos de dados foi feito o gráfico dos duplos recíprocos.
A. Qual é o tipo de inibidor?
B. Quais são os valores de Vmax e Km para a enzima não inibida?
C. Qual é o Kcat para esta enzima? Ela é uma enzima eficiente?
D. Qual é o Ki para este inibidor?
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Efeito do pH e temperatura na atividade enzimática
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Enzimas regulatórias
Enzimas alostéricas: 
 Ligações não-covalentes reversíveis com moduladores ou efetores alostéricos: positivo ou negativo
 Modificação covalente
Enzimas alostéricas:	multisubunidades
				sítio(s) regulatório(s)
				sítio ativo
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Alterações conformacionais em resposta a ligação de um modulador
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Inibição por Feedback, ou pelo produto
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Sigmóide: cooperatividade entre subunidades
A- enzima alostérica homotrópica: substrato é o modulador positivo (mesmo sitio ativo e regulatório)
B e C- enzimas alostéricas heterotrópicas
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Enzimas regulatórias moduladas por modificação covalente
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Exercícios
1 – Defina os níveis de organização estrutural de uma proteína globular com duas subunidades e as principais forças que mantém a estabilidade destas estruturas. 
2 – Quais são os efeitos da variação de pH e de temperatura na estrutura e na atividade biológica de uma proteína?
3 – Relacione: enzima, substrato, estado de transição, energia de ativação, energia de ligação, catálise.