Prática 8= Titulação potenciométrica de um aminoácido; Prática 3 - Preparo e função da solução tampão

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UFES/ CCENS/ DFN05450 – BIOQUÍMICA 
 
 8. TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE UM AMINOÁCIDO
8.1 INTRODUÇÃO
 Os aminoácidos são os principais constituintes das moléculas proteicas. Eles apresentam em sua constituição dois grupos funcionais característicos, o carboxílico (-COOH) e o amínico (-NH2), podendo apresentar ainda outros grupos (Figura 8.1).
 Figura 8.1 - Fórmula geral de um aminoácido.
A - Comportamento Ácido-Básico dos Aminoácidos
 O conhecimento do comportamento ácido básico dos aminoácidos é essencial para a compreensão dos diferentes métodos para os separar; os identificar e os quantificar.
 Devido aos grupamentos da molécula, os aminoácidos podem existir, em solução aquosa, sob três formas (Figura 8.2). Por isso, eles podem agir como ácidos (doadores de prótons) ou como bases (receptores de prótons).
 Carga + Carga 0 (ponto isoelétrico) Carga -
 Figura 8.2 - Formas assumidas pelos aminoácidos em solução aquosa.
 Em soluções aquosas diluídas, os ácidos e as bases fortes estão totalmente ionizados. Entretanto, o mesmo não ocorre com os ácidos e bases fracos, que estão parcialmente ionizados. A equação 1 representa a ionização de um ácido fraco e a equação 2, a constante de equilíbrio (K).
 HA ↔ H+ + A- Equação1 K = [H+] [A -] Equação 2
 [HA]
 A equação 2 pode ser representada de outra maneira:
[H+] = K [HA] Equação 3
 [A-]
 Multiplicando ambos os termos da equação 3 por - log tem-se a equação 4:
- log [H+] = - log K - log [HA] Equação 4
 [A-]
	
 O pH é definido como o negativo do logaritmo da concentração de H+ (pH = - log [H+]) e a constante pK, como o negativo do logaritmo da constante de equilíbrio (pK = - log K). Assim, tem a equação 5:
 pH = pK + log [ A-] Equação 5 
 log [ácido] 
 
 Chega-se, portanto, à equação de Henderson-Hasselbalch, outra maneira de se expressar a constante de dissociação de um ácido. 
pH = pK + log [sal] ou pH = pK + log [forma desprotonada] Equação 6
 log [ácido] [forma protonada]
Por meio dela, se pode visualizar melhor o conceito de pK (medida da tendência de um grupo ionizável em doar ou receber prótons):
Se [sal] = [ácido]
pH = pK + log 1
pH = pK
 
 Portanto, pK corresponde ao valor de pH, em que a concentração da forma protonada é igual à concentração da forma desprotonada. 
O ponto isoelétrico dos aminoácidos pode ser calculado por meio dos valores de pK dos grupamentos carboxílicos, amínicos e do grupo R. Como exemplo veja a titulação da glicina (Tabela 8.1). 
 Como pode ser observado, na titulação da glicina solubilizada em meio fortemente ácido (ponto1), o aminoácido apresenta carga positiva. Com a adição de base até o pH 2,34 (ponto 2), tem-se concentrações iguais da forma protonada (-COOH) e não protonada (-COO-) do grupo -carboxílico. Este valor de pH corresponde ao pK do grupo -carboxílico ou pK1. Continuando a adição de base, o pH 5,97 é atingido, onde existe igualdade de cargas (ponto 3). Neste ponto, o ponto isoelétrico, a carga líquida do aminoácido é zero e corresponde a um pH cujo valor é a média aritmética dos valores de dois pKs, no caso pK1 e pK2. Após a adição de mais base, o pH atinge o valor 9,6, que é o pK do grupo -amínico ou pK2, onde as concentrações da forma protonada (-NH3+) e desprotonada (-NH2) são novamente iguais (ponto 4). Se a titulação continuar até um valor de pH maior que o pK2, como no ponto 5, o grupo - amínico das moléculas será desprotonado e o aminoácido ficará com carga negativa.
Tabela 8.1- Titulação da glicina
	pH
	Ponto
	Formas iônicas predominantes
	1,00
	1
	
	
100%
	2,34
	2
	pK1
	
50% 50%
	5,97
	3
	pI
	
100%
	9,60
	4
	pK1
	
50% 50%
	12,00
	5
	
	
100%
 Observe a figura 8.3, onde está representada a curva de titulação do ácido acético com hidróxido de sódio. Existe uma região onde a solução de ácido acético resiste à variação de pH diante da adição de hidróxido de sódio. Neste intervalo, a região próxima do valor de pK, existe uma mistura das formas acetato/ácido acético, isto é, uma mistura das formas protonadas e desprotonadas ou, ainda, uma mistura de um ácido fraco com seu sal de base forte. Portanto, H
 Figura 8.3 - Curva de titulação do ácido acético 
 (Fonte: Princípios de Bioquímica, Lehninger, Nelson e Cox; 2002).
nesta região a curva mostra a existência de uma solução tampão. Os aminoácidos simples, que possuem apenas um grupo amino e um grupo carboxílico, apresentam duas regiões tamponantes próximos aos pKs dos dois grupos.
8.2 OBJETIVO GERAL
 Ao final da prática, o estudante deverá entender o comportamento ácido-básico dos aminoácidos e, por meio da curva de titulação, determinar os valores de pK de um aminoácido.
8.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Representar na forma logarítmica a constante de dissociação de um ácido;
b) Entender o conceito de pK;
c) Identificar, pelos valores de pK, os grupamentos ionizáveis de um aminoácido;
d) Calcular o pI de um aminoácido e sua carga em vários valores de pH;
e) Determinar, experimentalmente, os valores de pK da glicina pela curva de titulação;
f) Resolver exercícios que envolvam pH e soluções tampões.
7.4 MATERIAL NECESSÁRIO
Béquer de 50 e 100 mL; Funil
Bureta de 25 mL; Barra magnética
Pipeta de 5 mL Potenciômetro e eletrodo combinado
Agitador magnético
Solução de glicina a 0,1 mol L-1.
Solução de NaOH a 0, 5 mol L-1.
HCl concentrado.
8.5 PROCEDIMENTO
1) Com uma bureta, transfira 50 mL de solução de glicina a 0,1 mol L-1 para um béquer de 100 mL.
2) Coloque uma barra magnética no béquer e leve-o ao agitador.
3) Coloque o eletrodo na solução de glicina e adicione aproximadamente 0,6 mL de HCl concentrado ou volume suficiente para atingir pH próximo de 1.
4) Titule a solução de glicina com hidróxido de sódio a 0,5 mol L-1 , com auxílio de uma bureta.
5) Adicione de 1 em 1 mL, solução de hidróxido de sódio e anote abaixo os valores de pH obtidos.
Volume de NaOH (mL)
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Volume de NaOH (mL)
pH
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
8.6. RESULTADOS E CONCLUSÕES
 Faça a curva de titulação da glicina. Para isso, construa um gráfico de pH (ordenada) x volume de NaOH (abscissa) em papel milimetrado. Assinale na curva, os valores de pK e pI
contidos na literatura e as faixas de pH tamponante da glicina. Escreva as fórmulas da glicina nos valores de pH 1; 2,34; 5,97; 9,60 e 12 e determine sua carga líquida em cada ponto.
8.7 EXERCÍCIOS 
 1) A lisina tem três grupos ionizáveis: pK1 = 2,2; pK2 = 9,2; pKR = 10,8. 
a)Faça a curva de titulação da lisina e indique seus três valores de pK. 
b)Escreva a estrutura da lisina e a carga líquida da molécula em cada estado de ionização. 
c) Calcule o pI da lisina.
d)Quando se usa a lisina como tampão, quais os pontos da curva de titulação representam os piores valores de pH para a capacidade tamponante? Quais são as espécies predominantes nesses valores de pH
2) Pesquisar os valores de pK dosaminoácidos no quadro 3.1 do Lehninger: aspartato, tirosina e cisteína. b) Escreva a estrutura de cada aminoácido em pH 1 . c) Esquematize a curva de titulação e indique seus três valores de pK. d)Dê a carga líquida da molécula em cada estado de ionização.e) Calcule o pI f) Dê a carga de cada aminoácido no pH 3, 7 e 11.
g)) Identifique as faixas tamponantes .
3) Montar a estrutura do dipeptidio: tirosinil-aspartato em pH1. b) Esquematize a curva de titulação e indique seus valores de pK. c)Dê a carga líquida da molécula em cada estado de ionização. d) Calcule o pI e) Dê a carga de cada aminoácido no pH 3, 7 e 11.f)Identifique as faixas tamponantes.
NOTA :Rever os conceitos de aminoácidos, ligação peptídica, e estudar o carater anfotéro dos aminoácidos., no cap 3 do livro texto.
 
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3. PREPARO DE SOLUÇÕES
3.1 OBJETIVOS GERAL
Ao final da prática, o estudante deverá ser capaz de preparar soluções e entender a função da solução tampão.
3.2 SOLUÇÕES 
As soluções são definidas como misturas homogêneas de duas ou mais substâncias puras. Em geral, o componente de uma solução presente em maior quantidade é chamado de solvente e o que está em menor quantidade é chamado de soluto. Entretanto, esta regra não é válida para todos os casos. Nas soluções de sólidos em líquidos, o líquido é tomado comumente como solvente e o sólido como soluto, independentemente das proporções relativas de cada um. Assim, podemos ter soluções de sacarose em água a 10 % e a 60 % e, em ambos os casos, a água ser considerada como solvente e a sacarose como soluto.
Expressões da Concentração das Soluções
Solução molar ou mol L-1 é o número de moles do soluto (n) em 1 litro de solução. É representada por 1 M ou M. Pode haver múltiplos ou submúltiplos da massa molecular como 2 M ; 4 M; 0,1 M; 0,2 M . Uma solução M de cloreto de sódio contém 58,5 g (massa molar) do sal, em um litro. Uma solução 2 M conterá 2x58,5g = 117 g. Uma solução 0,1 M conterá 5,85 g.
Solução porcentual. Os três tipos abaixo resultam da definição das quantidades por massa ou por volume entre o soluto e solvente: 
1) % p/v é a porcentagem em peso por volume e corresponde à massa em gramas de soluto em 100 mL de solução. 2) % v/v é a porcentagem em volume por volume e corresponde ao volume em mililitros de soluto em 100 mL de solução. 3) % p/p é a porcentagem em peso por peso e corresponde à massa em gramas de soluto em 100 g de solução.
b) Soluções tampão 
Tampões são soluções que resistem a variações de pH. São constituídos de ácidos fracos e seus sais ou de bases fracas e seus sais. Ex.: tampão acetato (ácido acético + acetato de sódio). 
MECANISMO DE AÇÃO 
Se ao tampão acetato se adicionar um ácido forte como o HCl, haverá formação de um sal neutro e de um ácido fracamente ionizado, e o pH da solução permanecerá quase o mesmo. 
Tampão
Ácido acético: CH3COOH 
Acetato de sódio: CH3COONa + HCl ↔ NaCl + CH3COOH 
 (ácido forte) (sal neutro) (ácido fraco) 
Se ao mesmo tampão adicionarmos uma base forte como o hidróxido de sódio, haverá formação de acetato de sódio (menos alcalino que o NaOH) e água. Também neste caso o pH quase não se modificou. 
Tampão (base forte) (sal menos alcalino)
Ácido acético: CH3COOH + NaOH ↔ CH3COONa + H2O 
Acetato de sódio: CH3COONa 
Tampões Fisiológicos 
Um dos mecanismos da manutenção do pH dos líquidos celulares é devido à ação de tampões. Os principais tampões são os que estabilizam o pH do sangue na faixa de 7,35 a 7,45 , o tampão bicarbonato/ácido carbônico e a hemoglobina, e o tampão fosfato nas células. A manutenção deste pH é importante porque alteração de pH afeta a estrutura das moléculas ionizáveis e assim sua função celular. 
3.3 PROCEDIMENTOS
1- Procedimentos com tampões. 
1- Numere quatro frascos Béquer e distribua os líquidos abaixo: 
Frascos Béquer 1 e 2: 25 mL de água destilada 
Frascos Béquer 3 e 4: 25 mL de solução tampão acetato 0,1 M pH 5. 
2-Meça com papel indicador o pH aproximado dos líquidos dos 4 frascos Béquer. 
3-Anote o resultado no quadro a seguir. 
4- Aos frascos Béquers1 e 3 adicione em cada, duas gotas de HCl 50%. 
5-Aos frascos de béquer 2 e 4 adicione em cada, uma gota de solução de NaOH 50%. 
6- Misture com leve agitação. 
7-Meça com papel indicador o pH dos líquidos em cada béquer e anote no quadro abaixo:
	Béquer ( 25 mL)
	pH inicial 
	pH após HCL
	pH após NaOH
	Diferença de pH
	1 -H2O
	
	
	xxxxxxxxxxxx
	
	2 - H2O
	
	xxxxxxxxxxxx
	
	
	3 –Tampão acetato
	
	
	xxxxxxxxxxxx
	
	4- Tampão acetato
	
	xxxxxxxxxxxx
	
	
8 -Conclusão :1) Baseado nos resultados acima discuta sobre a variação de pH nos frascos béquer 3 e 4 em relação aos frascos 1 e 2?
2) Discuta a função da solução tampão, a composição dessa solução e como mantem o pH sem grandes alterações quando adicionas ácido ou base à solução.
3.4 REVISÃO DE CONCEITOS QUÍMICOS
Definição de Massa Atômica: é um número que indica quantas vezes a massa de um átomo de determinado elemento químico é maior que a massa de 1/12 do isótopo do carbono 12.
Definição de Massa Molecular: a massa molecular de um composto é a soma de todas as massas atômicas dos átomos da molécula, expressa em “unidades de massa atômica (u)”.
Exemplo: A massa molecular da sacarose (C12H22O11) é igual a 342,308 u.
“O mol é a quantidade de matéria de um sistema que contém tantas entidades elementares (átomos, moléculas, elétrons, etc.) quanto são os átomos contidos em 0,012 kg do isótopo do C 12”.
1 mol = 6,02 x1023 (NÚMERO DE AVOGADRO) entidades elementares = X g;onde X = massa (atômica), molecular, fórmula, etc., da entidade elementar expressa em gramas (g).
Exemplo: Um mol de sacarose (6,02 x 1023 moléculas) é igual a 342,308 g. O milimol (mmol) é igual a 0,001 mol e o micromol (mol) é igual a 0,001 mmol ou 10-6 mol.
A massa molar (M) de uma determinada entidade (átomos, moléculas, fórmulas, etc.) é a massa correspondente a um mol da referida entidade. 
Exemplo: A massa molar da glicose é igual a 180 g mol-1.
A quantidade de matéria (n), expressa em mol, de uma determinada substância é igual a razão entre esta massa medida e a sua massa molar. Ela é também conhecida como número de mol: