Primeira Prova - Bioquimica II (Resumo) docx

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METABOLISMO DO DNA (pág. 722)
Terminologia
Genes: três letras minúsculas e em itálico – refletem a função do gene
Exemplo: dna: replicação do DNA; uvr: resistência aos efeitos danosos.
Grupos de genes que afetam o mesmo processo: A, B, C
Proteína mantém o nome do gene: dna A Dna A
Replicação do DNA 
Regras fundamentais
A replicação do DNA é semiconservativa – Cada fita do DNA funciona como um molde para a síntese de uma nova fita, produzindo duas moléculas de DNA, cada uma com uma fita nova e uma fita velha.
Replicação começa na origem e cresce bidirecionalmente – Em ambas as extremidades da alça de DNA, existem as forquilhas de replicação, onde o DNA parental está sendo desenrolado, e as fitas separam rapidamente replicadas simultaneamente e bidirecional. As alças de replicação se iniciam sempre em um único ponto, chamado de origem.
A síntese do prossegue na direção 5’3’ e é semidescontínua – Uma nova fita de DNA é sempre sintetizada na direção 5’3’, com a extremidade 3’ livre sendo o local onde o DNA é alongado. Pelo fato de as duas fitas do DNA serem antiparalelas, a fita que atua como molde está sendo lida da sua extremidade 3’ para a 5’.
Uma das fitas de DNA é sintetizada em pedaços pequenos, os fragmentos de Okazaki. Com isso, chegou-se à conclusão que uma fita é contínua (ou fita líder), e a outra é descontínua (ou fita atrasada).
Nucleases ou Dnases: são as enzimas que degradam o DNA, e podem ser exonucleases (degrada a partir de uma extremidade da molécula) ou endonucleases (podem começar a degradar em qualquer local, reduzindo-a a fragmentos cada vez menores).
Síntese do DNA
DNA polimerase – A DNA polimerase trás um nucleotídeo contendo trifosfato, que vai reagir com o grupamento OH livre, formando uma ligação fosfodiéster, “juntando” o nucleosídeo e liberando um difosfato que sobrou.
(dnMP)n + dnTP (dnMP)n+1 + PPi
A DNA polimerase necessita de dois requerimentos: Um molde (a reação de polimerização é guiada por uma fita molde de DNA de acordo com as regras de pareamento de bases; também para que ocorra pontes de hidrogênio) e de um iniciador (um segmento da fita nova, que é complementar ao molde, com OH 3’ livre, ao qual os nucleotídeos podem ser adicionados. Os iniciadores são oligonucleotídeos de RNA sintetizados quando forem requeridos).
Grau de fidelidade da replicação é muito alto, ocorrendo apenas um erro a cada 109 ou 1010 nucleotídeos adicionados, pois a DNA polimerase faz uma seleção dos nucleotídeos e possui uma atividade exonucleásica 3’ 5’ revisora (se um nucleotídeo foi adicionado erroneamente, a replicação para, a atividade exonuclease 3’ 5’ remove o nucleotídeo despareado e a polimerase começa novamente).
DNA Polimerase I – Realiza função de limpeza durante a replicação, a recombinação e o reparo, (atividade exonucleásica 5’3’), podendo substituir um segmento do DNA (ou RNA) pareado a uma fita molde.
DNA Polimerase II – Envolvida no reparo do DNA.
DNA Polimerase III – É a principal enzima da replicação.
Etapas da replicação
Proteínas e enzimas para a iniciação 
Proteína Dna A – reconhece a Ori e abre a dupla hélice;
Proteína Dna B (helicase) – desenrola o DNA;
Proteína Dna C – liga um dímero de Dna B na origem;
Proteína HU – estimula a iniciação;
Primase – sintetiza iniciadores de RNA;
SSB – liga-se às fitas simples para estabiliza-las;
DNA-girase (topoisomerases II) – estabiliza as supertorções (estresse topológico).
Iniciação – Origem (oriC) possui um arranjo geral de três sequências de 13 p.b. e quatro sequências de 9 p.b. Essa sequência é chamada de sequência consenso, pois são altamente conservados nas replicações bacterianas. A DnaA liga-se às quatro repetições de 9 p.b. na origem, e reconhece e desnatura sucessivamente o DNA na região das repetições de 13 p.b. (ricas em A-T). Esse processo requer ATP e a proteína HU (estimula a iniciação). Então, um dímero de Dna B (cada proteína Dna B em uma fita depois) é ligado à essa região desenrolada pela Dna C, e a Dna B age como helicase, desenrolando o DNA bidirecionalmente, criando as forquilhas de replicação. A SSB se liga, estabilizando as fitas simples e impedindo a renaturação, enquanto a DNA-girase alivia o estresse topológico.
Alongamento – A síntese da fita contínua é direta, começando com a síntese de um RNA iniciador, e desoxirribonucleotídeos são adicionados a esse iniciador pela DNA polimerase III, e a síntese prossegue continuamente. 
Já a síntese da fita atrasada é realizada com os fragmentos de Okazaki, e primeiro o iniciador é sintetizado e a DNA polimerase III se liga ao iniciador, adicionando nucleotídeos. Ambas as fitas são produzidas com um único dímero assimétrico da DNA polimerase III, e a síntese é feita graças à uma alça do DNA da fita atrasada, que aproxima os dois pontos de polimerização.
Terminação – As duas forquilhas de replicação encontram-se em uma região que contém cópias múltiplas de uma sequência de 20 p.b. (Ter) e uma proteína (Tus), e esse complexo é chamado de Tus-Ter, que estão arranjados para criar uma espécie de armadilha, na qual uma forquilha pode entrar, mas não sair.
METABOLISMO DO RNA 
Esse metabolismo é semelhante ao metabolismo do DNA, mas diferenciando que não precisa de um iniciador e apenas uma fita de DNA é usada como molde (chamada de fita-molde), enquanto a outra fita é chamada de fita não molde (controlam a transcrição).
A RNA polimerase requer uma fita molde de DNA 3’-5’, além dos precursores dos nucleotídeos do RNA (ATP, GTP, UTP e CTP).
 (NMP)n + NTP - (NMP)n+1 + PP
A iniciação ocorre quando a RNA polimerase se liga a região chamada de promotor (sequência específica do DNA). Durante o alongamento da transcrição, forma um híbrido de RNA-DNA de dupla hélice (8 p.b.) A RNA polimerase é formada por cinco subunidades: e por mais uma sexta unidade sigma que se liga as outras 5 subunidades e direciona a enzina para para a região de promotor.
A RNA polimerase não possui uma atividade exonuclease 3’-5’ revisora e comete um erro a cada 104-105 ribonucleotídeos incorporados .
A ligação da RNA polimerase ocorre dentro de uma região que se estende desde cerca de -70 pares de base antes do sítio de início da transcrição até cerca de +30 pares de base depois. Há duas regiões consenso, que se repetem em diferentes genes: na posição -35 (5’ TTGACA 3’) e -10 (5’ TATAAT 3’). Outra região rica em AT, chamado de elemento UP, ocorre em promotores de certos genes altamente expressos (acelera a transcrição).
Durante a transcrição a RNA polimerase mantém o DNA aberto por uma distância de 17 pares de base desenrolados, formando uma “bolha” de transcrição. Com a movimentação da RNA polimerase, ocorre a formação de superespiras (“torções”) tanto na frente quanto atrás da bolha, mas são aliviadas por meio da ação de topoisomerases.
O encontro com certas sequências de DNA levam a uma pausa na síntese do RNA, ou até mesmo, a transcrição é terminada. A E. coli possui dois fatores que indicam a terminação da transcrição: Fator dependente de rho (p) (uma região onde o RNA possui uma sequência auto complementares, formando um grampo, interrompendo a transcrição e facilitando a dissociação do transcrito) e o fator independente de rho (uma região de adenilatos na fita molde, que é transcrito em uridilatos na extremidade 3’ do RNA, e quando a polimerase chega a esse sítio de terminação, ela faz uma pausa). (A proteína p apresenta uma atividade helicase DNA-RNA dependente de ATP, que promove a translocação de uma proteína ao longo do RNA até alcançar o complexo de transcrição que está pausado em um sitio de terminação, contribuindo parar liberar o transcrito do RNA).
Tipos de RNA polimerase:
RNA polimerase I – Responsável pela síntese de RNA pré-ribossomal, que contém o precursor rRNAs 18s, 5,8s e 28s.
RNA polimerase II – Síntese dos RNAm e alguns RNAs especializados ; essa enzima deve reconhecer milhares de promotores. Uma sequência em comum é a TATABOX (sequência
consenso de TATAA), que está próxima ao par de base -30 e da sequência Inr (iniciadora), próxima ao sítio de inicio em +1.
RNA Polimerase III – Sintetiza tRNAs, o rRNA 5s e alguns RNAs especializados. Algumas sequências para a regulação da iniciação da transcrição da RNA polimerase III estão localizadas dentro do próprio gene.
Etapas da transcrição em eucariotos (Montagem, iniciação, alongamento e terminação)
Montagem: A proteína de ligação da TBP se liga à sequência TATA, E o TFIIB se liga ao DNA também e firma melhor a TBP, e a ligação do TFIIA estabiliza o complexo FTIIB-TBP no DNA. O complexo TFIIB-TBP é em seguida ligado pelo complexo TFIIF-RNA polimerase II (TFIIF leva a polimerase a seus promotores e interage com a TFIIB). Por fim, a TFIIE e o TFIIH se ligam para criar o complexo fechado. O TFIIH possui uma atividade de DNA helicase, que promove o desenrolamento do DNA próximo ao sítio de inicio do RNA (Inr), e requer ATP para isso. Iniciação: Por fim, a TFIIH possui uma atividade quinase que fosforila a calda carboxiterminal da RNA polimerase II, causando uma mudança conformacional em todo o complexo, iniciando a transcrição. Durante a síntese dos 60 a 70 nucleotídeos iniciais são liberados o TFIIE e o TFIIH e a RNA polimerase II entra na fase de alongamento.
Alongamento e terminação: A TFIIF permanece associada à RNA polimerase II por todo o alongamento. Proteínas chamadas fatores de alongamento aumentam muito a atividade da polimerase. Por fim, completo o transcrito de RNA, a RNA polimerase II é desfosforilada e reciclada, pronta para iniciar um novo transcrito.
*(Quando a transcrição da RNA polimerase chega em uma lesão do DNA, o TFIIH pode interagir e recrutar o complexo inteiro de reparo por excisão do nucleotídeo).
METABOLISMO DE PROTEINAS – TRADUÇÃO (pág. 794)
Definição: Tradução é o processo de síntese de proteínas guiado pelo RNAm.
Ribossomos:
 - Bacterianos: Possuem um coeficiente de segmentação 770s. Duas subunidades: 30s e 50s
 - Eucarióticos: Possuem um coeficiente de segmentação de 80s. Duas subunidades: 40s e 60s
tRNA
Consistem em uma fita simples de RNA enrolada; peso molecular de 23.000 e 31.000; pelo menos uma espécie de tRNA para cada aminoácido; mínimo de 32 tRNA para reconhecer todos os códons dos aminoácidos. A maioria possui um resíduo de guanilato na extremidade 5’, e todos possuem a sequência trinucleotídica CCA (3’) na extremidade 3’.
Características estruturas comuns:
Oito ou mais resíduos de nucleotídeos;
Maioria possui um resíduo guanilato na extremil 5’; Todos os tRNAs possuem uma sequência CCA na extremil 3’;
Desenho em 3D tem a forma de um L invertido;
Desenhado em 2D, os padrões de P.H. formam uma estrutura com forma de uma folha de trevo:
Código Genético
Códon é uma trinca de nucleotídeos que especifica um aminoácido. Cada códon é lido de maneira sucessiva, e não sobreposto. Há 64 códons possíveis (43), mas apenas 61 codificam aa, pois existem 3 códons de terminação: UAA, UAG e UGA, esses três códons não sintetizam aminoácidos, apenas sinalizam a terminação da cadeia polipeptídica.
Um códon específico na sequência estabelece uma janela de leitura: um novo códon a cada 3 resíduos de nucleotídeos. Não há pontuação entre códons para sucessivos resíduos de aa.
Degeneração do códon – Mais de um códon para o mesmo aminoácido. Cada códon especifica apenas um aminoácido. Degeneração não é uniforme (há aminoácido com apenas 1 códon, enquanto há aminoácido especificado por 6 códons).
Códon de iniciação (AUG) – iniciação da cadeia polipeptídica (Especifica Met no inicio da cadeia polipeptídica quanto na parte interna da cadeia).
A sequência de aminoácidos de uma proteína é feita de uma sequência linear de códons. Código genético é quase universal, com exceção de algumas bactérias e alguns seres eucarióticos unicelulares. Vários códons diferentes que especificam um mesmo aminoácido possuem a diferença apenas na terceira base (extremidade 3’).
Relação do pareamento códon-anticódon
Os tRNA paream suas bases com os códons no mRNA por meio de uma sequência de três bases no tRNA chamada de anticódon. A primeira base do códon no mRNA (5’-3’) parea com a terceira base do anticódon.
Hipótese da oscilação (Crick): 
1) As duas primeiras bases de um códon no mRNA sempre formam pareamentos fortes com as bases correspondentes do anticódon no tRNA (Se as 3 fossem ligadas fortemente, seria difícil a dissociação do mRNA).
2) A primeira base do anticódon pareia com a 3ª base do códon. 
(Quando primeira base do anticódon é C ou A, a ligação é especifica a apenas um códon);
(Quando primeira base do anticódon é U ou G, ligação menos especifica, dois códons lidos);
(Quando Iosinato (primeiro nucleotídeo), três códons diferentes podem ser reconhecidos).
3) Quando um aminoácido for especificado por vários códons diferentes, os códons que diferem em uma das duas primeiras bases requerem tRNA diferentes.
4) Um mínimo de 32 tRNA são requeridos para traduzir todos os 61 códons.
SÍNTESE PROTEICA (pág. 805)
Ribossomo: Formado por duas subunidades: 30s e 50s. As duas subunidades se juntam formando um complexo 70s, onde formam uma fenda por onde passa o mRNA à medida que o ribossomo se move ao longe do mRNA.
Etapa 1: Ativação dos aminoácidos (necessita: 20aa, 20 aminoacil tRNA sintetases, 32 ou mais tRNA, ATP e Mg2+).
O grupo carboxila de cada aminoácido deve ser ativado para facilitar a formação de uma ligações peptídica. E um elo deve estabelecer-se entre cada novo aminoácido. Essa reação se realiza no citosol. Os aminoácidos são esterificados aos seus correspondentes tRNA pela aminoacil-tRNA sintetases. Cada enzima é específica para um aminoácido. 
Aminoácido + tRNA + ATP aminoacil-tRNA + AMP + PPi
Grupo carboxil do aa se liga ao grupo fosforila do ATP 5’-aminoacil adenilatos + 2 PPi
Duas classes de aminoacil-tRNA sintetases:
Classe I – grupo aminoacil é transferido para o grupo OH 2’ do resíduo de adenilatos para a extremidade 3’ do tRNA. Depois o grupo aminoacil é transferido para o grupo 3’ (2’ p/ 3’) por uma reação de transesterificação.
Classe II – grupo aminoacil é transferido direto para o grupo OH 3’.
Etapa 2: Iniciação (necessita mRNA, códon de iniciação do mRNA (AUG), subunidades ribossomal 30s e 50s, fatores de iniciação (IF-1, IF-2 e IF-3), GTP e Mg2+). Em seguida, o mRNA se liga à menor das duas subunidades ribossômicas e ao aminoacil-tRNA de iniciação. A subunidade ribossômica maior liga-se para formar um complexo de iniciação. O aminoacil-tRNA de iniciação pareia com o códon AUG do mRNA, que sinaliza o início da cadeia polipeptídica. Esse processo requer GTP e de proteínas chamadas de fatores de iniciação.
Síntese da cadeia polipeptídica começa na extremidade aminoterminal e a adição de aminoácidos procede à etapa por etapa até a extremidade carboxiterminal.
Em bactérias temos: tRNAfMet – códon (5’) AUG – Met de iniciação (aminoterminal);
 tRNAMet – códon (5’) AUG – Met nas posições internas da cadeia polipt.
Transformilase – transfere um grupo formil a partir do N10-formiltetraidrofolato para o grupo amino da metionina.
N10-formiltetraidrofolato + Met-tRNA (grupo carboxil) N-formilmetionina-tRNAfMet + tetraidrofolato
N-formilmetionina – Faz com que ocorra a ligação no sítio correto no ribossomo na iniciação. Impede a ligação em posições internas.
A iniciação ocorre em três etapas
Primeira) IF-3 e a IF-1 se ligam à subunidade 30s do ribossomo (IF-3 impede que as subunidade 30s e 50s se combinem prematuramente; E o IF-1 impede a ligação do tRNA durante a iniciação no primeiro sítio (aminoacil)). A fita de mRNA se junta à subunidade 30s, e o AUG ligado na posição correta pela sequência Shine-Dalgardo (sequência AGGAGGU, no mRNA), que é um sinal de identificação que possui de 4-9 resíduos purínicos, localizados entre 8-13 p.b. do lado 5’ do códon de iniciação. Essa sequência pareia com uma sequência
complementar rica em pirimidinas (localiza próximo à extremidade 3’ do rRNA 16s). Interação mRNA-rRNA 16s vai posicionar o códon (5’) AUG na subunill 30s. O códon AUG de iniciação é diferenciado dos demais pela proximidade da sequência Shine-Dalgardo. 
Ribossomo possui três sítios: Aminoacil tRNA; Aminoacil ou peptidil (onde se liga o códon de iniciação AUG; e o P.E de saída.
Segunda) Complexo subunidade 30s + IF-3 + mRNA – se liga ao complexo o IF-2-GTP-fMet-tRNAfMet (no sítio peptidil).
Terceira) A subunidade 50s se liga ao complexo, e sai GDP + Pi (gasto energético), juntamente com o IF-1, IF-2 e IF-3, formando um ribossomo funcional 70s, chamado de complexo de iniciação.
Durante o ligamento, todos os aminoacil-tRNA vão se ligar inicialmente ao sítio aminoacil, depois ao peptidil e ao sítio E, e saem. O único que se liga inicialmente ao peptidil é o N-formilMet-tRNA.
Etapa 3: Alongamento (necessita: ribossomo 70s funcional (complexo de iniciação), aminoacil tRNA específico pelos códons, fator de alongamento (Ef-Tu, Ef-Ts, Ef-C), GTP e Mg2+).
O polipeptídio nascente agora é alongado pela ligação covalente de unidades de aminoácidos (cada um carregado por seu tRNA até o ribossomo). É promovido pelas proteínas chamadas de fatores de alongamento. O GTP da energia para o alongamento e o movimento do ribossomo ao longo do mRNA.
Ocorre em três etapas:
Primeira) Ligação do aminoacil tRNA – ligação aminoacil tRNA ao Ef-Tu-GTP. Esse complexo vai se ligar ao sítio A, e com isso o GTP é hidrolisado e sai o GDP que é reciclado pelo fator Ef-Ts, formando Tu-GTP novamente.
Segunda) Formação da ligação peptídica – formação da ligação peptídica dos dois aa ligados ao sítio aminoacil e peptidil, e o grupo carboxila do N-fMet com o grupo amino do segundo aa, formando Dipeptidil-tRNA pela enzima peptidil-transferase (que é uma ribozima rRNA 23s).
Terceira) Translocação – deslocamento do ribossomo (1 códon) ao longo do mRNA (aminoacil para o peptidil, e o tRNAfMet deacilado (sem aa) vai para o sítio E) e necessita de Ef-G-GTP. O aminoacil fica vago para o próximo aa, recomeçando as etapas, gastando 2 GTP.
Etapa 4: Terminação e liberação (necessita: Códon de terminação do mRNA, fatores de liberação (RF-1, RF-2 e RRF), Ef-G e IF-3).
O término da cadeia polipeptídica é sinalizado por um códon de terminação do mRNA (UAA, UAG ou UGA). A nova cadeia polipeptídica é então liberada do ribossomo pelos fatores de liberação.
Ocorre a hidrólise da ligação peptidil-tRNA terminal; Depois a liberação do polipeptídio livre e do tRNA deacilado do sítio peptidil; E por fim, ocorre a dissociação do ribossomo 70s em suas subunidades (30s e 50s).
Etapa 5: Enovelamento e processamento.
O novo polipeptídio pode sofrer processamento enzimático (remoção de um ou mais aa a partir do aminoterminal; a adição de acetila, fosfato, metila ou carboxila; a clivagem proteolítica; ou a ligação de oligossacarídeos ou grupos prostéticos).
1) Modificação nos grupos amino e carboxiterminais – inicialmente, todos os polipeptídios começam com um resíduo de N-formilmetionina ou metionina. Mas esses resíduos e os resíduos aminoterminais adicionais podem ser removidos enzimaticamente. E o grupo amino do resíduo aminoterminal é N-acetilado.
2) Perda de sequências sinalizadoras – os resíduos na extremidade aminoterminal de algumas proteínas desempenham um papel no direcionamento da proteína à sua destinação final. Esses resíduos são removidos por peptidases específicas.
3) Modificação de aminoácidos individuais - resíduos de Ser, Thr e Tr são fosforilados pelo ATP.
Ex: caseína possui grupos fosfosserina que ligam o Ca2+;
 Carboxilação de resíduos de Glu;
 Metilação de resíduos de lisina.
4) Ligação de cadeias laterais de carboidratos – as cadeias laterais são covalentemente ligadas. Em algumas glicoproteínas, a cadeia lateral de carboidratos está enzimaticamente ligada aos resíduos de Asn (oligossacarídeos N-ligados), em outras, a resíduos de Thr (oligossacarídeos O-ligados).
5) Adição de grupos prostéticos – Algumas proteínas requerem grupos prostéticos covalentemente ligados. Dois exemplos são a molécula da biotina e da acetil-CoA carboxilase e o grupo heme do citocromo C.
6) Processamento proteolítico – Muitas proteínas são inicialmente sintetizadas como proteínas precursoras maiores inativas, e são proteoliticamente processadas para produzir as suas formas ativas menores. Ex: insulina, proteínas virais e proteases (tripsina, etc.).
7) Formação das ligações cruzadas de dissulfeto – Depois do enrolamento, algumas proteínas formam pontes dissulfeto intra e intercadeias. Essas ligações ajudam a proteger a conformação nativa da molécula no ambiente extracelular.
Antibióticos e toxinas que inibem a síntese de proteínas: puromicina, cloranfenicol, ciclo-heximida, estreptomicina, toxina diftérica.
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA (pág. 835).
Princípios da regulação gênica
Expressão gênica constitutiva – expressão invariável ou constante, chamados de genes constitutivos.
Expressão gênica regulada – expressão variável ou regulada, chamados de genes induzíveis.
O aumento da expressão do gene é chamado de indução, e o decréscimo na expressão gênica é chamado de repressão.
Transcrição: Iniciação é regulada por proteínas reguladoras
Fatores de especificidade, alteram a especificidade da RNA polimerase para um certo promotor ou conjunto de promotores (como a subunidade sigma da RNA polimerase que reconhece e se liga ao promotor; proteína de ligação TATA); repressores, impedem o cesso da RNA polimerase ao promotor (se ligam a sítios específicos no DNA – operadores – quando recebem um sinal molecular, e a RNA polimerase encontra o repressor, a transcrição para e chamamos de regulação negativa) ; ativadores, aumentam interação do RNA-promotor.
Motivos estruturais – reconhecimento das características estruturais da superfície da porção do DNA. Os dois principais motivos são a hélice-volta-hélice, e o dedo de zinco.
Operons – São o agrupamento de genes e o promotor, mais as sequências adicionais que funcionam juntas na regulação.
E. Coli: possui Operon lac – controladores da síntese enzimática do metabolismo da lactose; e possui o Operon triptofano - controle da síntese enzimática de sinalização do triptofano.
Lac possui genes Lac Z (hidrolisa galactose), Lac Y (transporte de lactose para a célula) e Lac A (modificação de galactosídeos tóxicos). Lac i (responsável pela codificação do repressor lac). O, O2 e O3 são os operadores. P1 é o promotor (possui lac i).
Regulação da Expressão Gênica (pág. 845).
	
	Procariotos
	Eucariotos
	Envoltório
	Ausência
	Presença
	Cromatina
	Ausência
	Presença
	Processamento mRNA
	Ausência
	Presença
	Ativação e replicação
	Presença
	Presença
	Operon
	Presença
	Ausência
	RNA polimerase
	Um tipo
	Três tipos
	Fator de transcrição
	Ausência
	Presença
	Heterocromatina
	Eucromatina
	Mais condensado
	Estendida
	Metilada e desacetilada
	Não metilada, e acetilada.
	Cromatina inativa
	Cromatina ativa
Nas regiões transcritas ativamente, os fragmentos produzidos pela atividade nucleásica são menores e mais heterogêneos em tamanho. Essas regiões contêm sequências que são sensíveis à DNase I, chamadas de sítios de hipersensibilidade. Muitos desses sítios correspondem aos sítios de ligação para proteínas reguladoras.
Remodelamento da cromatina.
1) HAT (Histona acetiltransferase) – acetilam as histonas e lisinas, e isso no começo da transcrição faz com que o nucleossomo reduza a afinidade para o DNA, fazendo com que as histonas percam a afinidade pelo DNA.
2) Complexo enzimático SWI/SNF e NURF – nucleossomo ficam irregulares e espaçados, criando sítios de hipersensibilidade na cromatina, preparando a região do cromossomo para a transcrição.
3) Desmetilação do DNA – ilhas de CpG (rico em G-C) onde é o sítio de início da transcrição junto com a desmetilação e a acetilação, ativam a transcrição.
Regulação pela
ativação
A RNA polimerase juntamente com proteínas ativadoras vai se ligar ao promotor.
Dois tipos de sequências regulatórias são as de intensificadoras (eucariotos) e sequências ativadoras à montante –UAS, (leveduras). Um intensificador pode estar a milhares de pares de base do sítio de inicio, ou dentro do próprio gene. Um intensificador aumenta a transcrição nos promotores próximos.
Proteínas envolvidas na ativação da transcrição
Fatores de transcrição basais – TFIIH, (requerido para cada promotor da RNA polimerase II);
Transativadores de ligação ao DNA (se ligam aos intensificadores ou UAS e facilitam a transcrição); E os co-ativadores (agem indiretamente e são requeridos para a comunicação entre os transativadores de ligação ao DNA e o complexo composto pela RNA polimerase).
Iniciado na sequência TATA de um promotor típico da RNA polimerase II, possuindo os fatores de transcrição TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH e RNA polimerase II.
Proteína HMG – desempenha papel estrutural importante no remodelamento da cromatina e na ativação da transcrição, facilitando na formação de uma alça do complexo da RNA polimerase, fazendo com que várias proteínas possam interagir diretamente.
Ativação da transcrição
1) Ligação do ativador no intensificador;
2) Recrutamento do mediador e enzimas (remodelamento);
3) Ativadores ligados interagem com o mediador;
4) Ligação do TBP e depois do TFIID (co-ativadores);
5) Mediador estabiliza a ligação da RNA polimerase II e outros fatores de transcrição;
6) Fosforilação do CTD (sítio carboxiterminal) da RNA polimerase II Ativação da transcrição.
Regulação por hormônios esteroides
Não se liga a receptores da membrana plasmática celular (são lipossolúveis) e interagem com receptores intracelulares, que são transativadores transcricionais. O complexo hormônio-receptor atua ligando-se a sequências de DNA altamente específicas, os elementos da resposta hormonal (HRE), e alteram a expressão gênica. O complexo pode interagir com fatores de transcrição adicionais, e pode aumentar ou suprimir a transcrição.
TECNOLOGIA DO RNA RECOMBINANTE (pág. 869)
A clonagem do DNA envolve a separação de um gene específico ou segmento de DNA. O resultado é a amplificação seletiva de um gene ou segmento de DNA particular, e baseia-se em cinco procedimentos gerais:
1) Cortar o DNA em localização precisa com endonucleases de restrição;
2) Seleção e corte dos vetores de clonagem (agente de entrega);
3) Ligação dos fragmentos de DNA, feita pela DNA ligase;
4) Transferir o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula hospedeira, que pode fornecer a maquinaria enzimática para a replicação do DNA (bactéria mais utilizada);
5) Seleção dos transformantes.
Endonucleases de restrição e DNA ligase
Endonucleases podem ser de dois tipos: A endonucleases tipo II cliva o DNA em sequências específicas para gerar um conjunto de fragmentos menores, no mesmo sítio de seu reconhecimento, de 4 a 8 p.b., que é uma sequência poliindrônica (se ler a fita em ordem oposta, elas são idênticas), e a DNA ligase (o fragmento de DNA a ser clonado pode ser isolado e unido a um vetor de clonagem apropriado, utilizando a DNA ligase para selar as moléculas de DNA). 
A clivagem do DNA pode fazer com que aja clivagem assimétrica sobre as duas fitas do DNA, podendo deixar dois a quatro nucleotídeos de uma fita não pareado em cada extremidade resultante, e essas extremidades são chamadas de extremidades coesivas (porque podem parear com outra extremidade coesiva de outro fragmento de DNA). Ou a clivagem pode ser simétrica, clivando ambas as fitas do DNA nas ligações fosfodiéster opostas, não deixando bases despareadas em cada extremidade, recebendo o nome de extremidades cegas.
Vetores de clonagem.
Plasmídeos – são moléculas de DNA circulares que se replicam separadamente do cromossomo hospedeiro. Para saber qual célula recebeu o gene, a estratégia é assegurar que o plasmídeo contenha um gene e que a célula hospedeira necessite para crescer em condições específicas, tal gene confere resistência a um antibiótico.
Bacteriófagos lâmbda – cerca de 1/3 do genoma lâmbda não é essencial e pode ser substituído pelo DNA estranho, e o DNA será empacotado em partículas infecciosas do fago apenas se elas estiverem entre 40.000 e 53.000 p.b. de comprimento, uma limitação que pode ser usada para dirigir somente o empacotamento do DNA recombinante.
Cromossomo artificial de bactéria (BAC) e leveduras (VAC) – são simples plasmídeo designados para clonagem de segmentos de DNA muito grandes, com 100.000 a 300.000 p.b.
Vetor BAC – Gene de resistência ao cloranfenicol; possui o gene lac Z (enzima beta-galactosidade com x-gal produz um produto colorido); e é desativado durante inserção.
Inserção do vetor recombinante e na célula hospedeira
Transformação com cloreto de cálcio – células e DNA incubados juntos a 0°C numa solução de cloreto de cálcio, e depois submetidos a um choque térmico à 37°C, fazendo com que a célula receba melhor o DNA.
Eletroporação – as células e o DNA do plasmídeo podem ser submetidos a um pulso de alta voltagem, criando poros na membrana plasmática, fazendo com que o DNA entre na célula.
Aplicação das tecnologias do DNA recombinante.
Estudos gênicos, indústria farmacêutica, agropecuário; terapia gênica; diagnósticos clínicos.