4 e 5 preparo de laminas e gram

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Universidade Tecnológica Federal do Paraná 
 Campus Campo Mourão 
 Coordenação de Alimentos 
 Disciplina de Microbiologia 
 Profa. Márcia R. F. G. Perdoncini 
 
 
AULA PRÁTICA n° 
 
 Preparações microscópicas a fresco, fixadas 
simples e coloração de Gram. 
 
Coloração simples 
 
INTRODUÇÃO 
 
Preparações microscópicas compreendem 
técnicas de tratamento de espécimes 
microbianos em lâminas a serem examinadas ao 
microscópio. Células microbianas podem ser 
examinadas vivas, a fresco, sobre lâminas, com 
auxílio ou não de corantes, vitais, ou podem ser 
fixadas pelo calor sobre a lâmina e coradas com 
corantes químicos específicos. 
A visualização microscópica a fresco é difícil 
devido ao tamanho reduzido e ao índice de 
refração dos microrganismos que se aproximam 
ao da água, tornando-os praticamente incolores, 
quando suspensos em um meio aquoso. 
Apesar da dificuldade de visualização, 
preparações microscópicas a fresco são úteis 
para observar a viabilidade e algumas atividades 
celulares, como motilidade e fissão binária, e 
para observar o tamanho e a forma natural das 
células microbianas. 
Para diferenciar os microrganismos em grupos 
específicos com o propósito de diagnosticar e de 
estudar suas propriedades, utilizam-se corantes e 
técnicas de coloração que constituem 
ferramentas essenciais nas preparações 
microscópicas. Um corante é, geralmente, um 
sal, no qual um dos seus íons é um cromóforo. 
Se o cromóforo é positivo, o corante é básico, 
como é o caso do azul de metileno, do cristal 
violeta ou da fucsina. Se o cromóforo é negativo, 
o corante é ácido, como o ácido pícrico. 
Corantes básicos, carregados positivamente, são 
ideais para corar bactérias, porque os ácidos 
nucléicos e alguns componentes da parede 
celular apresentam carga negativa e são atraídos 
por cromóforos catiônicos. 
Nas técnicas de coloração simples, células 
microbianas fixadas sobre uma lâmina são 
coradas com um único corante. 
 
OBJETIVOS 
1. Preparar lâminas a fresco para 
observação de algumas amostras de 
leveduras; 
2. Treinar técnicas fixadas e coradas de 
preparação de bactérias para exame 
microscópico; 
3. Treinar manuseio adequado do 
microscópio óptico composto; 
4. Diferenciar bactérias de acordo com a 
morfologia (forma e arranjo) de suas 
células. 
 
MATERIAIS E MÉTODOS 
 
Corantes utilizados: cristal violeta e azul de 
metileno. Solução salina estéril. 
 
Técnica de coloração a fresco 
- Flambar rapidamente uma lâmina de 
microscopia limpa, nos dois lados, “cortando”, 
lentamente, a chama do bico de Bunsen; 
- Flambar a alça de repicagem ao rubro e, a 
seguir, deixá-la esfriar, conservando-a, todavia, 
perto da chama; 
- Tomar o tubo com a suspensão de leveduras, 
agitá-lo levemente com a mão esquerda e com o 
dedo mínimo e anular da mão direita, remover o 
tampão de algodão da boca do tubo; 
- Flambar a boca do tubo de cultura; 
- Introduzir a alça de repicagem, presa entre o 
polegar e o indicador da mão direita, no interior 
do tubo, até tocar a suspensão; 
- Flambar novamente a boca do tubo de cultura; 
- Tomar uma lâmina (anteriormente preparada) 
com a mão e depositar em seu centro uma 
gotícula da suspensão; 
- Pingar uma gota de azul de metileno a pequena 
distância da suspensão e, sobre a lâmina, 
colocar uma lamínula; 
- Observar ao microscópio na objetiva de 40x. 
 
Técnica de coloração simples com material 
sólido 
- Colocar no centro da lâmina uma pequena gota 
de solução fisiológica com a alça de repicagem; 
- Transferir uma pequena alíquota da cultura 
sólida para a lâmina, colocar sobre ela uma gota 
de solução fisiológica e espalhar o material com 
movimentos circulares (esfregaço); 
- Em seguida, “cortar”, lentamente, a lâmina na 
chama do bico de Bunsen, a fim de que o 
material fique bem aderente à lâmina (fixação); 
- Cobrir a lâmina com o esfregaço fixado com o 
cristal violeta por 1 minuto e, em seguida, lavar 
com água; 
- Observar ao microscópio na objetiva de 100x. 
OBS. Quando a cultura estiver em meio líquido, 
não utilizar solução fisiológica para o esfregaço. 
Para fazê-lo, utiliza-se a alíquota da cultura 
diretamente na lâmina que deve ser cortada 
sobre o bico de Bunsen até secar, repetindo-se a 
operação cinco vezes. 
 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
1. Descreva detalhadamente o processo de 
esfregaço, a partir de uma cultura bacteriana 
sólida. 
2. Qual a diferença entre o esfregaço de cultura 
sólida e o de cultura líquida? 
3. Como se faz a fixação de um esfregaço 
bacteriano? Qual é a finalidade da fixação? 
4. Esquematize as preparações a fresco e as 
preparações coradas simples observadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Coloração a fresco Coloração simples 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Técnicas de coloração de Gram 
 
 
INTRODUÇÃO 
Corantes são substâncias que possuem a 
propriedade de transmitir sua cor a outros corpos. 
As colorações em microbiologia são de vital 
importância, pois funcionam como opção na 
identificação presuntiva dos diversos agentes 
patogênicos. 
Preparações coradas são comumente usadas no 
exame microscópio de bactérias e de fungos em 
microbiologia, em que esfregaços de material são 
submetidos à ação de um ou mais corantes após 
a fixação. 
A maioria das bactérias é corada pelo método de 
Gram, que permite observar sua morfologia e 
fornece informações a respeito do 
comportamento do material celular diante de 
corantes básicos (corantes de Gram). Essa 
técnica separa as bactérias em dois grupos: 
Gram-positivas e Gram-negativas. 
A coloração é chamada de Gram devido ao Dr. 
Christian Gram, que descreveu pela primeira vez 
esse processo de coloração em 1884, ao fazer 
uma referência à composição da parede celular. 
As bactérias Gram-positivas possuem uma 
espessa camada de peptidioglicano e de ácido 
teicóico; enquanto as Gram-negativas possuem 
uma fina camada de peptidioglicano sobre a qual 
se encontra uma camada de lipoproteínas, de 
fosfolipídeos, de proteínas e de 
lipopolissacarídios. 
A coloração de Gram envolve a aplicação de 
quatro reagentes: cristal violeta (CV) e lugol (iodo 
metálico e iodeto de potássio) (I), que formam um 
complexo insolúvel (CV-I); álcool-acetona, que 
funciona como solvente de lipídios e desidratante 
de proteínas, e fucsina ou safranina. 
O tratamento com álcool-acetona extrai os 
lipídios, resultando no aumento da 
permeabilidade da parede celular das bactérias 
Gram-negativas. Assim, o complexo cristal 
violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado, e as 
bactérias Gram-negativas são descoradas. A 
parede celular das bactérias Gram-positivas, em 
virtude de sua composição, torna-se desidratada 
durante o tratamento com álcool. Além disso, a 
permeabilidade é reduzida, e o complexo CV-I 
não pode ser extraído. Finalmente, utiliza-se 
fucsina ou safranina que funciona como corante 
básico de contraste (contracorante). O tratamento 
com fucsina ou safranina não altera a cor roxa 
das Gram-positivas, ao passo que as Gram-
negativas, descoradas pelo álcool, tornam-se 
avermelhadas. 
 
OBJETIVOS 
1. Aprender a técnica de coloração de Gram; 
2. Aprender os fundamentos da coloração de 
Gram; 
3. Comparar a estrutura da parede celular 
das bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas. 
 
 
 
MATERIAIS E MÉTODOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A. Materiais 
- Cultura de bactérias Gram-positivas 
(Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus); 
- Cultura de bactérias Gram-negativas 
(Escherichia coli, Pseudomonas, Salmonella); 
- Tubos com salina estéril. 
- Cristal violeta (corante); 
- Lugol (mordente); 
- Álcool-acetona (descorante); 
- Fucsina ou safranina (corante). 
 
B. Método 
- Fazer um esfregaço bem homogêneo, fixar pelo 
calor e esperaresfriar (conforme roteiro de aula 
prática parte 1); 
- Cobrir com cristal violeta, e deixar agir por 1 
minuto; 
- Lavar rapidamente com água; 
- Cobrir com solução de lugol durante 2 minutos; 
- Lavar em água corrente; 
- Lavar a lâmina com álcool-acetona até que não 
se desprenda mais corante da preparação 
(aproximadamente 15 segundos); 
- Lavar rapidamente a lâmina com água; 
- Corar com fucsina durante 30 segundos; 
- Lavar a lâmina com água e, em seguida, deixar 
secar ao ar ou entre papel de filtro; 
- Observar ao microscópio, focalizando com a 
objetiva de imersão (100x). 
 
 
 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
(continuação da parte 1) 
 
5. Descreva a técnica de coloração de Gram. 
6. Explique por que as bactérias Gram-negativas 
apresentam coloração diferente das bactérias 
Gram-positivas. 
7. Preencha o quadro a seguir: 
 
Microrganismo Forma Arranjo Cor Gram 
 
 
 
 
 
 
8. Qual tipo de bactéria (gram negativa ou gram 
positiva) está representada na figura 1 e 2? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referências 
OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia- 
roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd, 
2008. 
 
NOTA: 
Qualquer processo de coloração segue basicamente três 
passos: 
 
1. Preparo do esfregaço: O esfregaço é a 
colocação dos microrganismos na lâmina de 
vidro para serem submetidos à coloração. 
Deve ser oval e delgado. 
2. Fixação do esfregaço: serve para fixar os 
microrganismos do esfregaço na lâmina de vidro, 
para que posteriormente não sejam removidos 
durante o processo de coloração. 
• Este procedimento faz com que o protoplasma 
das células dos microrganismos se coagule, 
aderindo- os desta forma na lâmina. 
• A forma mais utilizada de fixação de esfregaço, é 
passá-lo pela chama umas três vezes. Há também 
outros processos utilizando produtos químicos. 
3. Coloração propriamente dita: são os 
procedimentos de cada técnica de coloração.