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TURMA DE FARMÁCIA
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
DETERMINAÇÃO DAS BILIRRUBINEMIAS
				          
	
SÃO PAULO
2019
OBJETIVO
Determinação da Bilirrubina Direta e Total no soro.
INTRODUÇÃO
Bilirrubina é um pigmento amarelo produzido quando as hemácias, responsáveis por levar oxigênio às células, são deterioradas em um processo natural de reciclagem. Essa ação acontece em diferentes partes do corpo, como baço, medula óssea e fígado, sendo a última a mais comum.
Em seu estado normal, a substância amarelada vai até o fígado, onde se mistura com a bile, e é processada por meio das vias biliares, sendo utilizada posteriormente no processo da digestão e na urina.
O aumento da bilirrubina indireta (bilirrubina não conjugada a albumina) é observado na icterícia neonatal, na síndrome de Crigler-Najjar, na síndrome hemolítica e na doença de Gilbert. Estes casos estão relacionados com a velocidade de produção e de remoção do pigmento na circulação e não estão relacionados com aumento da bilirrubina na urina. Já o aumento da bilirrubina direta (conjugada a albumina), cujo aumento é observado na excreção pela urina, está relacionado com a capacidade de excreção deste pigmento pelo fígado e, portanto, refletem sobre a integridade e funcionalidade das células hepáticas. As doenças relacionadas com o aumento da bilirrubina direta na urina são as hepatites, as reações às drogas e obstruções no trato biliar. Ref: https://www.infoescola.com/bioquimica/bilirrubina
Tipos de icterícia
Existem quatro tipos de icterícia: a hemolítica, a hiperbilirrubinemia, hepatocelular e obstrutiva. Cada uma delas é provocada pela falha em algum processo no organismo, mas todas são oriundas da bilirrubina alta e deixam a pele amarelada.
Hemolítica: Ocorre quando há anormalidade na produção das hemácias, comum em casos de transfusão de sangue que resultam na formação de anticorpos.
Hiperbilirrubinemia: Quando a enzima responsável pelo metabolismo da bile apresenta falhas. É mais comum em recém-nascidos.
Hepatocelular: Este caso de icterícia é decorrência de algum vírus, como nos casos de hepatite e cirrose.
Obstrutiva: Ocorre pela obstrução dos ductos biliares, possível consequência da presença de colangite e cânceres que impedem o fluxo da bilirrubina.
Ref: https://www.ativosaude.com/saude/ictericia/ 
A síndrome de Crigler-Najjar trata-se de um distúrbio raro do metabolismo da bilirrubina, resultando em aumento da forma não conjugada dessa substância na corrente sanguínea, podendo levar a danos cerebrais em lactentes. São descritas duas formas distintas da síndrome: Tipo 1 e tipo 2.
Tipo 1 - Este tipo da doença é muito raro e está associada à hiperbilirrubinemia não conjugada neonatal e kernicterus (encefalopatia da bilirrubina). O tipo 1 caracteriza-se por apresentar uma concentração de bilirrubina no plasma geralmente acima de 345 mmol/L (intervalo de referência para a bilirrubina é de 2-14 mmol/L). Crianças com o tipo I da síndrome de Crigler-Najjar podem continuar a ter icterícia durante a idade adulta, podendo exigir tratamento diário.
Tipo 2 - Também denominada síndrome de Arias, apresenta-se com um nível bilirrubina sérica inferior a 345 mmol/L e, na maioria dos casos, a detecção é tardia. O tipo II, considerado a forma mais leve da síndrome de Crigler-Najjar, não ocasiona toxicidade grave, dano hepático ou mudanças no pensamento durante a infância.
Ref: https://www.infoescola.com/doencas/sindrome-de-crigler-najjar/
A síndrome de Gilbert é um distúrbio genético benigno do fígado, geralmente causada por uma anomalia genética hereditária, o quadro hereditário decorre da diminuição da glucoronização das bilirrubinas (Bb) pela enzima UDP-glucuronil-transferase (UGT1), deficiente nesses pacientes. E decorrente disso, não a eliminação da bilirrubina, e o aumento dos seus níveis no sangue, pode produzir sintomas como icterícia. Frequentemente diagnostica em adolescentes e adultos jovens, do sexo masculino. Ref: https://www.hospitalinfantilsabara.org.br
A Síndrome de Dubin-Johnson é uma doença genética muito rara, caraterizada por icterícia ao longo da vida. Tem uma hereditariedade autossômica recessiva. A idade de início é muito variável, pode surgir em criança, mas pode não aparecer até a puberdade, manifestando-se apenas na idade adulta. Esta patologia interfere com a capacidade do organismo em mover uma substância química chamada bilirrubina a partir do fígado.
Quando o processo de eliminação da bilirrubina fica comprometido, ela pode acumular-se na corrente sanguínea levando a que o indivíduo apresente icterícia, ou seja, a pele e o branco dos olhos ficam com uma cor amarelada. Níveis muito elevados de bilirrubina podem causar danos no cérebro e em outros órgãos.
Causas. As causas ainda não estão completamente definidas, contudo sabe-se que a icterícia pode ser agravada por diversos fatores: Álcool, Pílulas, anticoncepcionais, fatores ambientais específicos, Infecção e Gravidez.
Ref: https://asdoencasraras.blogspot.com/2013/05/sindrome-de-dubin-johnson.html
EQUIPAMENTOS
Procedimento Técnico Manual
Espectrofotômetro (leitura em 530 e 550 nm);
Banho-Maria ou termostatizador com temperatura regulada em 37°C;
Tubos e Pipetas;
Cronômetro.
PROCEDIMENTO
A- Condição de Reação
 Leitura: Comprimento de onda 546 nm (530 e 550 nm)
Medida: Acertar o Zero de absorbância com água deionizada na 1° leitura e com o tubo Branco na 2° leitura
 Tipo de Reação: Ponto final
Notas
1-Para a calibração das dosagens de bilirrubina total e direta, utilizar o produto Calibrador Cat. 410 da Gold Analisa.
2-Ver o preparo do Calibrador nas Instruções de Uso do produto.
As concentrações de bilirrubina total e bilirrubina direta vêm estipuladas em uma tabela anexa ás instruções de Uso do Calibrador – Cat. 410. 
3-As técnicas de análise apresentadas (BD e BT) não são aplicáveis nos equipamentos semiautomáticos que utilizam apenas cubeta de fluxo. 
No site Gold Analisa estão disponíveis protocolos para analisadores automáticos.
B-Técnica de Análise da Bilirrubina Direta – BD
1-Identificar 03 tubos de ensaio com “Branco”, “Teste” e “Calibrador” e proceder:
	Tubos
	 Branco
	 Teste
	 Calibrador
	BD-R1
	 2000 µL
	 2000 µL
	 2000 µL
	Água deionizada
	 200 µL
	 -------
	 ------
	Amostra
	 -------
	 200 µL
	 ------
	Calibrador
	 ---------
	 ------
	 200 µL
2-Homogeneizar e incubar em banho-maria a 37°C por 5 minutos.
3-Ler a absorbância do Teste (AT1) e do Calibrador (AC1) em 546 nm (530 a 550 nm), acertando o Zero com água deionizada.
4-Adicionar aos tubos “Branco”, “Teste” e “Calibrador”:
	
 Tubos
	
 Branco
	
 Teste
	
 Calibrador
	
BD-R2
	
 500 µL
	
 500 µL
	
 500 µL
5-Homogeneizar e incubar em banho-maria a 37°C por 5 minutos.
6-Ler absorbância do Teste (AT2) e do Calibrador (AC2) em 546 nm (530 a 550nm), acertando o Zero com o tubo Branco.
A cor é estável por 30 minutos.
CÁLCULOS
CC = concentração do Calibrador (ver concentração de BD na tabela do Calibrador)
CT = concentração de BD do Teste
AC = Absorbância do Calibrador
AT = Absorbância do Teste
Como metodologia obedece a lei de Lambert- Beer, calcular a concentração do teste através do Fator de Calibração (FC).
FC = CC ÷ ∆C
CT = FC × ∆T
Atenção
Antes de calcular a concentração de Bilirrubina Direta dos Testes, corrigir as primeiras leituras (A1) do Teste e do Calibrador da seguinte maneira:
Volume total da primeira leitura (A1) = 1100 µL
Volume total da segunda leitura (A2) = 1350 µL
Fator de correção da primeira leitura (A1) = 1100 ÷ 1350 = 0,81
Exemplo
Se CC = 1,9 mg/dL (Concentração de BD na tabela do Calibrador)
Se AC1 = 0,102 e AC2 = 0,174
AC1 corrigida = 0,102 × 0,81 = 0,083
Se AT1= 0,062 e AT2 = 0,118
AT1 corrigida = 0,062 × 0,81 = 0,050
∆C = (AC2 – AC1) = 0,174 – 0,083 = 0,091
∆T = (AT2 – AT1) = 0,118 – 0,050 = 0,068
FC = CC ÷ ∆C = 1,9 ÷ 0,091 = 20,8
CT(BD mg/dL) = FC × ∆T = 20,8 × 0,068 = 1,42 mg/dL
CALCULO DA AMOSTRA
∆T = (AT2 – AT1) = 0,002 – 0,001 = 0,001
CT (BD mg/dL) = FC × ∆T = 22 × 0,001 = 0,022 mg/dL
C-Técnica de Análise da Bilirrubina Total – BT
1- Identificar 03 tubos de ensaio com “Branco”, “ Teste” e “Calibrador” e proceder:
	Tubos
	 Branco
	 Teste
	 Calibrador
	BT- R1
	 1600 µL
	 1600 µL
	 1600 µL
	Água deionizada
	 100 µL
	 -------
	 -----
	Amostra
	 -------
	 100 µL
	 -----
	Calibrador
	 -------
	 ------
	 100 µL
.
2-Homogeneizar e incubar em banho-maria a 37°C por 5 minutos.
3-Ler absorbância do Teste (AT1) e do Calibrador (AC1) em 546 nm (530 a 550 nm), acertando o Zero com água deionizada.
4-Adicionar aos tubos “Branco”, “Teste” e “Calibrador”:
	
 Tubos
	
 Branco
	
 Teste
	
 Calibrador
	
BT-R2
	
 400 µL
	
 400 µL
	
 400 µL
5-Homogeneizar e incubar em banho-maria a 37°C por 5 minutos.
6-Ler absorbância do Teste (AT2) e do Calibrador (AC2) em 546 nm (530 a 550 nm), acertando o Zero com o tubo Branco.
A cor é estável por 30 minutos
CÁLCULOS 
CC = concentração do Calibrador (ver a concentração de BT na tabela do Calibrador)
CT = Concentração de BT do Teste
AC = Absorbância do Calibrador
AT = Absorbância do Teste
Como metodologia obedece a lei de Lambert- Beer, calcular a concentração do teste através do Fator de Calibração (FC).
FC = CC ÷ ∆C
CT = FC × ∆T
Atenção
Antes de calcular a concentração de Bilirrubina Total dos Testes, corrigir as primeiras leituras (A1) do Teste e do Calibrador da seguinte maneira:
Volume total da primeira leitura (A1) = 850 µL
Volume total da segunda leitura (A2) = 1050 µL
Fator de correção da primeira leitura (A1) = 850 ÷ 1050 = 0,81
Exemplo
Se CC = 3,4 mg/dL (Concentração de BT na tabela do Calibrador)
Se AC1 = 0,70 e AC2 = 0,188
AC1 corrigida = 0,70 × 0,81 = 0,057
Se AT1= 0,062 e AT2 = 0,124
AT1 corrigida = 0,062 × 0,81 = 0,050
∆C = (AC2 – AC1) = 0,188 – 0,057 = 0,131
∆T = (AT2 – AT1) = 0,124 – 0,050 = 0,074
FC = CC ÷ ∆C = 3,4 ÷ 0,074 = 25,9
CT (BD mg/dL) = FC × ∆T = 25,9 × 0,074 = 1,92 mg/dL
CALCULO DA AMOSTRA
∆T = (AT2 – AT1) = 0,146 – 0,037 = 0,109
CT (BT mg/dL) = FC × ∆T = 27 × 0,109 = 2,9 mg/dL
Bilirrubina Indireta – BI
BI = BT – BD = 2,9 - 0,022 = 2,878 mg/dL 
VALORES DE REFERÊNCIA
1-Adultos, adolescentes e crianças.
Bilirrubina Total: até 1,2 mg/dL
Bilirrubina Direta: até 0,4 mg/dL
2- Recém-Nascidos – Bilirrubina Direta: até 0,4 mg/dL
3- Recém-Nascidos – Bilirrubina Total
1 dia: até 5,1 mg/dL
1 a 2 dias: até 7,2 mg/dL
3 a 5 dias: até 10,3 mg/dL
Estes valores devem ser usados como uma orientação. É recomendado que cada laboratório estabeleçam seus próprios valores de referência.
RESULTADO
O resultado da amostra analisada deu normal para Bilirrubina Direta (0,022 mg/dL).
O resultado da amostra analisada deu aumentado para Bilirrubina Total (2,9 mg/dL).
CONCLUSÃO
Em comparação com os valores de referencias para bilirrubina direta (até 0,4 mg/dL) em adulto, adolescentes e crianças, e os valores referente á dosagem realizada obtive-se concentração de 0,022 mg/dL encontra-se baixa. E a bilirrubina total em comparação os valores de referencias (até 1,2 mg/dL) em comparação com o valor obtido da amostra (2,9 mg/dL) encontra-se elevada.
REFERÊNCIAS
https://www.infoescola.com/bioquimica/bilirrubina
https://www.ativosaude.com/saude/ictericia/
https://www.infoescola.com/doencas/sindrome-de-crigler-najjar/
https://www.hospitalinfantilsabara.org.br
https://asdoencasraras.blogspot.com/2013/05/sindrome-de-dubin-johnson.html
Sims FH, Horn C. Am J Clin Path. 1958;29:412.
Martineck RG Clin Chim Acta 1966;13:161.
Pearlman FC and Lee RTY. Clin Chen 1974: 20:447-453.
Poon R, Hinber IG. Clin Chem 1985; 31:92-94.
Ran RN, di PasquaA. Clin Chem 1962; 06:570-8
Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric Reference Ranges. 5a. edição, Washington: AACC Press, 2005:42-43.
Winsten S, Cehelyk B. Clin Chim Acta 1969; 25:441-446.
GOLD ANALISA: Informe Técnico do Produto.