Apostila Machos I

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Carol	
  Lopez	
  e	
  Fernanda	
  Campos	
  
Alunas	
  do	
  Curso	
  de	
  Medicina	
  Veterinária	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
Universidade	
  Anhembi	
  Morumbi	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
  
2ª	
  EDIÇÃO	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
VOLUME	
  1	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
Revisão:	
  Profª	
  SILVIA	
  FERRARI	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  2	
  
	
  
Sumário	
  
Para	
  que	
  coletamos	
  sêmen?	
  ...........................................................................................................................................................................................................	
  5	
  
Métodos	
  de	
  Coleta	
  ..........................................................................................................................................................................................................................	
  6	
  
Aula	
  Prática	
  .....................................................................................................................................................................................................................................	
  7	
  
Montagem	
  das	
  Vaginas	
  Artificiais	
  ...............................................................................................................................................................................................	
  7	
  
Copo	
  coletor	
  para	
  cães	
  =	
  MAMADEIRA	
  .......................................................................................................................................................................................	
  9	
  
Coleta	
  do	
  sêmen	
  e	
  limpeza	
  do	
  prepúcio	
  ...................................................................................................................................................................................	
  10	
  
Avaliação	
  Macroscópica	
  ............................................................................................................................................................................................................	
  11	
  
1)	
  Volume	
  colhido	
  (ml)	
  ..........................................................................................................................................................................................................	
  12	
  
2)	
  Cor	
  .....................................................................................................................................................................................................................................	
  12	
  
3)	
  Aspecto	
  (densidade)	
  ..........................................................................................................................................................................................................	
  13	
  
4)	
  Odor	
  ..................................................................................................................................................................................................................................	
  13	
  
5)	
  	
  Movimento	
  de	
  massa	
  .......................................................................................................................................................................................................	
  14	
  
6)	
  PH	
  ......................................................................................................................................................................................................................................	
  14	
  
Avaliação	
  Microscópica	
  .............................................................................................................................................................................................................	
  15	
  
1)	
  Turbilhonamento	
  ..............................................................................................................................................................................................................	
  16	
  
2)	
  MRP	
  –	
  Movimento	
  Retilíneo	
  Progressivo	
  ..........................................................................................................................................................................	
  16	
  
3) Vigor	
  .................................................................................................................................................................................................................................	
  17	
  
4)	
  Concentração	
  []	
  .................................................................................................................................................................................................................	
  17	
  
4.1)	
  Câmara	
  de	
  Newbauer	
  ....................................................................................................................................................................................................	
  19	
  
5)	
  Análise	
  Patológica	
  	
  -­‐	
  Esfregaço	
  e	
  Coloração	
  ......................................................................................................................................................................	
  22	
  
5)	
  Análise	
  Patológica	
  -­‐	
  Fixação	
  /	
  Câmara	
  Úmida	
  ...................................................................................................................................................................	
  23	
  
Diluidores	
  ......................................................................................................................................................................................................................................	
  25	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  3	
  
	
  
Componentes	
  do	
  Diluidor	
  .........................................................................................................................................................................................................	
  25	
  
Preparação	
  do	
  diluidor	
  com	
  GEMA	
  de	
  OVO	
  –	
  50	
  ml	
  .................................................................................................................................................................	
  25	
  
O	
  glicerol	
  pode	
  ser	
  adicionado	
  de	
  duas	
  formas	
  ........................................................................................................................................................................	
  28	
  
Cálculo	
  do	
  Volume	
  do	
  Diluidor	
  ..................................................................................................................................................................................................	
  29	
  
Etapas	
  da	
  congelação	
  ....................................................................................................................................................................................................................	
  31	
  
Resfriamento.................................................................................................................................................................................................................................	
  32	
  
Glicerolização	
  	
  e	
  Equilíbrio	
  ............................................................................................................................................................................................................	
  33	
  
Identificação	
  ..................................................................................................................................................................................................................................	
  34	
  
Envasamento	
  .................................................................................................................................................................................................................................	
  34	
  
Congelação	
  ....................................................................................................................................................................................................................................	
  36	
  
Método	
  Vertical	
  ........................................................................................................................................................................................................................	
  36	
  
Método	
  Horizontal	
  ....................................................................................................................................................................................................................	
  36	
  
Curva	
  de	
  Congelação	
  .................................................................................................................................................................................................................	
  37	
  
Descongelação	
  ..............................................................................................................................................................................................................................	
  38	
  
Teste	
  de	
  Termorresistência	
  (T.	
  T.)	
  .................................................................................................................................................................................................	
  38	
  
Esfregaço	
  e	
  Coloração	
  ...................................................................................................................................................................................................................	
  39	
  
PATOLOGIAS	
  ..................................................................................................................................................................................................................................	
  40	
  
Defeitos	
  MAIORES	
  .....................................................................................................................................................................................................................	
  40	
  
1)	
  ACROSSOMO	
  –	
  	
  Defeitos	
  maiores	
  .....................................................................................................................................................................................	
  43	
  
2)	
  CABEÇA	
  -­‐	
  Defeitos	
  maiores	
  ...............................................................................................................................................................................................	
  43	
  
3)	
  COLO	
  -­‐	
  Defeitos	
  maiores	
  ...................................................................................................................................................................................................	
  44	
  
4)	
  PEÇA	
  INTERMEDIÁRIA	
  –	
  Defeitos	
  maiores	
  ........................................................................................................................................................................	
  44	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  4	
  
	
  
5)	
  CAUDA	
  –	
  Defeitos	
  maiores	
  ................................................................................................................................................................................................	
  44	
  
Defeitos	
  MENORES	
  ....................................................................................................................................................................................................................	
  45	
  
1)	
  CABEÇA	
  -­‐	
  Defeitos	
  menores	
  ..............................................................................................................................................................................................	
  46	
  
2)	
  COLO	
  -­‐	
  Defeitos	
  menores	
  ..................................................................................................................................................................................................	
  46	
  
3)	
  CAUDA	
  -­‐	
  Defeitos	
  menores	
  ...............................................................................................................................................................................................	
  46	
  
Referências	
  ....................................................................................................................................................................................................................................	
  47	
  
Ilustrações	
  .....................................................................................................................................................................................................................................	
  47	
  
Agradecimentos	
  ............................................................................................................................................................................................................................	
  48	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
   	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  5	
  
	
  
Para	
  que	
  coletamos	
  sêmen?	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  
	
  
	
  
	
  
ü Sexagem	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
(separação	
   dos	
   cromossomos	
   X	
   e	
   Y	
  
para	
  obtenção	
  de	
  macho	
  ou	
  fêmea)	
  
ü Análise	
  	
  
ü Facilitar	
  o	
  transporte	
  	
  
ü Avanços	
  genéticos	
  
ü Estocagem	
  
ü Evitar	
  DST	
  
ü Evitar	
  trauma	
  nos	
  animais	
  
durante	
  a	
  cópula	
  
ü Inseminação	
  Artificial	
  (IA)	
  
ü Otimizar	
  a	
  qualidade	
  do	
  sêmen	
  
Fonte:	
  <http://bruzudunga.blogspot.com.br/2007/08/irmos-­‐luiz-­‐fernando-­‐verssimo.html>	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  6	
  
	
  
Métodos	
  de	
  ColetaVagina	
  Artificial	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Eletroejaculador	
  
 
 Equinos; Ruminantes (P e G) e Gatos Ruminantes (P e G); Felinos (P e G) 
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Método	
  de	
  excitação	
  mecânica	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Método	
  de	
  excitação	
  química	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Cães	
  e	
  Suínos	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Grandes	
  Felinos	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
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  2	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  3	
   	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  4	
  
	
  
Fontes:	
  1	
  <http://www.suprivet.com.br/forro&p-­‐&vagina&artificial&ovino&e&caprino_131.html#.UyXOvTlUC1I>;	
  2	
  <http://www.duboi.com.br/defaultpai.htm>;	
  
3<http://www.patriciasalla.com.br/index.php?pagina=1365899385_02>	
  	
  e	
  4	
  <http://jie.itaipu.gov.br/jie/files/files2009/image/20111117/juma_renato.JPG>	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
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  Aula	
  Prática	
  	
  
	
  
Montagem	
  das	
  Vaginas	
  Artificiais	
  
	
  
	
  
Obs.:	
  Proteger	
  a	
  mamadeira	
  com	
  um	
  papel	
  ou	
  alumínio	
  para	
  não	
  ter	
  incidência	
  de	
  luz	
  nos	
  sptz.	
  Acrescentar	
  água	
  entre	
  o	
  PVC	
  e	
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  látex,	
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  a	
  
45ºC.	
   	
  
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  e	
  Reprodução	
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  8	
  
	
  
	
  
Obs.:	
  Proteger	
  o	
  tubo	
  coletor	
  com	
  um	
  papel	
  ou	
  alumínio	
  para	
  não	
  ter	
  incidência	
  de	
  luz	
  nos	
  sptz.	
  Acrescentar	
  água	
  entre	
  o	
  PVC	
  e	
  o	
  látex	
  a	
  60ºC.	
  
O	
  procedimento	
  para	
  montagem	
  das	
  vaginas	
  artificias	
  para	
  pequenos	
  e	
  grandes	
  ruminantes	
  é	
  o	
  mesmo	
  mas	
  existem	
  
diferenças	
  no	
  tamanho	
  de	
  cada	
  uma.	
  	
  
Para	
  simulação,	
  no	
  laboratório	
  de	
  reprodução	
  da	
  universidade,	
  utilizamos	
  um	
  tubo	
  de	
  PVC	
  que	
  é	
  pequeno;	
  branco	
  e	
  
com	
  uma	
  tampa	
  de	
  Gatorade®	
  -­‐>	
  peq.	
  ruminantes.	
  Para	
  grandes	
  ruminantes	
  é	
  usado	
  um	
  tubo	
  médio	
  recoberto	
  de	
  plástico	
  
preto	
  e	
  com	
  uma	
  válvula	
  de	
  metal.	
  	
   	
  
Tecnologia	
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  coletor	
  para	
  cães	
  =	
  MAMADEIRA	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
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Coleta	
  do	
  sêmen	
  e	
  limpeza	
  do	
  prepúcio	
  
	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
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Avaliação	
  Macroscópica	
  
	
  
	
  
	
  	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
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1)	
  Volume	
  colhido	
  (ml)	
  
	
   Vai	
  depender	
  do	
  ejaculado	
  do	
  animal	
  em	
  questão.	
  
	
  
	
  2)	
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Cão,	
  cachaço,	
  garanhão,	
  
touro	
  e	
  jumento.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  Carneiros	
  
	
  	
  Bode	
  e	
  Touro	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  VERMELHO:	
  Sangue	
  
AMARELADA:	
  Urina	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
ou	
  Pus	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  13	
  
	
  
3)	
  Aspecto	
  (densidade)	
  	
  
	
   	
  
CREMOSO	
   MUITO	
  DENSO	
   PQS	
  RUMINANTES	
  
LEITOSO	
   DENSO	
   BOVINO	
  E	
  BÚFALO	
  
SOROSO	
   POUCODENSO	
   CÃO,	
  EQUINO,	
  SUÍNO	
  E	
  FELINO	
  
AQUOSO	
  
AZOOSPERMIA	
   SEM	
  SPTZ	
  
OLIGOSPERMIA	
   POUCO	
  SPTZ	
  
	
  
	
  
	
  
	
  4)	
  Odor	
  	
  
	
   Sui	
  generis	
  (normal)	
  
	
   Odor	
  hircino	
  (bodes)	
  
	
   Cheiro	
  podre	
  (presença	
  de	
  pus)	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  14	
  
	
  
	
  5)	
  	
  Movimento	
  de	
  massa	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  	
  	
  	
  	
  
	
  	
  6)	
  PH	
  	
  	
  	
  
	
   	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
Somente	
  visualizado	
  em	
  pequenos	
  e	
  
grandes	
  Ruminantes	
  
Avaliar:	
  presente	
  ou	
  ausente	
  
Ideal	
  ao	
  redor	
  de	
  7	
  
Fonte:	
  <	
  http://ginecesmtc.blogspot.com.br/2013_02_01_archive.html>	
  
Fonte:	
  <http://www.blog.mcientifica.com.br/a-­‐escala-­‐de-­‐ph/>	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  15	
  
	
  
Avaliação	
  Microscópica	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  16	
  
	
  
1)	
  Turbilhonamento	
  	
  	
  	
  	
  	
  
	
   Apenas	
  em	
  ruminantes.	
  	
  
Avaliar	
  de	
  0	
  a	
  5.	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Colocar	
  1	
  gota	
  do	
  sêmen	
  coletado	
  sobre	
  a	
  lâmina,	
  sem	
  lamínula;	
  	
  
Colocar	
  a	
  lâmina	
  sobre	
  uma	
  placa	
  aquecida	
  a	
  37	
  ºC;	
  
	
   Verificar	
  o	
  turbilhonamento	
  na	
  borda	
  da	
  gota.	
  
0	
  =	
  parado,	
  células	
  mortas	
  –	
  sem	
  sptz	
   3	
  =	
  motilidade	
  normal	
  –	
  quantidade	
  esperada	
  de	
  sptz	
  
1	
  =	
  pouquíssima	
  motilidade	
  –	
  pouquíssimos	
  sptz	
   4	
  =	
  motilidade	
  aumentada	
  –	
  muitos	
  sptz	
  
2	
  =	
  pouca	
  motilidade	
  –	
  poucos	
  sptz	
   5	
  =	
  presença	
  de	
  ondas	
  rápidas	
  e	
  escuras	
  –	
  muitíssimos	
  sptz	
  
	
  2)	
  MRP	
  –	
  Movimento	
  Retilíneo	
  Progressivo	
  
	
   Colocar	
  1	
  gota	
  do	
  sêmen	
  puro	
  sobre	
  a	
  lâmina	
  +	
  lamínula	
  (sêmen	
  de	
  ruminantes,	
  deve-­‐se	
  diluir	
  em	
  NaCl	
  aquecida	
  a	
  37	
  ºC);	
  
	
   Colocar	
  a	
  lâmina	
  sobre	
  uma	
  placa	
  aquecida	
  a	
  37	
  ºC;	
  
	
   Verificar	
  se	
  tem	
  MRP	
  ;	
  	
   	
  
	
   Avaliar	
  de	
  0	
  a	
  100%	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
Fonte:	
  <http://osfundamentosdafisica.blogspot.com.br/2011/03/cursos-­‐do-­‐blog>-­‐mecanica_28.html	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  17	
  
	
  
3) Vigor	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  4)	
  Concentração	
  []	
  	
  
	
   Tem	
  que	
  escolher	
  	
  corretamente	
  a	
  proporção	
  que	
  irá	
  usar	
  para	
  diluição	
  do	
  sêmen	
  a	
  fim	
  de	
  descobrir	
  a	
  []	
  de	
  sptz/ml	
  
do	
  volume	
  coletado.	
  
	
  
	
  
	
   Intensidade	
  do	
  movimento;	
  
	
   Avaliado	
  de	
  0	
  a	
  5	
  
	
   Utiliza-­‐se	
  a	
  mesma	
  lâmina	
  do	
  MRP	
  
	
  
Fonte:	
  <http://www.scientia.blog.br/wordpress/16-­‐03-­‐2013/8924>	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  18	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  19	
  
	
  
	
  4.1)	
  Câmara	
  de	
  Newbauer	
  	
  
	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  20	
  
	
  
	
   	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  21	
  
	
  
Após	
  obter	
  a	
  []	
  dos	
  espermatozoides	
  nós	
  podemos:	
  
	
  
	
  
ü Fazer	
  a	
  Análise	
  Patológica	
  
	
  
o Esfregaço	
  e	
  Coloração:	
  analisar	
  defeitos	
  na	
  cabeça	
  e	
  no	
  acrossomo;	
  
o Fixação	
  –	
  Câmara	
  Úmida:	
  analisar	
  todos	
  os	
  defeitos.	
  
	
  
	
  
ü Preparar	
  o	
  Diluidor	
  
	
  
o Para	
  resfriamento	
  
o Para	
  congelamento	
  
	
  
	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  22	
  
	
  
5)	
  Análise	
  Patológica	
  	
  -­‐	
  Esfregaço	
  e	
  Coloração	
  	
  
	
  
	
  
OBS.:	
  Colocar	
  uma	
  gota	
  de	
  sêmen	
  puro	
  em	
  lâmina	
  aquecida	
  a	
  37	
  ºC	
  (se	
  for	
  sêmen	
  de	
  ruminante,	
  deve-­‐se	
  diluir	
  0,02ml	
  de	
  sêmen	
  em	
  1ml	
  de	
  
solução	
  fisiológica	
  aquecida).	
  Os	
  sptz	
  devem	
  morrer	
  pelo	
  esfregaço.	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  23	
  
	
  
5)	
  Análise	
  Patológica	
  -­‐	
  Fixação	
  /	
  Câmara	
  Úmida	
  
	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  24	
  
	
  
	
   	
  
Tanto	
  no	
  método	
  de	
  Coloração	
  como	
  no	
  método	
  da	
  Câmara	
  Úmida,	
  são	
  contados	
  200	
  
	
  espermatozóides	
  com	
  um	
  aumento	
  de	
  1.000	
  a	
  1.250	
  vezes.	
  Destes	
  200,	
  vou	
  avaliar	
  a	
  porcentagem	
  de	
  	
  
alterações	
  considerada	
  normal	
  para	
  cada	
  espécie:	
  
	
  
ü Caprinos	
  e	
  ovinos	
  –	
  15%	
  	
  
ü Suínos	
  –	
  20%	
  
ü Bovinos	
  –	
  30%	
  
ü Equinos	
  –	
  25-­‐30%	
  
	
  
A	
  Câmara	
  Úmida	
  é	
  o	
  método	
  mais	
  utilizado	
  nas	
  centrais	
  de	
  coleta	
  para	
  avaliar	
  todas	
  as	
  patologias	
  dos	
  
	
  espermatozóides.	
  A	
  Coloração	
  é	
  realizada	
  quando	
  a	
  Câmara	
  Úmida	
  deixa	
  dúvidas	
  quanto	
  a	
  avaliação	
  das	
  	
  
cabeças	
  e	
  do	
  acrossomo.	
  	
  
	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  25	
  
	
  
Diluidores	
  
	
  
	
   Usamos	
  o	
  diluidor	
  para	
  aumentar	
  o	
  volume	
  do	
  sêmen.	
  Isso	
  faz	
  com	
  que	
  eu	
  insemine	
  mais	
  fêmeas	
  com	
  o	
  mesmo	
  
“volume	
  original”;	
  congele	
  ou	
  resfrie	
  esse	
  sêmen.	
  
	
  
Componentes	
  do	
  Diluidor	
  
ü lecitina	
  ou	
  caseína:	
  proteínas	
  presentes	
  no	
  ovo	
  e	
  no	
  leite	
  que	
  protegem	
  o	
  sptz	
  no	
  resfriamento	
  (37	
  a	
  5ºC)	
  por	
  até	
  
24h.	
  
ü glicerol:	
  protege	
  os	
  sptz	
  em	
  temp.	
  abaixo	
  de	
  0ºC.	
  Ele	
  desidrata	
  a	
  célula	
  evitando	
  que	
  se	
  rompa	
  quando	
  congelar;	
  
ü glicose	
  ou	
  frutose:	
  fornece	
  energia	
  para	
  o	
  sptz.	
  O	
  ovo	
  já	
  tem,	
  acrescentar	
  quando	
  utilizar	
  um	
  diluidor	
  a	
  base	
  de	
  leite;	
  
ü citrato	
  de	
  sódio:	
  funciona	
  como	
  tampão,	
  mantém	
  o	
  pH	
  em	
  7;	
  
ü penicilina	
  e	
  estreptomicina:	
  antibióticos,	
  para	
  não	
  haver	
  proliferação	
  de	
  bactérias;	
  
ü antioxidantes:	
  reduzem	
  os	
  radicais	
  livres	
  e	
  impedem	
  a	
  morte	
  celular	
  por	
  oxidação.	
  Não	
  é	
  obrigatório.	
  
	
  
Preparação	
  do	
  diluidor	
  com	
  GEMA	
  de	
  OVO	
  –	
  50	
  ml	
  
ü 20%	
  de	
  gema	
  de	
  ovo	
  =	
  10	
  ml	
  
ü 1,47g	
  de	
  citrato	
  de	
  sódio	
  
ü 0,01g	
  de	
  estreptomicina	
  
ü 0,01g	
  de	
  penicilina	
  
ü 7%	
  de	
  glicerol	
  =	
  3,5	
  ml	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  26	
  
	
  
	
  
	
  
Obs.:	
  A	
  estreptomicina	
  e	
  a	
  penicilina	
  são	
  adicionadas	
  após	
  a	
  homogeneização.	
  Deve-­‐se	
  acrescentá-­‐los	
  	
  e	
  homogeneizar	
  novamente.	
  	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  27	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  28	
  
	
  
	
  
O	
  glicerol	
  pode	
  ser	
  adicionado	
  de	
  duas	
  formas	
  	
  	
  
ü Em	
  1	
  etapa:	
  Para	
  acrescentar	
  3,5	
  ml	
  de	
  glicerol	
  deve-­‐se	
  tirar	
  3,5	
  ml	
  da	
  solução	
  PRONTA	
  para	
  
resfriamento.	
  
Acrescentando	
  o	
  sêmen:	
  Aquecer	
  a	
  solução	
  PRONTA	
  (a	
  quantidade	
  varia	
  conforme	
  volume	
  
do	
  sêmen)	
  a	
  37ºC	
  para	
  não	
  ter	
  choque	
  térmico,	
  adicionar	
  o	
  sêmen	
  e	
  congelar	
  se	
  for	
  o	
  caso.	
  
	
  
	
  
ü Em	
  2	
  etapas:	
  Dividir	
  em	
  Fa	
  	
  -­‐	
  sem	
  glicerol	
  e	
  Fb	
  -­‐	
  com	
  glicerol	
  (mesmo	
  processo	
  	
  que	
  em	
  1	
  etapa)	
  
com	
  25ml	
  cada	
  porção.	
  
Acrescentando	
  o	
  sêmen:	
  Aquecer	
  apenas	
  a	
  Fa	
  a	
  37ºC	
  e	
  adicionar	
  o	
  sêmen.	
  Resfriar	
  até	
  
5ºC,	
  gradativamente.	
  Misturar	
  a	
  Fb	
  à	
  Fa,	
  ambas	
  a	
  5ºC	
  em	
  3	
  etapas,	
  homogeneizando	
  e	
  
esperando	
  10	
  minutos	
  a	
  cada	
  etapa	
  para	
  posteriormente	
  congelar	
  o	
  sêmen.	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  29	
  
	
  
Cálculo	
  do	
  Volume	
  do	
  Diluidor	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  30	
  
	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  31	
  
	
  
Etapas	
  da	
  congelação	
  
	
  
	
  
1. Coleta	
  do	
  sêmen	
  
2. Análise	
  do	
  sêmen	
  
3. Diluição	
  
4. Resfriamento	
  
5. *	
  Glicerolização	
  
6. *	
  Equilíbrio	
  
7. Identificação	
  
8. Envasamento	
  
9. Congelação	
  
	
  
*	
  Se	
  optar	
  pela	
  glicerolização	
  em	
  uma	
  etapa	
  ao	
  invés	
  de	
  duas,	
  deve-­‐se	
  pular	
  os	
  itens	
  5	
  e	
  6.	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  32	
  
	
  
Resfriamento	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  33	
  
	
  
Glicerolização	
  	
  e	
  Equilíbrio	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  34	
  
	
  
Identificação	
  
	
   	
  
	
   Alguns	
  laboratórios	
  usam	
  a	
  coloração	
  do	
  material	
  espermático;	
  escrita	
  e	
  carimbo	
  para	
  identificação	
  do	
  sêmen.	
  	
  	
  
Devemos	
  escrever	
  nas	
  palhetas:	
  
ü data	
  da	
  colheita	
  
ü nome	
  do	
  animal	
  
ü nº	
  do	
  animal	
  
ü nº	
  da	
  partida	
  (se	
  houver	
  mais	
  de	
  uma	
  coleta	
  no	
  mesmo	
  dia)	
  
Envasamento	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  35	
  
	
  
	
  
	
  
ü Selar	
  a	
  outra	
  extremidade	
  com	
  
álcool	
  polivinílico	
  (em	
  pó);	
  
	
  
ü Deixar	
   a	
   palheta	
   identificada	
  
na	
  geladeira	
  por	
  aprox.	
  4h,	
  até	
  
atingir	
  5ºC	
  
	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  36	
  
	
  
Congelação	
  	
  
	
  Método	
  Vertical	
  
	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  -­‐196	
  ºC	
  	
  Nz	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
Método	
  Horizontal	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
   vapor	
  de	
  N	
  líquido	
  
	
  
	
  
Botijão	
  de	
  volume	
  pequeno	
  onde	
  são	
  introduzidos	
  
suporte	
  contendo	
  as	
  palhetas	
  que	
  ficam	
  imersas	
  em	
  1	
  cm	
  
de	
  N	
  líquido	
  por	
  3	
  min.	
  	
  Após	
  este	
  período	
  há	
  total	
  
imersão	
  no	
  N	
  líquido.	
  
	
  
	
   	
  
-­‐196	
  ºC	
  	
  Nz	
  
	
  
Caixa	
  grande	
  de	
  isopor	
  com	
  +	
  ou	
  –	
  3	
  litros	
  de	
  Nz,	
  com	
  4	
  cm	
  
de	
  altura.	
  Ficam	
  suspensas	
  no	
  vapor	
  de	
  10	
  a	
  15	
  min.	
  	
  Após	
  
este	
  período	
  há	
  total	
  imersão	
  no	
  N	
  líquido.	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  37	
  
	
  
	
  
Curva	
  de	
  Congelação	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Avaliar/Diluir	
  
Glicerolização/equilíbrio	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
e	
  envasamento	
  
Congelação	
  
37	
  ºC	
  
resfriamento:	
  1,5	
  a	
  2H	
  
5	
  ºC	
  
-­‐	
  196	
  ºC	
  
	
  	
  	
  	
  Avaliar	
  	
  MRP	
  nas	
  três	
  etapas.	
  Devemos	
  congelar	
  apenas	
  se:	
  nas	
  duas	
  primeiras	
  
avaliações	
  mantiver	
  o	
  MRP.	
  	
  A	
  terceira	
  avaliação	
  é	
  realizada	
  após	
  o	
  descongelamento.	
  	
  
equilíbrio:	
  6H	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  38	
  
	
  
	
  
Descongelação	
  	
  
	
  
	
   Descongelar	
  em	
  banho-­‐maria	
  de	
  35	
  a	
  37	
  ºC	
  por	
  25	
  a	
  30	
  segundos	
  (tempo	
  mínimo);	
  
	
   Usar	
  1	
  das	
  palhetas	
  para	
  descongelar	
  e	
  usar	
  como	
  amostra	
  para	
  testar	
  o	
  lote	
  e	
  saber	
  se	
  não	
  morreram.	
  Avaliar	
  o	
  	
  
MRP	
  após	
  a	
  diluição,	
  após	
  a	
  refrigeração	
  e	
  após	
  a	
  descongelação.	
  
	
  
	
  
Teste	
  de	
  Termorresistência	
  (T.	
  T.)	
  
	
  
LENTO	
   38	
  ºC	
  por	
  5h	
  
RÁPIDO	
   46	
  ºC	
  por	
  3’0	
  
STRESSADO	
   T.T.	
  +	
  24H	
  a	
  5ºC	
  
MODIFICADO45	
  ºC	
  por	
  1h	
  
	
  
	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  39	
  
	
  
Esfregaço	
  e	
  Coloração	
  
	
  
Novamente	
  para	
  avaliação	
  de	
  acrossomos	
  íntegros.	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  
OBS.:	
  Colocar	
  uma	
  gota	
  de	
  sêmen	
  puro	
  em	
  lâmina	
  aquecida	
  a	
  37	
  ºC	
  (se	
  for	
  sêmen	
  de	
  ruminante,	
  deve-­‐se	
  diluir	
  0,02ml	
  de	
  sêmen	
  em	
  1ml	
  de	
  
solução	
  fisiológica	
  aquecida).	
  Os	
  sptz	
  devem	
  morrer	
  pelo	
  esfregaço.	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  40	
  
	
  
PATOLOGIAS	
  
	
  
Defeitos	
  MAIORES	
  
	
   Qualquer	
  anormalidade	
  que	
  tenha	
  sido	
  relacionada	
  com	
  infertilidade	
  ou	
  condição	
  patológica	
  do	
  testículo	
  ou	
  do	
  	
  epidídimo,	
  não	
  sendo	
  possível	
  a	
  fertilização.	
  
	
   	
  	
  	
  
Fonte:	
  <http://eagaspar.com.br/mcguido/morfologia_espermatica.htm>	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  41	
  
	
  
	
   	
  	
  
	
   	
  
Fonte:	
  <http://eagaspar.com.br/mcguido/morfologia_espermatica.htm>	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  42	
  
	
  
	
   	
   	
   	
   	
  
	
   	
  
Fonte:	
  <http://eagaspar.com.br/mcguido/morfologia_espermatica.htm>	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  43	
  
	
  
1)	
  ACROSSOMO	
  –	
  	
  Defeitos	
  maiores	
  	
  
A)	
  	
  	
  Contorno	
  anormal	
  	
   	
   	
  
B)	
  	
  	
  Enrugado	
  	
  
C)	
  	
  	
  Destacado	
  	
  
D)	
  	
  	
  Knobbed	
  sperm	
  –	
  Grânulo	
  persistente	
  do	
  acrossomo.	
  É	
   formado	
  na	
  espermiogênese.	
  Pode	
  ser	
  hereditário.	
  
Causa	
  infertilidade.	
  	
  2)	
  CABEÇA	
  -­‐	
  Defeitos	
  maiores	
  	
  
A)	
  	
  Piriforme	
  (normal	
  em	
  suínos)	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  B)	
  	
  Estreita	
  na	
  base	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  C)	
  	
  Contorno	
  anormal	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  D)	
  	
  Dupla	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  E)	
  	
  Diadem	
  defect	
  ou	
  pouch	
  formation	
  –	
  Formado	
  na	
  espermiogênese,	
  	
  causado	
  por	
  agentes	
  virais,	
  stress,	
  degeneração	
  
testicular	
  (vários	
  vacúolos	
  	
  no	
  meio	
  da	
  cabeça)	
  –	
  É	
  invaginação	
  da	
  membrana	
  plasmática.	
  	
  Pode	
  formar	
  uma	
  cratera,	
  um	
  
único	
  vacúolo	
  gde.	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  F)	
  	
  Espermatozóide	
  decapitado	
  –	
  É	
  hereditário,	
  está	
  relacionado	
  com	
  a	
  degeneração	
  e	
  hipoplasia	
  testicular	
  –	
  não	
  há	
  
presença	
  de	
  cabeças,	
  apenas	
  caudas	
  na	
  lâmina)	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  44	
  
	
  
	
  3)	
  COLO	
  -­‐	
  Defeitos	
  maiores	
  
A)	
  	
  	
  Implantação	
  retroaxial	
  –	
  Relacionado	
  a	
  degeneração	
  testicular	
  e	
  imaturidade	
  sexual	
  	
  
B)	
  	
  	
  Gota	
  citoplasmática	
  proximal	
  –	
  >	
  3%	
  reflete	
  degenaração	
  ou	
  hipoplasia	
  testicular,	
  disfunção	
  epididimária	
  ou	
  
imaturidade	
  sexual	
  	
  	
  	
  	
  	
  4)	
  PEÇA	
  INTERMEDIÁRIA	
  –	
  Defeitos	
  maiores	
  	
  
A)	
  	
  	
   Corkscrew	
   Defect	
   –	
   peça	
   intermediária	
   em	
   forma	
   de	
   saca-­‐rolha,	
   relacionada	
   a	
   degeneração	
   testicular	
   e	
  
touros	
  idosos	
  	
  	
  
B)	
  	
  	
  Bent	
  tail	
  –	
  Flexão	
  distal	
  da	
  peça	
  intermediária	
  –	
  Disfunção	
  epididimária,	
  estresse,	
  insolação.	
  	
  	
  	
  
C)	
  	
  	
  Pseudogota	
  –	
  grânulos	
  densos	
  encobertos	
  por	
  mitocôndrias,	
  tem	
  caráter	
  genético	
  	
  	
  
	
  5)	
  CAUDA	
  –	
  Defeitos	
  maiores	
  
A)	
  	
  	
  Dag	
  defect	
  –	
  cauda	
  fortemente	
  dobrada	
  ou	
  enrolada	
  	
  –	
  É	
  hereditário,	
  manifesta-­‐se	
  no	
  epidídimo.	
  Comum	
  na	
  
raça	
  Jersey.	
  
B)	
  	
  	
  Dag	
  like	
  defect	
  –	
  cauda	
  fortemente	
  enrolada	
  ou	
  dobrada	
  em	
  outras	
  raças.	
  Lesão	
  na	
  bainha	
  mitocondrial	
  
durante	
  a	
  espermiogênese.	
  	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  45	
  
	
  
Defeitos	
  MENORES	
  
	
  
Também	
  podem	
  causar	
  infertilidade	
  mais	
  é	
  menos	
  provável,	
  pode	
  haver	
  fertilização.	
  	
  
	
   	
   	
   	
  	
  	
  	
  	
  
Gota	
  
citoplasmática 
distal / cauda 
dobrada 
	
  
Fonte:	
  <http://eagaspar.com.br/mcguido/morfologia_espermatica.htm>	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  46	
  
	
  
	
  1)	
  CABEÇA	
  -­‐	
  Defeitos	
  menores	
  	
  
A)	
  Estreita	
  
B)	
  Pequena	
  normal	
  
C)	
  Gigante	
  	
  	
  	
  2)	
  COLO	
  -­‐	
  Defeitos	
  menores	
  
	
  Implantação	
  abaxial	
  –	
  relacionado	
  a	
  degeneração	
  testicular	
  ou	
  imaturidade	
  sexual	
  	
  	
  	
  	
  	
  3)	
  CAUDA	
  -­‐	
  Defeitos	
  menores	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  A)	
  	
  	
  Cauda	
  levemente	
  enrolada	
  ou	
  dobrada	
  –	
  defeitos	
  menores	
  que	
  ocorrem	
  no	
  final	
  da	
  cauda	
  	
  	
  	
  B)	
  	
  	
  Gota	
  citoplasmática	
  distal	
  –	
  A	
  gota	
  não	
  escorrega	
  até	
  o	
  final,	
  não	
  desprende.	
  	
  	
  	
  	
  	
  
Tecnologia	
  e	
  Reprodução	
  Animal	
   Página	
  47	
  
	
  
Referências	
  
	
  
Imagem	
  da	
  capa	
  
Fonte:	
  <http://vocevaientender.wordpress.com/2011/11/29/informacao-­‐inutil-­‐do-­‐dia-­‐quantos-­‐mb-­‐de-­‐informacao-­‐tem-­‐
um-­‐espermatozoide/>	
  
	
  
	
  
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  para	
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  elaboração	
  deste	
  material	
  de	
  estudo.	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  A	
  revisão	
  feita	
  gentilmente	
  pela	
  professora	
  Silvia	
  Ferrari	
  e	
  todas	
  as	
  ideias	
  geniais	
  do	
  professor	
  Fernando	
  Dal	
  Sasso	
  foram	
  	
  de	
  grande	
  valia	
  e	
  possibilitaram	
  que	
  um	
  conteúdo	
  completo	
  fosse	
  disponibilizado	
  da	
  melhor	
  maneira	
  possível.	
  Portanto,	
  todo	
  	
  esse	
  entusiasmo	
  que	
  encontramos	
  desses	
  dois	
  profissionais	
  foram	
  fundamentais	
  para	
  que	
  essa	
  apostila	
  ganhasse	
  vida.	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Muito	
  obrigada,	
  	
  	
  	
  	
  	
  Carol	
  Lopez	
  e	
  Fernanda	
  Campos