Eletroforese resumida

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOFÍSICA
DISSERTAÇÃO SOBRE ELETROFORESE
Anna Lycia Oliveira Barros
Matrícula: 383974
Fortaleza – Ceará
25/05/2019
As soluções biológicas são multicomponentais (HENEINE, 2003), dessa forma, para que o estudo das substâncias presentes dissolvidas na água do componente biológico fosse possível, foi necessário o desenvolvimento de técnicas que permitissem a separação e identificação desses compostos (peptídeos, vitaminas, ácidos nucléicos etc.) viabilizando o estudo do sistema como um todo para entender seu funcionamento (HENEINE, 2003).
A eletroforese consiste em uma técnica versátil que permite a separação de substâncias em solução que possuem carga elétrica livre e deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico, sendo usada principalmente para a separação de proteínas e ácidos nucléicos (HENEINE, 2003; WILSON & WALKER, 2010). Desenvolvida inicialmente por Kunkel e Teselius no ano de 1951, essa técnica foi sendo aperfeiçoada com passar do tempo com a introdução de uma camada suporte de amido e de poliacrilamida (COSTA; SOUSA, 1999). 
Diversas biomoléculas como ácidos nucléicos, aminoácidos, peptídeos e proteínas possuem grupos funcionais ionizáveis, o que faz com que essas moléculas apresentem carga positiva ou negativa em determinado valor de pH (WILSON & WALKER, 2010). Sendo assim, o princípio básico da técnica consiste no deslocamento dessas moléculas carregadas sobre a matriz a uma velocidade que depende de sua carga elétrica líquida, do seu tamanho e forma, além da força do campo aplicado e das condições do meio como viscosidade, pH e temperatura (COSTA; SOUSA, 1999; HENEINE, 2003; ROCHA et al., 2005).
Existem dois tipos de eletroforese, a eletroforese livre, método em desuso caracterizado pela separação das substâncias em um meio completamente líquido compartimentalizado em um tubo em U; e a eletroforese em suporte, onde as substâncias são separadas em um meio sólido ou semi-sólido (HENEINE, 2003). Existem ainda outras variações do método básico que surgiram a partir do aperfeiçoamento da técnica com o decorrer do tempo, dependendo principalmente do material submetido a separação e os objetivos finais do procedimento. O equipamento básico para a realização de uma eletroforese entretanto consiste apenas em dois itens básicos: um fonte de tensão e uma unidade de eletroforese, matriz que permite a migração das moléculas de forma horizontal ou vertical (WILSON & WALKER, 2010). 
A separação em gel de agarose ou poliacrilamida foi um dos principais avanços realizados. O gel de agarose apresenta menor capacidade de resolução comparado ao gel de acrilamida e tem sua faixa de separação (tamanho dos poros do gel) determinada pela concentração de agarose, sendo que poros grandes são formados em baixas concentrações e poros menores são formados em altas concentrações (WILSON & WALKER, 2010). Essa matriz de agarose pode ser utilizada para separações de proteínas e ácidos nucleicos, sendo a principal escolha para a separação de ácidos nucléicos devido a vantagem da existência de agarose de baixo ponte de fusão que possibilita a liquefação do gel para recuperar, por exemplo, o DNA (WILSON & WALKER, 2010). O gel de poliacrilamida é produzido a partir da polimerização de monômeros de acrilamida na presença de bis-acrilamida (WILSON & WALKER, 2010). Esse gel apresenta maior capacidade de resolução permitindo a formação de um gradiente de acordo com a concentração de acrilamida (baixas porcentagens desse componente resultam em géis com tamanho de poro maior), o que possibilita que o pesquisador tenha controle sobre a dimensão dos poros no gel podendo ajustá-la de acordo com a substância submetida a separação e suas intenções, podendo obter assim um melhor padrão eletroforético (COSTA; SOUSA, 1999). Essa matriz semi-sólida, entretanto, torna o procedimento mais trabalhoso e a acrilamida é fotosensível e neurotóxica (ROCHA et al., 2005).
Dentre os dois métodos mais difundidos, cabe a essa dissertação aprofundar dois:
Eletroforese Desnaturante em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilssulfato de sódio (SDS) é um método que proporciona a separação de moléculas pelo seu tamanho e peso molecular (ROCHA et al., 2005), sendo bastante útil para acompanhar a purificação de proteínas e para a determinação de sua massa molecular relativa (WILSON & WALKER, 2010).
O procedimento prático desse método consiste no tratamento das proteínas submetidas a separação com SDS e β-mercaptoetanol. O SDS é um detergente aniônico que confere carga negativa as proteínas e o β-mercaptoetanol reduz as pontes de disulfeto que mantém a estrutura terciária de proteínas enquanto o SDS liga-se fortemente à proteína desnaturando-a (WILSON & WALKER, 2010). Na ausência do SDS, as proteínas com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel devido ao diferencial de cargas de suas estruturas tridimensionais, dessa forma a presença desse agente garante a separação da amostra exclusivamente por sua massa molecular (ROCHA et al., 2005).
O gel de acrilamida é produzido de acordo com o que foi descrito anteriormente e normalmente, depois de preparado, é depositado em cubas com canaletas ou poços para serem preenchidos com as amostras. O gel então é banhado em cima e embaixo por uma solução que fornece os íons para conduzir a corrente, com poder tamponante para manter o pH em faixa relativamente constante e garantir que as proteínas não tenham sua carga alterada pelas flutuações no pH, pois qualquer variação no pH pode afetar a carga líquida e portanto a mobilidade da partícula. Essa solução tampão mantém contato indireto através do gel.
O tampão de amostra contém um corante (azul de bromofenol) que permite a visualização da corrida eletroferética e glicerol, que aumenta a densidade final da amostra, fazendo com que ela permaneça no fundo do poço de aplicação (WILSON & WALKER, 2010). Sendo assim, as amostras são aplicadas nos pocinhos do gel de empilhamento, que é mais poroso e permite que as amostras repousem no fundo do poço igualmente para formar bandas finas antes de entrar no gel de separação igualmente e logo depois a fonte de tensão é ligada, gerando uma diferença de potencial que leva às proteínas a migrarem para o polo positivo (ROCHA et al., 2005; WILSON & WALKER, 2010). Dessa forma, as proteínas menores migrarão mais rapidamente, enquanto as maiores farão esse movimento de forma mais lenta. A mobilidade eletroforética é então comparada com a de uma proteína com massa molecular conhecida obtendo uma reta que é utilizada como padrão para o cálculo do peso molecular da proteína de interesse (ROCHA et al., 2005). Na corrida é usado um corante com peso molecular muito pequeno, esse vai correr mais rápido que as proteínas de interesse e quando chegar no fundo é o sinal para parar a corrida impedindo que proteínas saiam, depois o gel é retirado e colocado em uma solução de coloração para depois ser descolorido para que apenas as bandas fiquem visíveis no gel transparente (WILSON & WALKER, 2010).
Pode-se usar a relação Mobilidade relativa = para descobrir a massa da proteína de interesse.
Eletroforese bidimensional (2D)
Na eletroforese bidimensional, as proteínas além de serem separadas por seu peso molecular, também são separadas a partir do seu ponto isoelétrico. A primeira dimensão é denominada focalização isoelétrica ou eletrofocalização, onde as amostras são submetidas à um gel (fita) de poliacrilamida que apresenta um gradiente de pH (3-10). As proteínas amostrais são então submetidas a um campo elétrico e migram até atingirem uma posição estacionária onde possuam carga líquida zero (ponto isoelétrico) (ROCHA et al., 2005).
Após essa eletrofocalização, as proteínas então são submetidas a mesma separação na presença de SDS, garantindo assim que essas sejam separadas na primeira dimensãode acordo com seus pontos isoelétricos e na segunda dimensão em função de sua massa molecular (SDS- PAGE) (ROCHA et al., 2005). 
Com os avanços tecnológicos e descobertas de novos compostos, a eletroforese 2D passou a ser a principal técnica de separação de proteínas utilizada por possuir uma grande resolução e capacidade de separar um número grande de proteínas de uma amostra complexa possibilitando a análise de expressão gênica (ROCHA et al., 2005).
Em conclusão, é bastante claro os benefícios múltiplos que o desenvolvimento da prática da eletroforese trouxe ao campo científico, sendo de grande utilidade na análise de proteínas e de fácil aplicação em estudos que abordam a variação genética presente nos organismos. A partir dessa técnica tem destaque sua ação na definição da proteômica, que implica diretamente em campos da biologia e biotecnologia como a descoberta de vias metabólicas e seus componentes; identificação de novas moléculas bioativas levando ao desenvolvimento de novos medicamentos; identificação e caracterização de marcadores biológicos de um determinado estado patológico, o que permite o diagnóstico precoce de doenças e o acompanhamento da evolução do tratamento (ROCHA et al., 2005). 
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
COSTA, M. R.; SOUSA, C. DO S. M. DE. Manual de eletroforese de isoenzimas em gel de poliacrilamida. p. 28, 1999. 
HENEINE, Ibrahim Felippe. Biofísica básica. 2. Ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2003.
ROCHA, T. L. et al. Comunicado 136 Técnico. Embrapa Comunicado Técnico, p. 1–12, 2005. 
WILSON & WALKER. Degustação de trechos de livros sugeridos Técnicas eletroforéticas. [s.l: s.n.].