Extração de RNA de Tecidos de Plantas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA
Disciplina: Biologia Molecular 
Prof. Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar
TÉCNICA EM BIOLOGIA MOLECULAR: EXTRAÇÃO DE RNA DE TECIDOS DE PLANTAS 
 
Discentes: 
Adauto Alves da Silva Júnior (2017110047)
Carlos Henrique Pinheiro Rodrigues (2017111299)
Gurupi – TO
28/11/2018
INTRODUÇÃO
Biologia Molecular é a ciência que estuda a biologia em nível molecular, com ênfase nas estruturas e finalidades do material genético, e a expressão das proteínas por eles produzidas. No emprego desses estudos comumente precisa-se realizar técnicas analíticas que mesclam conhecimentos de outras áreas como da Química, Bioquímica, Genética e Microbiologia, para se conseguir manipular células, ácidos nucleicos, proteínas e uma finidade de outras moléculas. 
As técnicas de biologia molecular utilizam os ácidos nucleicos – ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), advindas de amostras biológicas como matéria-prima para a realização de uma finidade procedimentos. O material genético está localizado no interior da célula, disperso no citoplasma, no caso dos procariotos, ou no núcleo e em organelas especificas (mitocôndrias e cloroplastos) nos eucariotos. Para a realização das análises moleculares com eficiência e necessária a separação dos ácidos nucleicos do restante dos constituintes das células, utilizando técnicas de extração de DNA ou RNA.
Vários protocolos de extração de DNA ou RNA são encontrados na literatura, a escolha do mais adequado deve levar em consideração a molécula desejada (nesse caso RNA), o tipo de amostra (tecido de plantas), o grau de pureza, o rendimento, além da disponibilidade de recursos. Deve-se conhecer a fundo as características das células envolvidos, como suas especificidades e a localização das moléculas de ácidos nucleicos, pois é importante para o planejamento dos procedimentos a serem realizados.
Em geral, plantas contêm grande quantidade de metabólitos secundários, fenólicos e polissacarídeos em seus tecidos, o que pode comprometer a extração e purificação de moléculas de RNA. A extração do RNA é fundamental para análises moleculares do transcriptoma, baseado nos métodos de Northern, PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR), construção de bibliotecas de cDNA, ESTs, entre outras (IBELLI et al. 2007), para a realização desses experimentos é necessário que o RNA seja extraído e purificado eficientemente, mantendo sua integridade e qualidade.
Devido à presença das complexidades da extração de RNA, não existe um método padrão para o isolamento de RNA que possa ser utilizado para todas as espécies de plantas (CARDILLO et al., 2006). A presença de uma grande gama de metabólitos secundários torna difícil a padronização entre os diferentes tecidos e a obtenção de RNA de qualidade (CAMPOS et al., 2010). 
Os métodos para isolamento de RNA baseiam-se na lise e na desnaturação das células que permitem a liberação dos ácidos nucleicos totais e na presença de inibidores que impedem a ação de ribonucleases (RNases) (AUSUBEL et al., 1998). A presença de RNases estáveis e ativas nos tecidos é a principal dificuldade na extração de RNA, pois fazem com que o RNA seja rapidamente degradado. Sendo assim, a primeira etapa na maioria dos métodos de isolamento de RNA após o tratamento dos tecidos, é a imediata exposição deste material a tampões de extração que apresentam substâncias como o cloreto de lítio, que auxilia a precipitação do RNA, e o isotiocianato de guanidina, que permite a manutenção do RNA intacto nas etapas posteriores da extração por meio da degradação das ribonucleases endógenas (SAMBROOK ; RUSSEL, 2002).
Existem vários kits comerciais disponíveis que possuem em sua composição reagentes combinados, como isotiocianato de guanidina e fenol, possibilitando uma extração de RNA mais rápida que a dos protocolos convencionais e garantindo a integridade do material. A precipitação do RNA é feita com um álcool, como por exemplo, o isopropanol. Nesta etapa, observa-se uma nuvem branca contendo o RNA. Posteriormente, uma limpeza com álcool permite a retirada de sais que tenham ainda aderido ao precipitado de RNA (AUSUBEL et al., 1998). 
Diversos estudos descrevem diferentes protocolos de extração para diferentes tecidos vegetais ricos em polifenóis ou polissacarídeos, que são os tecidos que impõem uma maior dificuldade para isolamento de boa quantidade de RNA e de alta qualidade. Entretanto, esses estudos desenvolvem métodos tecidos-específicos e, geralmente, para uma única espécie (AZEVEDO et al., 2003).
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OBJETIVOS
2.1	Objetivos gerais
A Compreensão e a reprodução das técnicas de extração de RNA de tecidos de plantas. 
2.2	Objetivos específicos 
Através de conhecimentos teóricos conseguir reproduzir as técnicas moleculares com auxílio de protocolos especializados, compreender a função de cada reagente e equipamento.
METODOLOGIA
3.1	Materiais
3.2	Procedimentos
 
RESULTADOS E DICUSSÃO
 
Para extração dos tecidos de plantas as amostras podem ser obtidas a partir de folhas. O acondicionamento adequado das amostras após a coleta e essencial para a sua preservação até o momento da extração. O DNA apresenta estabilidade maior, enquanto o RNA e rapidamente degradados. Pode-se evitar isso por meio do congelamento das amostras em nitrogênio liquido ou do uso de reagentes conservantes.
Os tecidos sólidos, como folhas, precisam passar por uma etapa de quebra das estruturas rígidas, com o objetivo de aumentar a superfície de contato para a ação dos reagentes nas etapas seguintes. A quebra pode ser realizada por picotagem ou por maceração, associados ao congelamento das amostras com nitrogênio liquido. As amostras de pequeno tamanho podem ser maceradas utilizado um bastão de vidro em um tubo de fundo cônico de 1,5 ou 2mL contendo a solução tampão de extração.
A lise celular envolve o rompimento das celulas e deve ser realizada em solucoes tamponadas,
geralmente contendo um detergente e os reagentes tris-hidroximetil aminometano (Tris),
cloreto de sodio (NaCl) e acido etileno diamino tetra-acetico (EDTA).
O detergente atua sobre os lipideos, promovendo o rompimento das membranas e a liberacao
do conteudo celular. Diferentes tipos de detergentes sao utilizados, como o dodecil sulfato de
sodio (SDS), tween-20, triton X-100, sarcosil e brometo de cetil-trimetilamonio (CTAB), sendo
que cada um apresenta especificidades e aplicacoes distintas. O CTAB, por exemplo, tambem e
utilizado para a separacao dos polissacarideos dos acidos nucleicos, mediante centrifugacao.
O reagente Tris mantem o pH da solucao tampao de lise estavel (proximo a 8,0), evitando que o
DNA, ao ser liberado, sofra o ataque das enzimas desoxirribonucleases (DNases) endogenas que
o degradam, as quais atuam em pH otimo de 7,8. A adicao do agente quelante EDTA tambem
auxilia na inibicao da acao das DNases por se ligar aos cofatores Ca+2 e Mg+2 da enzima DNase.
O NaCl contribui rompendo ligacoes ionicas das cadeias peptidicas, auxiliando na desnaturacao
das proteinas e adicionalmente promove a aglomeracao das moleculas de DNA.
Muitas vezes adiciona-se a enzima proteinase K ao tampao de lise para a digestao de proteinas,
o que auxilia na lise das celulas e na separacao dos constituintes celulares (etapa a seguir).
Agentes antioxidantes, como β-mercaptoetanol, PVP (polivinilpirrolodona) e BSA (albumina
do soro bovino), tambem podem ser acrescidos a solucao de extracao. O B-mercaptoetanol
evita a oxidacao dos acidos nucleicos pelo contato com compostos fenolicos presentes
especialmente em tecidos vegetais.
Apos a lise das membranas, os acidos nucleicos sao liberados na solucao aquosa juntamente
com outros constituintes celulares dos quais devem ser isolados. Para esse fim, sao utilizados
solventes organicos, como o fenol oucloroformio, que desnaturam proteinas. Nessa etapa,
apos a centrifugacao, o DNA permanecera soluvel na fase aquosa (sobrenadante), a qual
e transferida para um novo tubo, separando os acidos nucleicos de proteinas e demais
constituintes celulares presentes na interfase e fase organica (Fig. 1.1). A repeticao dessa
etapa pode elevar a pureza, entretanto pode resultar em perdas de DNA.
5	CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS
AMOSTRA & ASSAY TECHNOLOGIES, QIAGEN. RNeasy ® Mini Handbook: RNeasy Plant Mini Kit Para a purificação de RNA total a partir de plantas e fungos filamentosos. 4. ed. [S.l.: s.n.], 2012. 80 p. v. 1. Disponível em: <http://www.bea.ki.se/documents/EN-RNeasy%20handbook.pdf>. Acesso em: 24 nov. 2018.
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LIMA, Liziane Maria de et al. Conceitos Básicos de Técnicas em Biologia Molecular. Campina Grande: EMBRAPA ALGODÃO, 2008. 27 p. Disponível em: <https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CNPA-2009-09/22214/1/DOC191.pdf>. Acesso em: 24 nov. 2018.
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VERZOLA, Lívia Ferreira S. TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR. Ribeirão: USP, 2017. 17 p. Disponível em: <http://www.rpm.fmrp.usp.br/kit/Artigos/APOSTILATECNICASDEBIOLOGIAMOLECULAR2017.pdf>. Acesso em: 24 nov. 2018. 
ZAHA, Arnaldo; FERREIRA, Henrique Bunselmeyer; PASSAGLIA, Luciane M. P. (Org.). Biologia molecular básica. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 405 p.