RELATÓRIO DE VISITA TÉCNICA E VISUALIZAÇÃO DO PROCESSO DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) NO LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA DA UNIM

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MINISTÉRIO DA DUCAÇÃO
	
LUIZ FERNANDO BARBOSA DA SILVA
RELATÓRIO DE VISITA TÉCNICA E VISUALIZAÇÃO DO PROCESSO DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) NO LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA DA UNIMONTES – Campus Montes Claros
Atividade Avaliativa da disciplina Técnicas em Biologia Molecular Aplicada a Agronomia, ministrada pela professora Tatiana Tozzi Martins Souza Rodrigues, do Curso Bacharelado em Agronomia do IFNMG - Instituto Federal de Educação Ciências e Tecnologia do Norte de Minas Gerais – Campus Januária.
	
JANUÁRIA - MG
JUNNHO – 2019
INTRODUÇÃO
	Desenvolvida por Kary Banks Mullis a reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) permitiu o rápido desenvolvimento do estudo de sequências de ácidos nucléicos (MOLINA et tal, 2004).
	A técnica de PCR promove, por meio de etapas de variação de temperatura, a duplicação de cadeias de DNA in vitro. A reação de amplificação de DNA por PCR envolve o emprego dos quatro nucleotídeos (dNTP’s) do DNA, sequências iniciadoras (primers) e uma DNA polimerase termoestável. Assim, é possível a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde. O princípio da PCR envolve três etapas básicas de variação de temperatura por ciclo, ou seja: a) Desnaturação da fita molde de DNA - etapa com duração entre 30 s a 1 min a temperatura entre 92 ºC a 96 ºC; b) Pareamento de dois iniciadores sintéticos de composições distintas, que funcionam como os iniciadores da reação de polimerização, ligando-se à região complementar da fita de DNA alvo que sofrerá a duplicação. Etapa com duração de 30 s a 1 min a temperatura entre 58 ºC e 65 ºC; c) Amplificação por meio da enzima Taq DNA polimerase, das novas fitas de DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando os quatro dNTP’s como substrato da reação de polimerização. Etapa com duração entre 45 s e 1 min a 72 ºC (COSTA, 2009).
	Desde a introdução da técnica de PCR, rápidos avanços nas técnicas de genética molecular têm revolucionado a prática da patologia, anatomia e análises clínicas. As técnicas moleculares são agora aplicáveis a todas as áreas do laboratório clínico. Na anatomia patológica, apesar das análises morfológicas ainda serem a principal ferramenta de trabalho, resultados dos estudos de genética molecular têm integrado, cada vez mais, os diagnósticos nas análises cirúrgicas (MOLINA; TOBO, 2004). 
ELETROFORESE
	A análise de DNA por eletroforese é uma das técnicas fundamentais nos laboratórios de pesquisa e de diagnóstico. O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo (anôdo). A velocidade da migração depende do tamanho da molécula. Por isso em um dado momento da eletroforese moléculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz (CORREIA & POSSIK).
	A eletroforese é uma técnica laboratorial simples que fraciona proteínas presentes em diversos tipos de fluido, levando em consideração suas cargas elétricas e/ou seu peso molecular. A técnica utiliza forças eletroforéticas e eletroendosmóticas, onde um pólo positivo (ânodo) e outro negativo (cátodo) geram um potencial elétrico, que promove a migração proteica, gerando diferentes bandas, representadas por albumina e globulinas alfa, beta e gama. Dois métodos de eletroforese são utilizados atualmente, sendo eles: a eletroforese convencional por zonas e a eletroforese capilar. No primeiro método, as proteínas migram através dos poros presentes em suportes como acetato de celulose, gel de agarose ou poliacrilamida, formando zonas de proteínas no eletroforetograma. Já no segundo, as proteínas são separadas pelo seu tamanho e por outras propriedades físico-químicas, através do fluxo em um tubo capilar. Na medicina veterinária, além de ser empregada na clínica, contribuindo com o diagnóstico e o prognóstico de várias doenças, a técnica tem sido utilizada em diversas outras áreas, apresentando ampla aplicabilidade em situações distintas (OLIVEIRA et al., 2015).
	A descoberta do gel de agarose proporcionou avanços da técnica de eletroforese. Vários tipos de amostras como soro, plasma, líquor ou hemolisado de hemoglobinas eram utilizados para o exame, e isso no mesmo suporte de gel, o que tornava a técnica mais prática e viável na rotina laboratorial. A avaliação quantitativa das frações foi favorecida com o desenvolvimento desta técnica e o uso de densitômetro. A utilização do gel de agarose estimulou ainda a elaboração de outros tipos de géis, como o gel de amido (1955) e o de acrilamida (1959). Destes, apenas o gel de acrilamida foi adaptado e melhorado. O gel de amido caiu em desuso por dificultar a corrida eletroforética, já que levava cerca de 15 horas, além de necessitar de refrigeração (JEPPSON et al., 1979).
	O tipo de matriz que é usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos, de até 1kb. Alternativamente para a resolução de fragmentos superiores a 1 kb podese utilizar a agarose com baixo ponto de fusão (Low Melting) que é um tipo de agarose derivada de síntese orgânica. (OLIVEIRA et al., 2015).
IMPORTÂNCIA CIENTÍFICA
	Essa técnica aumentou a acurácia diagnóstica, mas as técnicas ainda não foram padronizadas e os resultados variam entre os laboratórios. Também se tornou possível determinar o genótipo do patógeno por método de diagnóstico molecular em laboratórios clínicos, o que pode ser útil em situações específicas. A disponibilidade de diferentes testes viabiliza o diagnóstico precoce, minimizando o potencial para disseminação da infecção e torna relevante a discussão das indicações de cada teste a partir de sua sensibilidade e especificidade.
	Existe ainda a necessidade de padronização das técnicas de PCR em diagnósticos por meio de mais estudos de como devem ser os padrões-ouro, para depois ocorrer uma padronização nas técnicas que culminem, inclusive, na sua redução de custo, tornando-a disponível nos ambientes clínicos e hospitalares.
PROCEDIMENTOS EM AULA PRÁTICA
No dia 18 de junho de 2019 os alunos da disciplina técnicas em biologia molecular aplicada a agronomia, ministrada pela professora Tatiana Tozzi, fizeram uma visita ao laboratório de biotecnologia da Universidade Estadual de Montes Claros, (UNIMONTES) com o intuito de visualizar e acompanhar todos processos realizados em um laboratório que trabalha com o estudo do DNA de diferentes seres.
 	Os alunos pesquisadores que nos receberam: Júlia, Rebeca, Cecília e Henrique, foram muito acolhedores e pacientes ao nos mostrar o passo a passo de todo o procedimento de extração e replicação de DNA pela PCR, (Reação Em Cadeia Da Polimerase), atividade que fazem frequentemente no laboratório, estudando células de origem animal e vegetal. A PCR, é considerada uma das técnicas de biologia molecular de grande importância revolucionária, esta metodologia vem sendo amplamente aplicada em diversas áreas; são exemplos: identificação de polimorfismo, genotipagem, detecção de microrganismos, doenças genéticas, entre outras.
MATERIAIS
A primeira tutora foi a Júlia que nos mostrou rapidamente todo o laboratório e alguns equipamentos que nele possuí. 
Termociclador, 
Sequenciador, 
Foto documentador, 
Centrífuga, 
Ultra frízer (não utilizado por falta de capacidade elétrica da rede que alimenta o laboratório), 
Capela de fluxo laminar, 
Frízer, 
Balança de precisão;
Banho Maria
Espectrofotômetro;
E as diversas ferramentas e soluções utilizadas no processo de PCR como:
Micropipetas e ponteiras;
Espátulas;
Microtubos;
Almofariz com pistilo;
CTAB (Brometo de Cetil Trimetilamônio);NaCl;
Tris – Hcl (pH 8,0) (tampão);
EDTA (pH 8,0) (quelante);
Clorofórmio: álcool isoamil (24:1);
Isopropanol;
Etanol 70%;
Tampão TE (Ribonuclease);
Gel de agarose;
MÉTODOS 
A aluna Rebeca foi a responsável por fazer uma breve simulação do que seria a replicação e análise do DNA, atividade cotidiana no laboratório. Nessa demonstração foi utilizado material genético de origem vegetal (folha jovem e saudável). Inicialmente foi feita a lise das células, triturando assim a amostra nesse caso uma parte da folha, é adicionada ao almofariz contendo areia autoclavada, então é feita a maceração do material utilizando o pistilo até a formação de um pó enverdecido, é então transferido para um microtubo onde é pipetado o tampão de extração, contendo 2% de CTAB, NaCl, 100 μL de Tris Hcl e 20 μL de EDTA, e a amostra é levada para o banho maria por onde fica por 30 minutos à 55 °C, após sair do banho maria é adicionado 650 μL de Clorofórmio na amostra e é levada para a centrifuga, onde ficará por 5 minutos a 9000 rotações por minuto, para que toda parte sólida se decante no fundo do microtubo (Figura 1), esse sobrenadante também chamado de pellet é então pipetado e transferido para um novo microtubo juntamente com 650 μL de isopropanol, volta então para centrifuga com as mesmas configurações para que o DNA dessa vez se decante no fundo do microtubo, é feita então a lavagem do pellet com 1mL de etanol 70% para remover sais, o restante no microtubo é a nossa amostra extraída, após a lavagem basta ressuspender o DNA em 20 μL de tampão TE contendo Ribonuclease, assim nossa amostra está pronta e pode ficar armazenada a - 20 °C por tempo indeterminado, para que o DNA extraído possa ser utilizado futuramente em uma PCR. Importante salientar que a qualidade do DNA presente na amostra pode interferir diretamente nos resultados futuros, então a extração deve ser bem-feita para que seja obtida uma molécula integra.
(Figura 1. Amostra após a centrifugação)
A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) é então iniciada com a extração do DNA feita anteriormente pelo processo de CTAB, é feita então a adição dos reagentes e da amostra em um novo microtubo, nele irá a solução tampão os dNTP’s, primers a Taq Polimerase e a amostra propriamente dita, são então levadas para o termociclador para a amplificação. Os primers são responsáveis pela identificação do local correto (exemplo gene) do material a ser amplificado; os dNTP’s (desoxirribonucleotídeos fosfatados) são responsáveis pela síntese de novas cópias do material a ser amplificado; a Taq polimerase sintetiza as novas cadeias de DNA ou cDNA; o MgCl2e o tampão da PCR colaboram com a atividade da polimerase; e o termociclador é responsável pelas alterações das temperaturas que levam a desnaturação da molécula de DNA ou cDNA, ao anelamento dos primers, e ao alongamento/extensão das novas cadeias de DNA. A desnaturação é caracterizada pelo aumento da temperatura (91 a 95°C) com a finalidade de romper as pontes de hidrogênio e, assim permitir a abertura da dupla fita. O anelamento está relacionado com a ligação dos primes na região específica que se deseja amplificar e é caracterizada pelo abaixamento da temperatura (55 a 62°C). Esta temperatura está diretamente relacionada com a composição dos primers. A terceira etapa, a extensão, envolve a ativação da Taq Polimerase (72°C) e subsequentemente a síntese das novas cadeias. 
Infelizmente não acompanhamos o processo de PCR no termociclador devido ao tempo que levaria, e também por se tratar apenas de uma demonstração, mas acontecido esse processo a nossa amostra agora é transferida para o gel de agarose nas cubetas para que a eletroforese nos mostre os resultados dessa amplificação.
A ELETROFORESE trata-se de um processo de migração de uma partícula carregada sob influência de um campo elétrico. Por apresentarem grupos funcionais ionizáveis, várias moléculas adquirem carga positiva ou negativa em um determinado pH. Portanto, quando são submetidas a um campo elétrico, essas moléculas carregadas migram para o polo positivo em maior ou menor intensidade, dependendo de sua carga. Nesse processo os equipamentos utilizados são as cubas, os pentes para confecção dos poços onde serão depositados o DNA replicado e o foto documentador equipamento responsável por fazer a leitura e a captura das bandas formadas após a amostra percorrer o gel. 
Inicialmente prepara-se o gel onde será depositado partes da amostra, pesando 1 grama do pó de agarose que é dissolvido e bem misturado para que não ocorra falhas no momento da captura, como por exemplo borrões causados pelo brometo de etídeo (substancia responsável por marcar os ácidos nucleicos) que fica mal misturado, interferindo diretamente nos resultados, influenciando tanto no percorrimento das bandas como na aferição e captura da imagem (figura 2), eleva – se sua temperatura e em seguida é moldado o gel nas cubetas onde ele ira solidificar, formando uma espécie de malha por onde o DNA irá percorrer fazendo com que moléculas maiores fiquem mais retidas e as menores consigam se movimentar com maior facilidade atingindo um alcance maior no gel. Com o auxílios de uma micropipeta a amostra é então pipetada nos poços formados pelos pentes no gel, feito isso o gel é transferido para cuba contendo 900 mL de TBE, solução tampão contento os sais necessários para que ocorra a transferência de carga de um polo para o outro, trazendo contigo parte do DNA presente na amostra. 
(Figura 2. Bandas de eletroforese com manchas causadas por Brometo de etídeo)
Após esse processo que normalmente dura 30 minutos, o gel é então levado para o foto documentador, equipamento responsável por capturar o percorrimento do DNA marcado pelo brometo de etídeo, formando as famosas bandas, e é através delas que podemos aferir se o nosso DNA foi amplificado com sucesso, com a captura dessas bandas, distinguimos a quantidades de pares de bases que conseguiram percorrer pelo o gel, e isso é feito por comparação a outras bandas disponíveis em um banco de dados que contem amostras com quantidade de pares de base conhecidos.
Após essa majestosa demonstração de amplificação e análise de DNA a professora Elytania nos mostrou um equipamento de última geração que o laboratório possuí, o Sequenciador (figura 3), uma máquina capaz de realizar todo o processo que levamos uma manhã inteira para acompanharmos resumidamente em apenas algumas horas, esse equipamento é ligado diretamente a um computador e com o auxílio de um software conseguimos realizar a PCR em tempo real, onde ocorre a captura dos feixes luminosos que são emitidos pelos nucleotídeos que são diretamente marcados em sua Fita de DNA por meio de corantes fluorescentes que emitem luz quando excitados, e o programa faz a captura de picos luminosos que o nucleotídeo transmite. Um equipamento de última geração, mas infelizmente em desuso no laboratório, devido a falta de verba para o funcionamento do mesmo, e como o equipamento só opera com reagentes fornecidos pela empresa fabricante do equipamento ele fica extremamente dependente dos mesmos que se esgotam rapidamente e ainda de custo muito elevado e não acessível para as condições financeiras atuais que o país se encontra.
(Figura 3. Sequenciador de DNA)
CONCLUSÕES 
A criação da PCR é considerada um grande avanço na área de biologia molecular, pois esta metodologia permite explorar o conhecido sobre o genoma e sua expressão. Esta técnica consiste em uma reação de amplificação in vitro de regiões específicas de ácidos nucleicos. A sua realização é considerada simples, entretanto necessita de vários reagentes e do aparelho termociclador, o qual permite variações na temperatura, caracterizando três etapas (desnaturação, anelamento e extensão).
A visita possibilitou a aquisição e o aperfeiçoamento em um processo de amplificação genômica, já que foi acompanhado e até mesmo praticado vários procedimentos realizados em laboratório, reforçando ainda mais o conhecimento na área. Com esses conhecimentos,conquistados tanto em sala de aula como em práticas, profissionais com características diferentes saem para o mercado de trabalho, e em outros desperta a vontade de continuar na área, estendendo seu curso para um mestrado e possivelmente um doutorado.
Sabe - se a importância dessa técnica no mundo todo, pois graças ao seu descobridor, Kary Banks Mullis, foi possível o estudo de várias doenças, possibilitando a criação de medicamentos, defensivos agrícolas, e outras formas de combate a elas, colaborando para o aumento da longevidade humana.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
MOLINA, Adriana Lopes, TOBO, Patrícia Renovato. Uso das Técnicas de Biologia Molecular para Diagnóstico. Disponível em: http://www.einstein.br/biblioteca/artigos/Vol2Num2/Serie%20Biologia%20parte%202.pdf.
COSTA, Ronaldo de Jesus. Técnica de Biologia Molecular: PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). Disponível em: http://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/8577/tecnica-de-biologia-molecularpcr-reacao-em-cadeia-da-polimerase.
JEPPSON, J. O.; LAURELL, C. B.; FRANZEN, B. Agarose gel electrophoresis. Clin Chem.
CORRÊA, Elisete Marcia, POSSIK, Patrícia Abrão. A Análise de DNA por eletroforese. Disponível em: http://www.ciencianews.com.br/arquivos/ACET/IMAGENS/biologia_molecular/testesgeneticos.pdf.
OLIVEIRA, Evelyn, TRENTI, Thais de Campos, CAMARGO, Fabrício, PINTO, Yago Danilo Pereira, MARTINS, Danieli Brolo. Eletroforese: Conceitos e Aplicações. Disponível em: http://www.conhecer.org.br/enciclop/2015c/agrarias/Eletroforese.pdf.