resumo biomol

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BIOLOGIA MOLECULAR – AVALIAÇÃO REGIMENTAL
PROCESSAMENTO PÓS-TRADUCIONAL
DNA 	 RNAm 	 Proteína Processamento pós-tradução Proteína biologicamente ativa
					 - primária: resíduos de aa		 
Organização estrutural das proteínas 	 - secundária: alfa-hélice				 
				 - terciária: cadeia de polipeptídeos
					 - quaternária: subunidades agregadas
Processamento proteico:
- enovelamento: ocorre durante a tradução, feito pelas chaperonas moleculares (HSP60 E HSP70) e o resultado são as chaperoninas (pós-tradução)
Cadeia polipeptídica cresce → N-terminal enovela → C-terminal enovela → proteína enovela completamente após liberação do ribossomo
- clivagem: ocorre na direção amino-terminal. Há remoção de metionina iniciadora (AUG)e sequência inicializadora de 20 aa responsável pelo endereçamento; e adição de grupo químico acetil. GERA RESIDUO AMINOTERMINAL
- glicosilação: adição de carboidrato na superfície celular da glicoproteína e no reticulo endoplasmático, que transfere para o complexo de Golgi.
- ligação a lipídeos: glicolipídeos na membrana plasmática
RER → polirribossomos livres (citosol, núcleo, perixossomos e mitocôndrias) e aderidos (no RER, Golgi, lisossomos, membrana ou que foram secretados)
Tipos de tradução:
- diferença quanto a local/tipo de síntese proteica: no entroblasto permanecem no citosol, no eosinófilo acumulam em grânulos, no plasmocito não acumulam e na célula acnosa do pâncreas acumulam e secretam por exocitose.
- síntese proteica no RER: a sequência-sinal ou peptídeo-sinal é reconhecido pela partícula de reconhecimento de sinal
	 Translócons: complexos SEC 61, TRAM, TRAP, OST e peptidase sinal
- síntese proteica no Golgi: elementos (faces cis ou proximal e trans ou distal; cisterna media), é pós-traducional, a glicosilação terminal é a hidrolise parcial da porção glicídica e adição de novos açúcares (manose 6-fosfato), a via secretora é a rede trans (fluxo continuo e rede secretora regulada), ele possui três tipos de vesícula → claritina (endocitose, transporte de enzimas e reciclagem de receptores), coatômero (cop 1 faz transporte entre os sacuolos, reciclagem e transporte p/ membrana; cop 2 faz transporte de RER para golgi)
- via ubiquitina-proteassomos
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA
** Na diferenciação celular irreversível é errado dizer que houve perda de genes mas é correto dizer que houve mudança na expressão gênica **
Os sinais externos alteram a expressão gênica, como a insulina por exemplo; e o mesmo sinal gera respostas diferentes em diferentes células (como o cortisol – cortisona)
- Em procariotos:
A região reguladora é composta pela sequência consenso e pelas proteínas de regulação/reconhecimento (fatores de transcrição)
A região promotora é regulada pelo operador, que faz controle positivo, negativo ou ambos. Ex: controle repressor de triptofano na bactéria:
Operon lac → ativador versus receptor
- Em eucariotos:					Eucariotos x Procariotos
	SEMELHANÇAS
	DIFERENÇAS
	
Interação proteína e DNA
	Nos eucariotos: mais proteínas envolvivas, regiões são maiores, é mais complexa, uma região controla a expressão de vários genes ou varias regiões de controle controlam um gene, há regulação da cromatina
Enhancer → região de controle dos genes, remodela a cromatina direta ou indiretamente, sua função é atrair, modificar e posicionar os fatores gerais da transcrição e da rna polimerase.
SILENCIAMENTO DE GENES:
Remodelamento da cromatina → ocorre modificações em histonas. Há remodelamento do nucleossomo, depois sua remoção, em seguida sua substituição e por último a modificação 
Como começa a transcrição?
PROTEINA DE ATIVAÇÃO GÊNICA LIGA-SE À CROMATINA → REMODELAMENTO DA CROMATINA ATRAVÉS DE UM COMPLEXO → MODIFICAÇÃO COVALENTE DE HISTONAS POR ENZIMAS → PROTEINAS ATIVADORAS SE LIGAM À REGIÃO GÊNICA
→ Ligação à região promotora:
A ligação DNA – proteína é chamada de interação, pode se dar através de ligação de hidrogênio com uma ligação iônica, interação que é hidrofóbica. Os tipos dessa ligação são:
Hélice volta hélice
Homeodomínio Hélice volta hélice
Dedos de zinco
Folhas β pregueadas
Alça de sulco maior e menor
Zíper de leucina
Heterodimerização
Hélice alça hélice 
→ Diferenciação do DNA
A memória de diferenciação é gerada através da metilação do DNA, modificação de histonas e retroalimentação +
Os mecanismos para essa geração são retroalimentação – e +, FlipFlop e alimentação direta
→ Controle pós-traducional
Feito através de:
Atenuação da transcrição
Ribocontroles
Splincing alternativo
Transporte de mRNA
Fosforilação dos fatores de tradução – G0
Desestabilização do mRNA
Encurtamento da cauda poliA
Remoção do cap 5´
miRNA X iRNA
*iRNA → silenciamento pós-transcricional conservado evolutivamente, onde o RNA dupla fita ocasiona degradação de uma sequencia especifica no RNAm quando introduzido na célula. 
A função disso é proteger o genoma através do silenciamento de vírus invasores e elementos transponíveis (aqueles que conseguem atravessar o RNA)
*O DNA codificante em humanos corresponde a apenas 5%, o resto é DNA não-codificante
→ Sequenciamento do genoma
No inicio não funcionava em mamíferos → a resposta imune através do interferon por invasão viral degradava o DNA e causava apoptose
Foram descobertos os microRNAs (miRNA), os quais são um processo similar ao iRNA. Controlam 1/3 dos genes. 
Há também o siRNA (RNA de interferência), o qual compete com o miRNA e faz inativação cruzada, por isso deve-se saber a dose correta e ter certeza do alvo.
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
PCR – Reação da polimerase em cadeia
É uma técnica laboratorial que usa ácidos nucleicos isolados, amplifica o DNA e o RNA (produz grande numero de copias), é especifica (só determinada região do acido nucleico é ampliada)
Utilizada para detecção de organismos infecciosos e mutações genéticas, amplifica marcadores genéticos, dentre outros.
O que se usa para realizar a técnica?
Tampão de Reação
Mix dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 
DNA Molde (aproximadamente 1 μg) 
Oligonucleotídeo sense (“primer foward”) 
Oligonucleotídeo antisense (“primer reverse”) 
Enzima Taq polimerase 
ddH2O 
Anelamento:
É preciso conhecer a sequencia do DNA que quer amplificar para se fazer o PCR
SÃO NECESSARIOS 2 PRIMERS, CADA UM COMPLETA UMA FITA DO DNA MOLDE
CADA PRIMER DEVE APONTAR SUA EXTREMIDADE 3’ PARA O OUTRO PRIMER (síntese apenas em 5’ → 3’)
Os primers são oligonucleotideos, temperatura depende do seu comprimento e sequencia, possuem alta especificidade.
Tecnologia do PCR:
94C, 1 min = desnaturação = rompimento das pontes de H entre as duas fitas de DNA
55C, 1 min = anelamento = os primers hibridam em suas posições específicas 
72C, 1 min = extensão = a DNA polimerase sintetiza novas fitas de DNA
Eletroforese em gel de agarose
Nele, os fragmentos de DNA são separados pelo tamanho em pares de bases (pb).
A realizada em gel de agarose usa brometo de etidio → raios UV
→ Teste de paternidade: feito por unidades repetitivas de DNA que aparecem em diferentes freqüências em cada indivíduo. Dependendo do número de repetições em cada alelo, o indivíduo poderá ser homozigoto ou heterozigoto
RT PCR – Real Time PCR
Utiliza a enzima TRANSCRIPTASE REVERSA. O segundo filamento do cDNA (DNA complementar) é sintetizado pela DNA polimerase, e, na sua forma de dupla hélice, funciona como alvo para a amplificação da PCR.
Utiliza solução tampão 
Qualitativo e quantitativo
Sequenciamento
Ligação fosfodiester → ligação entre os nucleotídeos
O sequenciamento do DNA é feito através do PCR, onde os produtos da reação são aplicados em uma camada de gel e sofrem purificação e desnaturação, o DNA migra e a informação é passada através de um computador.
Possibilitadetecção de doenças genéticas (infarto, falência renal, câncer, hipertrofia do ventrículo) e infecto-contagiosas(infecção por bactéria, vírus de dna e rna)
Hibridizacao de ácidos nucleicos: dna genomico → digestão por enzima → dna genomico digerido
Southern blotting: hibridização que pode ser feita por gel de agarose
FISH: descobre a leucemia mieloide crônica 
	
Microarrays:
Investigação de milhares de genes de maneira simultânea
Sonda complementar (probe) - fixas
Molécula alvo marcada com fluoroforo (CY3 e CY5)
HPV 
DNA recombinante:
Função = degradação DNA viral
Produzidas por bactérias
Genoma próprio protegido por metilação
 Clonagem:
Inserção de um gene em um seguimento autorreplicava – Plasmideo/ vírus/ Cromossomos artificiais (vetor)
 Extração de DNA:
Romper célula 
Detergente forte – SDS
Proteinase K – degradação de proteínas
Extração: Ácidos nucleicos – 
Fenol - Solução heterogenia - Desnatura proteína e separação
Salting Out – precipitação de proteína excesso de ions)
Precipitação com Etanol