RESUMO GENÉTICA MOLECULAR

Prévia do material em texto

RESUMO P1 GENÉTICA MOLECULAR 
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS 
· Ácidos nucléicos são polímeros
· As unidades construtivas dos ácidos nucléicos são os NUCLEOTÍDEOS
· Açúcares RIBOSE (mais estável; 3’OH e 2’OH) e DESOXIRIBOSE (menos estável; ausência de OH em 2’; 3’OH e 2’H)
· Bases PURINAS (adenina e guanina) e PIRAMIDINAS (uracila, timina e citosina)
· Pontes de H+ entre as purinas e piramidinas; quanto mais C e G mais pontes de H+, portanto mais estáveis
· NUCLEOSÍDEO é um nucleotídeo sem o fosfato na posição 5’
· AMP (com hidroxila 2’) e DAMP (sem hidroxila 2’)
· ADP (menos fosfato) e ATP (mais fosfato)
· Nucleosídeos de bases piramídicas 
· Exemplo formação do DNA
· Ligação fosfodiéster liga um nucleosídeo ao outro
· Parte interna do DNA é muito hidrofóbica por isso as bases são ligadas internamente 
· Direção de síntese 5’-3’
· Estrutura do DNA foi definida por Watson e Crick em 1953
· Uma informação importante para a descoberta de Watson e Crick foi dada por Ewin Chargaff em 1950 proporções reativas de cada nucleotídeo não são casuais (quantidade de A=T e C=G)
· DNA é formado por 2 fitas antiparalelas, pareadas pelas bases 
· O pareamento das bases é específico (A=T e C=G)
· Formas linear e circular 
· Desnaturação e renaturação do DNA (quebra das pontes de H+)
· O RNA molécula de fita simples
· tRNAs estrutura secundária 
· Expressão gênica – dogma central 
DNA RNA PROTEINA
· GENE unidade funcional do cromossomo (DNA) que é transcrita em RNA, e contém sequencias especificas que determinam sua regulação (gene = unidade de transcrição)
· Função gênica alelo dominante e recessivo
· Estrutura do gene (procariotos não possuem introns; eucariotos tem transcrição e tradução em regiões diferentes e possui introns)
Obs. Introns região de DNA não codificador que intercalam os éxons, que são as regiões codificadas
· INTRONS 
· Modelos de introns iniciais – introns sempre foram parte integrante dos genes. Nos genes sem introns, foram perdidos na evolução
· Modelos de introns tardios – unidades codificadoras ancestrais não eram interrompidas 
· Genes que codificam proteínas – genes solitários; genes duplicados e divergentes; funcionais pseudogenes 
· Genes repetidos em sequência – rRNA; tRNA; histonas
· DNA repetitivo – DNA de sequencia simples; DNA moderadamente repetitivo; etc
· DNA espaçador não classificado 
REPLICAÇÃO DO DNA 
· Ciclo celular (24 horas): replicação ocorre na fase S (6 a 8 horas)
· Replicação modelo semi-conservativo; Experimento de Meselcon-Stahl em 1958 mpstrou como ocorre a replicação de DNA, com essa metodologia foi possível distinguir fitas parentais das fitas filhas pois possuem densidades diferentes, o que evidencia esse tipo de modelo.
· Formação da ligação fosfodiéster (DNA polimerase) sentido 5’-3’, com uma taxa de erros baixa pois existe uma atividade de revisão no sentido 3’-5’
· Polimerização do DNA ação da enzima DNA polimerase que depende de uma primase e não faz síntese de novo (na ausência de OH livre)
Molde DNA-3’-OH +dNTP = Polinucleotídeo +PPi
· DNA Polimerase
- Atua sempre na direção 5’-3’ na fita
- Apresenta atividade revisora
- Precisa de um iniciador de RNA (primer) para iniciar a replicação (OH livre em 3’)
- Depende da ação de outras enzimas (helicase, primase, topoisomerase) para realizar duplicação do DNA pois não faz síntese de novo
· Atividade Revisora 
- Nas direções 5’-3’ e 3’-5’
- Atua como uma exonuclease
- Taxa de erro sem atividade revisora é de 1x10-6; com atividade revisora cai para 1x10-9 (ou seja 1000x)
· A origem de replicação com ponto de inicio
- Mecanismo para replicação: 90% bidirecional
- Região de origem de replicação é conservado 
· Proteína de reconhecimento da origem (DNAa) se associa a origem, reconhece o ponto de inicio da replicação e força a abertura da fita
· Iniciando a replicação – ação da HELICASE 
· A necessidade de um primer iniciador a função da primase (uma RNA polimerase atuando na replicação do DNA)
· O Primer de RNA e o inicio da replicação (sem a primase não ocorre replicação)
(dnaB=helicase)
· As fitas de DNA são antiparalelas 
· Forquilha de replicação fita líder é contínua e a oposta é descontínua 
· Complexo de polimerização
- DNA Polimerase III atividade revisora 3’-5’; responsável pela polimerização do DNA (alta processividade); revisão considera o pareamento correto entre as bases 
- DNA Polimerase I atividade exonuclease na direção 5’-3’, retirada dos primers de RNA completando a fita de DNA; síntese da fita descontínua (ação da DNA polimerase I e da DNA ligase)
· Separação das fitas causa um problema topológico = super-enrolamento 
· Movimento das forquilhas cria super-enrolamento POSITIVO
· Topoisomerase tipo I usada para retirar os enrolamentos 
· Replicação do DNA – Procariontes x Eucariontes
- Célula animal tem cerca de 50x mais DNA do que a bacteriana 
- Eucariotos possuem várias origens de replicação ao longo dos cromossomos 
· Replicação dos telômeros 
- Ação da telomerase (uma transcriptase reversa celular)
· Complexo nucleoproteico da região telomérica 
- Fechado – Protegido e Aberto – Replicativo sem a correção, a replicação do DNA determinaria a perda de 50-100 nucleotídeos nas extremidades dos cromossomos a cada round de replicação (consumo dos telômeros) causando perda de informação genética 
· Sistema de replicação especial nas extremidades dos cromossomos envolvendo a enzima Telomerase (composta por RNA e proteína)
· Mecanismo de ação da telomerase 
· Telomerase e senescência Nas células somáticas, a telomerase é expressa em baixos níveis, ou não é expressa – os telômeros são reduzidos a cada divisão celular; os telômeros são um pequeno sinal para a célula parar de se dividir 
· Telomerase é o relógio biológico da divisão celular
· Tamanho do telômero serve de sinal para cessar a divisão celular 
· O telômeros são estruturas especializadas, nas pontas de um dos cromossomos. Os telômeros estabilizam os cromossomos evitando a perda de informação genômica após cada rodada de replicação do DNA 
· Telomerase e câncer células cancerígenas expressam telomerase (80-90%) e a presença da telomerase nas células permite manter o tamanho dos telômeros e viabilizam a divisão celular 
A Transcrição
· O DNA transcrito em RNA pela RNA Polimerase
· Tranferencia da informação contida no DNA para o RNA
· Processo catalizado pela RNA Polimerase que utiliza uma das fitas do DNA como molde
· Caracteristicas dos RNAs
1- RNAm transfere informação do gene para os ribossomos
2- RNAt transferência de aminoácidos para o complexo mRNA – ribossomo na ordem correta
3- RNAribossomico estrutura dos ribossomos
4- RNAheterogêneo
· A enzima RNA Polimerase
- Atua sempre na direção 5’-3’ durante a transcrição
- Não possui atividade revisora
- Não requer um iniciador para a transcrição – síntese de novo
- Reconhece a fita do DNA a ser transcrita através da região promotora
- Sem licases e proteínas acessórias para realizar “desdobramentos”
- RNA-DNA hibrido para manter estabilidade da ponta 3’ para que ocorra corretamente a transcrição
A transcrição em Procariotos – RNA Polimerase procariótica
· E.coli – multinumérica sintetiza todos os RNAs bacterianos
· 4 estágios da transcrição
1- Reconhecimento da região do DNA a ser transcrita – Promotor
- Região conservada de nucleotídeos situada na porção 5’ do DNA (portanto do gene a ser transcrito)
- Determina qual a fita do DNA a ser transcrita (fita molde)
- Esta sequencia regulatória é reconhecida pelas enzimas envolvidas na transcrição (fator σ da RNA Polimerase no caso dos procariotos)
- Subunidade sigma (σ) reconhece as sequencias consensuais situadas a -10 e -35, posicionando assim a holoenzima sobre o promotor 
2- Iniciação
- A RNA Polimerase (holoenzima) encontra o promotor e liga-se fracamente a um complexo fechado. S sequencia -35 é importante para este reconhecimento
- Forma-se o complexo aberto:desenrolam-se 17 pares de bases, começando pela sequencia -10
- A transcrição começa no nucleotídeo de iniciação (+1) 
3- Alongamento
4- Terminação
- Depende do fator rho
- Independente de rho estrutura secundaria afetando processividade 
OBS. REGIOES PROMOTORAS região conservada de nucleotídeos situada na porção 5’ do DNA; determina qual fita do DNA ser transcrita
Transcrição em Eucariotos
· Aumento da complexidade
· RNA Polimerases Nucleases 
1- I (A) 
- Subunidades grandes: 195-197 e 117-126
- Subunidades pequenas: 61-51, 49-44, 29-25 e 19-16,5
- 2 a 3 formas variáveis 
- Nucleolar – sintetiza os rRNAs
2- II (B)
- Subunidades grandes: 240-214 e 140
-Subunidades pequenas: 41-34; 29-25; 27-20; 19,5; 19 e 16
- 3 a 4 formas variáveis
- Sintetiza os mRNAs
3- III (C)
- Subunidades grandes: 155 e 138
- Subunidades pequenas: 89, 70, 53, 49, 41, 32, 29, 19
- 2 a 4 formas variáveis 
- Sintetiza dos tRNAs e o RNA 5s
· Nosso foco RNA Polimerase II
- RNAs codificadores (mRNA) são transcritos pela RNA Polimerase II
-Transcrição pela RNA polimerase II é altamente regulada
- Mecanismos de regulação são variados
· Fases 
1- Iniciação 
- Fenômeno complexo e não depende exclusivamente da RNA Polimerase
- Inúmeros fatores de transcrição (FTs) são necessários para que isso aconteça e para que o promotor seja reconhecido
-A combinação especifica de FTs disponíveis determina como e quando um gene será transcrito
OBS. FATORES GERAIS DE TRANSCRIÇÃO
· São adicionados sequencialmente durante a formação do complexo de iniciação
· Cada qual desempenha uma função especifica
· RNA Polimerase é recrutada para o promotor
· Os FTs adicionais funcionam como estimuladores ou repressores 
2- Alongamento
3- Termino
· Processamento dos mRNAs
- Adição do CAP em 5’
- Adição do poli(A) em 3’
- Remoção dos introns em forma de laço (envolve reações de mudança de ligações fosfodiester)
· Evidencia dos introns mRNA é menor do que a fita molde de DNA 
· Spliceossomo – complexo ribonucleoproteico de reconhecimento 
· Splicing alternativo da tropomiosina introns são removidos de maneira alternativa originando diferentes mRNAs
· Consequencias de mutações 15% das mutações de causam doenças genéticas afetam o padrão de splicing alternativo
EX: homofilia A (recessivo ligado ao X – fator VIII); Sindrome de marfan (autossômica dominante – tecido conjuntivo – fibrilina 1)
· RNA polimerases dependentes de RNA (RdRP)
- Envolvidas na síntese de dupla de RNA
- Participam das vias de silenciamento gênico (RNAi) – síntese de siRNA
- algumas RdRP atuam como replicases virais 
- RNA Polimerasse II pode atuar como RdRP
BIOSSINTESE DE PROTEINAS – A TRADUÇÃO
· Codigo genético é “universal” – 1 aminoácido pode ser codificado por mais de um códon T em inicio (códon iniciar – START AUG) e fim (códons de parada – STOP)
· Exceção a essa universalidade são as mitocôndrias
· A tradução da informação contida no mRNA na forma de nucleotídeos para aminoácidos (nas proteínas) requer um adaptador
· A molécula adaptadora tem um papel primordial
· Adapta a sequencia de nucleotídeos em aminoácidos 
· O tRNA funciona como adaptador 
· Aminoacil-tRNA sintetase 
· Pareamento de bases códon-anticódon pode ser oscilante
· Os ribossomos 
- São responsáveis pela varredura da molécula de mRNA durante a tradução; 
- Determina a fase de leitura a partir do AUG iniciador da tradução 
- Coordena a entrada dos tRNAs carregados com aminoácidos no sitio A
- Formado por proteínas e RNAs, contendo duas subunidades 
· A importância da fase de leitura correta o erro na leitura de um nucleotídeo (G) leva a tradução de uma outra proteína totalmente diferente da original 
Tradução em Procariotos 
· Tradução é concomitante à transcrição
· Inicio da tradução em procariotos: Os códons de iniciação são precedido por sequencias especiais, chamadas sequencias de shine-dalgarno
· OBS. A sequencia de shine-dalgarno no mRNA é complementar ao rRNA 16s
· Uma vez pareado, o inicio se da na posição correta
· Termino da tradução em procariotos: o papel do fator de terminação (RF)
Tradução em Eucariotos
· Inicio da tradução em procariotos e eucariotos: em eucariotos o tRNAimet é estruturalmente diferente do tRNAmet
· A transcrição e a tradução ocorrem em compartimentos separados na célula eucariótica. 
· Iniciação e o processo de varredura
· Ideal de iniciação: AUG
· Iniciação
· iniciação da tradução: complexo 40s
· Fatores de iniciação associam-se a estrutura do CAP em 5’
· Uma vez no lugar, o complexo se move no sentido 5’-3’ e desenrola as regiões com pareamento de base
· Complexo fechado esse mecanismo garante que só moléculas de mRNA intactas sejam traduzidas
· Inicio/alongamento EF é o fator de alongamento 
· É durante o alongamento que o ribossomo se assemelha a uma fabrica. 
· Terminação RF é o fator de terminação (quando aparece um códon de parada)
· A maioria dos antibióticos inibe a tradução 
· Tradução independente do CAP (vírus) – ação do Polivirus
- RNA genômico do vírus da pólio não tem CAP
- Tradução ocorre por iniciação interna usando uma IRES
- Em células infectadas pelo vírus, o IF4G é clivado impedindo a tradução de mRNAs celulares portando CAP em 5’
MUTAÇÃO, REPARO E RECOMBINAÇÃO
· Moléculas biológicas são lábeis: RNA, por exemplo, é altamente sensível à hidrolise
· Danos à essas moléculas ocorrem durante os processos celulares normais ou pela interação com o meio ambiente 
· Vários tipos de danos podem ocorrer no DNA, estes são reparados constantemente por diferentes mecanismos 
· Danos são temporários, mas falhas no reparo dos mesmos provoca mutações 
· Defeitos nesses mecanismos de reparo estão correlacionados com aumento da incidência de doenças como o câncer
· Dano ao material genético X variabilidade genética
· Balanço dinâmico mutações 
· Natureza das mutações:
1- Transição: substituição de uma pirimidina por outra pirimidina ou de uma purina ou outra purina
2- Transversão: substituição de uma pirimidina por uma purina, ou vice e versa
3- Mutações pontuais ou de ponto: pequenas inserções ou deleções (um dos poucos nucleotídeos) – INDEL; mudanças mais drásticas deleções e inserções longas, rearranjos, quebras.
· MUTAÇÕES
- Pontos preferenciais (hotspots) – ex: regiões de microssatélites onde a DNA Polimerase pode cometer deslizes em função da presença de nucleotídeos repetidos – gera polimorfismo 
- As mutações são perpetuadas pela replicação do DNA 
· Replicação do DNA e a atividade revisora da DNA Polimerase
- Sitio ativo da DNA Polimerase III
- Erro da DNA Polimerase: 1/104-105 nt
- Atividade revisora intrínseca das polimerases (exo 3’5’) 1/106-108 nt
- Tende a minimizar os erros aumentando em um fator de ~100 a fidelidade
- Erros escapam e podem causar mal pareamento 
· Danos espontâneos gerados por hidrólise 
- Desaminação determina o surgimento de pareamentos não naturais do DNA
- Depurinação gerada pela hidrolise espontânea de uma ligação N-glicosilica produzindo um sítio abásico (AP site); a ausência da base (sitio apurinico ou apirimidinico) gera problemas durante a replicação do DNA 
· Lesões não espontâneas agentes químicos, radiação (alquilação, espécies reativas de O2, UV e radiação gama e ionizante – quebra)
1- Danos químicos 
- Alquilação adição de grupos etil ou metil às bases ou aos fosfatos
- alquilação no DNA gera dano oxidativo oxidação da guanina; pareia com A ou C (transversão G:C para A:T) comum em cânceres
2- Danos por radiação UV
- Efeito do dímero de timina no DNA
· Mecanismos de reparo são diversos e empregam mecanismos variáveis (direto, mal pareamento, excisão, quebra)
· Reparo direto fotoreativação (ação da DNA fotoliase)
Não há remoção de base ou nucleotídeo
· Reparo direto ação das metiltransferases 
Alto custo pois a metiltransferase não é catalítica – não pode ser utilizada novamente 
· Reparo de mapeamento em humanos
· Reparo de excisão de bases (BER) – glicosilases BER atua em danos causados por agentes interno 
-DNA glicosilases removem a base danificada
- Reconhecimento dabase danificada no interior da fita dupla
- AP endouclease cliva do lado 5’ do sitio AP e AP liase cliva do lado 3’ do sitio AP (Remoção do nucleotídeo)
· Reparo de excisão de nucleotídeos (NER)
- NER atua em danos químicos e naquelas causados pela exposição a radiação
- Ocorre a detecção da lesão, a sua excisão e posterior reparo da fita pela DNA Polimerase I e ligase
- Mecanismo é o mesmo em mamíferos – 25 ou mais polipeptideos
· Transcrição acoplada ao reparo – transcription coupled repair (TCR)
- Transcrição é interrompida pela lesão no DNA
- RNA Polimerase bloqueada recruta enzimas envolvidas no reparo por excisão de nt (UvrA e UvrB)
- Requer a atividade helicase do TFIIH
· Danos por quebra quebra na fita simples ou nas duas fitas de DNA a ser replicado
- Reparo envolve o cromossomo homólogo
- Inversão do DNA de fita dupla homólogo
· Recombinação – Modelo de Holliday
· Reparo de quebras por recombinação homóloga 
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
· Regulação ocorre em vários níveis
· Procariotos
Resposta direta a variações nas condições nutricionais (genes ativados e reprimidos)
Transcrição acoplada a tradução
· Eucariotos
Transcrição ocorre em compartimento distinto da tradução eliminando possibilidade de acoplamento
Limitação na resposta direta às variações nas condições nutricionais 
· Papel das proteínas regulatórias 
- Controle negativo (repressor) inibe transcrição
- Controle positivo (ativador) facilita transcrição
· Papel dos efetores sinalização
Controle da expressão gênica em procariotos
· Ocorre por meio de um controle positivo ou negativo, induzindo ou reprimindo a expressão gênica 
· Características
- Resposta direta às variações nas condições nutricionais e ambientais (genes ativados e reprimidos)
- Transcrição é citoplasmática e não existe impedimento físico (cromatina, histonas)
- Transcrição pode ser acoplada com a tradução (é simultânea)
- O controle traducional pode acontecer mas está basicamente relacionado à estabilidade do mRNA
· Conceitos 
- Os mecanismos de regulação negativa e positiva não são mutuamente excludentes
- Alguns genes são regulados de maneira positiva e negativa – maior sensibilidade
- Regulação por inibição feedback – atividade enzimática
· Promotor procariótico região do operador delimita onde o repressor vai se ligar
· Definições 
- Genes de economia domestica são constitutivas (aparentemente não regulados e expressos a todo momento)
- Genes constitutivos são regulados pelas sequencias -10 e -35 do promotor
- Divergências nas sequencias consenso determinam redução da taxa de iniciação a partir do promotor 
· Expressão constitutiva Genes constitutivos possuem nível de transcrição aproximadamente constante na célula. (EX. proteínas estruturais e enzimas de vias metabólicas)
· Taxa de transcrição de genes constitutivos é dada pela afinidade da ligação de RNA polimerase à região promotora 
· Elementos regulatórios 
- Elementos cis-atuantes (sequencias de nucleotídeos ao longo do DNA)
- Elementos trans-atuantes (proteínas especificas que se ligam aos elementos cis)
OPERON LAC – METABOLISMO DE LACTOSE
· O operon lac via metabólica degradativa – permanece desligada 
- lacZ – β-galactosidase
- lacY – lactose permesase
- lacA – tiogalactosídeo transacetilase
- lacI – repressor
· Ação da β-galactosidase quebra lactose e produz galactose e glicose
· Indução do operon lac pela disponibilidade de lactose (repressão quando não tem lactose)
· Isopropril- β-D-tiogalactosídeo (IPTG) indutor que não é metabolizado; atua como análogo da lactose; sua concentração continua constante na célula (ideal em estudos fisiológicos)
· Transcrição do operon lac Repressão (-)
 Indução (+)
 (indutor = lactose)
· Complementação funcional – operon lac 
1- Restauração do fenótipo de mutantes
2- Tipos diferentes de fenótipos: material genético
3- Mutação com fenótipo adiciona DNA (produto do gene) verifica se há a restauração do fenótipo
· Controle positivo do operon lac 
1- Remoção do repressor não é suficiente para ativar o operon lac
2- O operon lac tem um mecanismo de resposta aos níveis de glicose presentes na célula
3- Quando a concentração de glicose é elevada – ocorre repressão
4- Mas quando a concentração de glicose é baixa – ocorre indução da transcrição
· Regulação do operon lac pelo complexo cAMP-CAP – Regulação positiva 
· Operon arabidinose repressor especifico
· Operon trp – repressão catabólica via de síntese; atenuação da transcrição