Relatório 5 Exame sorológico de ELISA para diagnóstico de toxoplasmose

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
Exame sorológico de ELISA para diagnóstico de toxoplasmose
Docente: 
Discentes: 
Relatório Nº 05 Como exigência da disciplina
Imunologia Clínica
Goiânia
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é uma infecção causada pelo Toxoplasma gondii, um protozoário intracelular obrigatório. A infecção aguda é geralmente assintomática ou apresenta sintomas leves, similares a de uma gripe comum como mal-estar, febre e fadiga. A infecção crônica é caracterizada pela fase mais agressiva da doença, podendo causar sintomas graves como acometimentos oculares, neurológicos e cognitivos, abortos ou seqüelas graves para o feto, entre outros (BRASIL, 2018; CANTOS, 2000; TORGERSON & MASTROIACOVO, 2013; ZHANG, 2018).
 Em pacientes imunocompetentes acometidos pela infecção, o quadro clínico progride de forma satisfatória, sem a necessidade de qualquer tratamento específico. Porém, o parasita não é eliminado do organismo, onde permanece inativo e persiste por toda a vida, podendo ou não causar sintomas futuros. Dessa forma, pacientes imunocomprometidos como gestantes, recém nascidos e pessoas com baixa imunidade (exemplo: portadores de HIV/AIDS) são considerados a população em risco e que se deve ter uma maior atenção, devido a uma maior possibilidade de evolução da doença para um quadro de cronicidade, onde a doença manifesta sintomas mais graves (BRASIL, 2018; CANTOS, 2000; TORGERSON & MASTROIACOVO, 2013; ZHANG, 2018).
A infecção por T. gondii é freqüentemente associada com o estilo de vida, hábitos alimentares e condições socioeconômicas da população. O parasita pode infectar animais, que agem como hospedeiro intermediário e auxiliam em seu ciclo de vida, sendo o gato doméstico seu hospedeiro final e definitivo, responsável por sua disseminação. Assim, a toxoplasmose pode ser adquirida pela ingestão direta de oocistos (forma contaminante) que foram eliminados pelas fezes de gatos portadores do parasita, e que contaminam principalmente a água e o alimento ou de forma indireta, pela ingestão de oocistos presentes em carne crua ou mal cozida, que foram previamente ingeridos pelo animal. Além disso, a toxoplasmose pode ser transmitida de forma congênita, ou seja, de mãe para filho durante a gestação (BRASIL, 2018; CANTOS, 2000; TORGERSON & MASTROIACOVO, 2013; ZHANG, 2018).
O diagnóstico de T. gondii pode ser realizado de forma direta a se visualizar o parasita, como análise microscópica e histopatológica, porém são pouco utilizadas. Desse modo, a forma indireta é a mais convencional, devido a ser um exame de realização rápida e não invasivo, sendo realizado através da análise sorológica do paciente, que se baseia na identificação de anticorpos específicos presente contra o parasita. Os testes sorológicos mais importantes são: imunofluorescência indireta (IFI), imunoenzimáticos (fluorimétrico ou ELISA), fixação do complemente (FC) e inibição da hemaglutinação (IHA) (MITSUKA-BREGANÓ, 2010; BRASIL, 2018; CARVALHO, 2014; ARAÚJO, 2011; GOMES, 2004).
Na sorologia, anticorpos IgM específicos podem ser identificados a partir de duas semanas de infecção e atinge níveis elevados em um mês e posteriormente diminuem, sendo possível permanecerem positivos até dezoito meses (IgM residuais). Enquanto que anticorpos IgG aparecem entre duas a quatro semanas de infecção, atingindo níveis elevados em dois meses e declinando cinco a seis meses posteriores, podendo ser detectados por toda a vida (MITSUKA-BREGANÓ, 2010; BRASIL, 2018; CARVALHO, 2014; ARAÚJO, 2011; GOMES, 2004).
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
2.1 MATERIAIS
Água destilada;
Diluente das amostras;
Eppendorf;
Estufa;
Etiqueta adesiva;
Cromógeno-Substrato;
Conjugado;
Solução bloqueadora (H2SO4 1N);
Solução de lavagem (Tampão BPS-Tween 20 e Khaton);
Microplaca;
Micropipetas automáticas (10, 100 e 1000 µL);
Papel toalha;
Pisseta.
2.2 MÉTODOS 
Adicionou-se 10 µL de amostra e 1 mL de diluente em um eppendorf e foi feita a homogeneização. O diluente foi utilizado para o preparo do branco, sendo adicionado em um segundo eppendorf. Pipetou-se 100 µL de amostra diluída e de branco nas cavidades da microplaca, cobriram-se as cavidades com a etiqueta adesiva e colocou-se a microplaca para a incubação por aproximadamente 30 minutos. Após isso, foi feita a lavagem das cavidades 5 vezes com 300 µL de solução de lavagem. Em seguida, adicionou-se 100 µL do conjugado na cavidade em que a amostra estava contida. Cobriram-se as cavidades com a etiqueta adesiva e levou-se a microplaca para a incubação por mais 15 minutos. Em seguida, foi feita a lavagem das cavidades com a solução de lavagem e adicionou-se 100 µL de substrato na do branco e da amostra, o sistema foi levado para a incubação por mais 10 minutos. Posteriormente, foram colocados 100 µL da solução bloqueadora nas cavidades.
3. RESULTADOS
3.1 Resultados do teste de Elisa
Imagem 1. Poços da placa de Elisa. Fonte: próprio autor, tirada durante a realização da aula.
Na imagem, observa-se no poço B, onde estava contido o branco, a ausência de coloração, enquanto que, no poço A, ao qual a amostra foi colocada, observa-se uma coloração em tom amarelo claro translúcido, indicando que o soro é reativo, apresentando anticorpos para o antígeno causador da toxoplasmose (Toxoplasma gondii).
4. DISCUSSÃO
O teste de ELISA realizado, portanto, foi o método indireto em que os poços de uma placa foram previamente revestidos por antígenos do Toxoplasma gondii, buscando encontrar anticorpos no soro do paciente, assim sendo, esses anticorpos se presentes irão se ligar aos antígenos, e em seguida ao adicionar os anticorpos conjugados com a enzima e seqüencialmente expostos ao substrato dela, a reação tem cor (CANTOS et al.,2000). Como esquematizado a seguir:
Imagem 2. Figura 1: Princípio da técnica de ELISA indireta. Fonte: biomedicina padrão (>www.biomedicinapadrão.com.br<)
Em conhecimento disto, então, é possível perceber através dos resultados obtidos que paciente foi exposto ao agente, pois, houve uma reação no poço em que continha a amostra, sendo assim o paciente tinha anticorpos contra esse antígeno, porém, para maior detalhamento desta positividade do teste, seria necessário ter realizado a análise em espectrofotômetro, para obtenção em números deste resultado, que somado com um cut-off, seria possível chegar corretamente em um resultado positivo. Com o cut-off também é possível determinar se é necessário repetir o procedimento, isso ocorre quando o resultado fica dentro dos intervalos do cut-off.
5. CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos pode-se inferir que o teste apresentou positividade. Entretanto, para confirmar isso, seria necessário a análise no espectrofotômetro, além de verificar se o resultado está fora dos intervalos determinados pelo cut-off. 
O método do ensaio imunoenzimático (ELISA) é uma técnica trabalhosa, visto que possui diversas etapas e processos, e assim, exigindo profissionais devidamente instruídos e especializados. Ademais, o ELISA indireto permite apenas determinar se o paciente teve ou não o contato com o Toxoplasma gondii, visto que essa técnica é uma reação que positiva-se na presença de anticorpos contra esse antígeno. Outrossim, não é indicado a detecção de IgM por esta técnica, uma vez que pode haver interferência por fatores reumatoides, culminando em falsos positivos (CANTOS et al., 2000).
Por fim, pode-se concluir que a aula prática cumpriu com o objetivo de executar o método do ensaio imunoenzimático indireto. E, que os detalhes químicos, biológicos, físico-químicos e sociais do tema foram explorados em aula de modo que dúvidas foram elucidadas e conceitos foram abordados.
6. REFERÊNCIAS
ARAúJO, Patricia Regina Barboza. Alta eficiência diagnóstica do teste IgM-ELISA utilizando múltiplos antígenos peptídicos (MAPs) de T. gondii  (ESA SAG-1, GRA-1 e GRA-7) na diferenciação de formas clínicas da toxoplasmose. 2011. Tese (Doutorado em Doenças Infecciosase Parasitárias) - Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância das Doenças Transmissíveis. Protocolo de Notificação e Investigação: Toxoplasmose gestacional e congênita [recurso eletrônico]/ Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Vigilância das Doenças Transmissíveis. – Brasília : Ministério da Saúde, 2018.
CANTOS, G. A. et al . Toxoplasmose: ocorrência de anticorpos antitoxoplasma gondii e diagnóstico. Rev. Assoc. Med. Bras.,  São Paulo ,  v. 46, n. 4, p. 335-341,  Oct.  2000 . 
CARVALHO, A.G.M.A. et al. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA TOXOPLASMOSE CONGÊNITA. Rev. Ciênc. Saúde Nova Esperança – Jun. 2014;12(1):88-95.
GOMES, M.C.O. Sorologia para toxoplasmose. Rev. Fac. Ciênc. Méd. Sorocaba, v. 6, n. 2, p. 8 - 11, 2004.
MITSUKA-BREGANÓ, R., LOPES-MORI, FMR., and NAVARRO, IT., orgs. Toxoplasmose adquirida na gestação e congênita: vigilância em saúde, diagnóstico, tratamento e condutas [online]. Londrina: EDUEL, 2010. Diagnóstico. pp. 15-24.
PASSOS, Afonso Dinis Costa et al . Prevalence and risk factors of toxoplasmosis among adults in a small Brazilian city. Rev. Soc. Bras. Med. Trop.,  Uberaba ,  v. 51, n. 6, p. 781-787,  Dec.  2018. 
TORGERSON, P.R; MASTROIACOVO, P. The global burden of congenital toxoplasmosis: a systematic review. Bull World Health Organ 2013;91:501–508
ZHANG, H.-b. et. al. Synthesis and evaluation of novel arctigenin derivatives as potential anti-Toxoplasma gondii agents, European Journal of Medicinal Chemistry (2018).