Relatório da Aula Prática de Microbiologia e Imunologia - AV2

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Relatório da Aula Prática de Microbiologia e Imunologia
Por
Dayse Fátima de Lima Rodrigues
Michelle Pedrosa Andrade Velloso
Stephanie do Nascimento Pereira
PRÁTICA 1 – Montagem de Lâminas e Observação de Cianobactérias e Paramecium
Materiais:
Pipeta Graduada
Eppendorf
Lâmina e lamínula
Equipamentos:
Microscópio Óptico
Objetivo:
Aprender a preparar esfregaço de bactérias.
Observar microorganismos no microscópio óptico.
Método:
Com o auxílio da pipeta, coletamos o meio de cultura que estava no Eppendorf e pingamos duas gotas na lâmina; cobrimos com a lamínula para levar ao microscópio óptico.
Resultado:
Com a objetiva em 40X, observamos presença de Cianobactérias (bactérias que obtém energia por fotossíntese) que se movimentava de forma oscilatória por ter cílios presentes.
Notamos também a presença de alguns Paramécios (Protozários) que se movimentavam através de flagelos muito mais rapidamente.
Paramecium
Cianobactéria
PRÁTICA 2 – Preparação do Meio de Cultura
Materiais:
Placa de Petri
Erlenmeyer
Bastão de vidro
Termômetro químico 
Parafilme
Swab
Água destilada
Agar KASVI – PLATE COUNT AGAR
Álcool 98%
Equipamentos:
Agitador magnético
Balança de duas casas
Método:
Pesamos o meio de cultura com o Agar KASVI – PLATE COUNT AGAR para 250ml de água destilada
Para 1L de água	 		23,5g de meio de cultura
Para 250ml de água			5,87g de meio de cultura
Fizemos a conta do M.C. para 250ml de água destilada.
Colocamos a água no Becker e deixamos aquecer até 40°C no agitador magnético.
Despejamos o Agar, mexemos com bastão de vidro e em seguida despejamos o peixinho na mistura; Esperamos até entrar em estágio de ebulição e ficar translúcido. 
Despejamos o meio de cultura na Placa de Petri com o auxílio do bastão de vidro e esperamos esfriar.
Assim que endureceu, marcamos o posicionamento na Placa de Petri e na tampa escrevemos o local que seria inoculado com as iniciais e numeramos:
MS = Mão Suja
ML = Mão Lavada (com detergente)
MA = Mão com Álcool (70%)
MS
 
ML
 
5
 
MA
Com o Swab coletamos amostras das mãos, inoculamos no meio de cultura e isolamos com Parafilme.
PRÁTICA 3 – Teste de Lavagem e Esterilização das Mãos
Equipamentos e utensílios:
Estufa
Método:
As Placas de Petri foram colocadas com as amostras em uma estufa a 30°C por 72h.
Resultado:
Na Placa de Petri nº 5, as três amostras coletadas estavam com flora bacteriana presentes.
PRÁTICA 4 – Coloração de Gram
Materiais:
Alça de Platina
Água esterilizada
Álcool – Acetona – Seg. Gram (Val.: 29/01/2020)
Tubo de Ensaio
Lâmina e lamínula
Lamparina
Corante: Violeta Genciana Fenicada – Seg. Gram
Corante: Lugol Fraco – Seg. Gram
Corante: Fucsina Fenicada de Gram
Equipamentos:
Microscópio óptico
Método:
Flambamos a alça de platina e resfriamos em um tudo de ensaio com água esterilizada; 
Depositamos duas gotas de água esterilizada sobre uma lâmina;
Coletamos uma amostra de bactéria na cultura sólida com a alça de platina e misturamos na gota d’água na lâmina;
Passamos a lâmina com a amostra na lamparina para secar a água e aderir as bactérias;
Pingamos duas gotas de violeta genciana sobre a lâmina com bactéria, deixamos agir por um minuto e lavamos a lâmina com água esterilizada para retirar o excesso do corante;
Pingamos lugol na lâmina com amostra e deixamos por mais um minuto e depois, pingamos álcool sobre a lâmina com a amostra, deixamos por 20 segundos e lavamos com água esterilizada;
Pingamos azul de fucsina sobre a lâmina por 30 segundos e lavamos com água esterilizada;
Colocamos uma lamínula sobre a lâmina e levamos ao Microscópio óptico.
Objetivo:
Identificar bactérias Gram + e Gram –
Resultado Esperado:
Bactérias com coloração roxa = Gram + (forma de cocos)
Bactérias com coloração rosa = Gram – (forma de bastonete)
Porque se chama Coloração de Gram?
A técnica de Gram, mundialmente conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método que consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de gram-negativas.
A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como gram-positivas ou gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.
Por quê se colorem de forma distintas?
Existe um protocolo que se segue para fazer a coração de um esfregaço, com etapas bem definidas e com misturas de substâncias (solução de cristal violeta; solução de lugol (iodeto de potássio - KI); solução de fucsina e solução de álcool) que resultarão na coloração positiva ou negativa.
Esta coloração permite distinguir os mais variados tipos de bactérias e que tipo de parede celular elas tem (se mais simples ou mais complexas, com mais ou menos peptideoglicanos – principal componente da parede celular bacteriana). As bactérias que descorarem quando submetidas à um solvente orgânico são Gram-negativas, e as que permanecerem coradas mesmo quando em contato com o solvente são denominadas Gram-positivas.
Estas bactérias de diferentes colorações tem também graus diferentes de virulência. As Gram-negativas, por exemplo, são constituídas por uma endotoxina denominada LPS (lipopolissacarídeo), que é causadora da patogenicidade. Já as Gram-positivas possuem a exotoxina rica em ácido lipoprotéico que confere aderência à bactéria.
Por que a bactéria é Gram +?
As bactérias Gram-positivas retêm o cristal violeta devido à presença de uma espessa camada de peptidoglicano (polímero constituído por açúcares e aminoácidos que originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias) em suas paredes celulares, apresentando-se na cor roxa.
Por que a bactéria é Gram - ?
As bactérias Gram-negativas possuem uma parede de peptidoglicano mais fina  que não retém o cristal violeta durante o processo de descoloração e recebem a cor vermelha no processo de coloração final.
Exemplos de Gram + ou Gram –
Gram + = Bacillus, Nocardia, Clostridium, Propionibacterium, Actinomyces, Enterococcus, Cornyebacterium, Listria, Lactobacillus, Gardnerella, Mycoplasma, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus.
Gram - = Escherichia, Helicobcater, Hemophilus, Neisseria, Klebsiella, Enterobacter, Chlamydia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella. Entre outras, como Chlorobi, Chloroflexi, Cianobactérias, Espiroquetas, etc.