Citogenética Molecular por Hibridização Fluorescente

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Profª Drª Fádua Rosana Coelho Rits
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É a técnica de citogenética molecular mais comumente utilizada. 
Utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescência para detectar anomalias cromossômicas que estão além do poder de resolução da citogenética de rotina, como microdeleções e rearranjos cromossômicos complexos. 
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Detecta seqüências específicas de ácidos nucléicos pela formação de um duplex de um fragmento de ácido nucléico de fita simples modificado (sonda) e sua seqüência complementar (seqüência alvo) no espécime fixado. 
A sonda de DNA reconhece e se hibridiza com sua seqüência complementar no cromossomo. 
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Pode ser aplicada tanto para células em pró-metáfase, metáfase como em interfase, o que permite fazer diagnósticos citogenéticos mais acurados, tanto para anormalidades constitucionais, quanto para mudanças cromossômicas adquiridas como no caso de células cancerosas. É também um instrumento valioso para mapeamento gênico. 
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Pesquisas de aneuploidias podem ser feitas mais rapidamente. Não há necessidade de crescimento de células em culturas. 
Tecidos preservados podem ser investigados. 
Pode ser aplicado para lâminas padrões de citogenética, mas também para tecidos fixados em formol, amostras de sangue e de medula óssea. 
  
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Quanto às bandas: 
Identificação de alterações além da resolução visual (microdeleções). 
Visualização de rearranjos cromossômicos em regiões camufladas pelas bandas (rearranjo crítico). 
Rearranjos de difícil interpretação como rearranjos dentro do mesmo cromossomo
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- Método direto: ligação com fluorocromo;  
- Método indireto: moléculas sinalizadoras - biotina, digoxigenina - conjugam-se com outra molécula ligada ao fluorocromo (avidina ou anticorpos).  
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No dia seguinte, a lâmina é lavada para a remoção das sondas em excesso. 
Contracoloração (counterstainig):      Adição de soluções que irão colorir o resto do material cromossômico.  
Mais usadas: DAPI (azul), propidium iodice (vermelho) 
Visualização: 
em microscópio epifluorescência. 
filtros específicos para o os fluorocromos e “couterstaining”.   
  
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Desnaturação da sonda e do DNA cromossômico por aquecimento em solução de formamida (70°C). 
As sondas então colocadas sobre as lâminas que são incubadas a 37C “overnight” em câmara úmida e escura.
Durante esse período, a sonda se liga à região alvo do cromossomo e ocorre a hibridização.
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Visualização:
em microscópio epifluorescente.
filtros específicos para o os fluorocromos e “couterstaining”.
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Sondas centroméricas ou alfa satélites: para seqüências de DNA repetitivo localizadas no centrômero ou região pericentromérica. Adequada para diagnóstico de aneuploidias
		
Sondas de seqüência única para o cromosssomo  sondas específicas para determinado loco ou gene.   	EX: Deleções e duplicações submicroscópicas. 
Sondas para cromossomo inteiro “pintura cromossômica”  Rearranjos complexos; 
Identificação da origem de material cromossômico adicional (cromossomos em anel). 
Sonda “Painting”
		Ex: Em vermelho, o cromossomo 4  
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Sondas centroméricas ou alfa satélites: para seqüências de DNA repetitivo localizadas no centrômero ou região pericentromérica. Adequada para diagnóstico de aneuploidias
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Em vermelho, cromossomo X e em verde, o Y
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Sondas de seqüência única para o cromosssomo: sondas específicas para determinado loco ou gene.   	EX: Deleções e duplicações submicroscópicas. 
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Sondas para cromossomo inteiro “pintura cromossômica” 
Identificação da origem de material cromossômico adicional (
Sonda “Painting”
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Em vermelho, o cromosomo 4
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Detecção de aneuploidias 
Aneuploidias dos cromossomos X e Y e trissomias do 21, 13 e 18 são responsáveis por 90% das anomalias cromossômicas. 
Diagnóstico em poucas horas. 
Análise de linfócitos do sangue periférico e amostras de vilosidades coriônicas, células do líquido amniótico ou cordão umbilical (em diagnóstico pré-natal). 
Utilização de sondas de seqüência única ou alfa satélite. 
Contagem dos sinais fluorescentes na célula interfásica.   
Espectro Multicolorido
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Cariotipagem por espectro multicolorido  Detecção de pequenos rearranjos cromossômicos constitucionais ou adquiridos, como no câncer.
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Cariótipo espectral ,com 
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Cromossomo de um paciente com ataxia mostrando a transferência de material do cromossomo 4 para o 12. 
A análise dos cromossomos de uma célula de câncer de seio humano mostra múltiplas alterações. Analise das mudanças pode permitir predições da severidade da doença e também pode ajudar a direcionar a terapia contra o câncer.
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Diagnóstico pré-implantação 
Possível com os avanços no campo da fertilização “in vitro”. 
Remoção de 1 ou 2 blastômeros em embriões de 3 dias. 
Permite diagnóstico de alterações cromossômicas ou gênicas. 
Seleção de sexo do embrião (em doenças ligadas ao X). 
 Obs: Limitação da alta freqüência de mosaicismo na fase inicial do desenvolvimento humano com aneuploidias e poliploidias.
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Síndromes de Microdeleções 
Deleções pequenas e de difícil detecção. 
Diagnóstico mais preciso. 
Análise dos cromossomos em metáfase ou interfase. 
Usadas duas sondas: uma cromossomo-específica e outra loco-específica. 
Exemplos:
Síndrome de Williams (7q-) - deleção de gene da elastina. 
Síndrome de Prader- Willi/Angelman(15q-). 
Síndrome do Miado do gato - cri-du-chat (5p-). 
Deficiência de esteróide-sulfatase (Xp-). 
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Deficiência de esteróide-sulfatase- Microeleção no cromossomo X
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Leucemias 
Avaliação da origem clonal. 
Caracterização das alterações cromossômicas e estruturais:  diagnóstico, prognóstico e tratamento. 
Detecção de doença residual mínima. 
Identificar recaída da doença. 
Monitoramento pós-transplante: quando doador e receptor são de sexos diferente para verificação da proporção de células XX e XY 
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Leucemia Mielóide Crônica (LMC)
	- Avaliação da presença do crossomomo Philadelphia - translocação entre 9 e 22- não visualizada em 5% das análises da citogenética padrão.
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Cromossomo Philadelphia
Leucemia Mielóide Crônica (LMC):doença clonal caracterizada pela proliferação e acúmulo de células tumorais mielóides. 
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Leucemia mielóide aguda com Ph ou BCR/ABL.
Translocação entre 9 e 22 (não visualizada em 5% das análises da citogenética padrão
TRANSLOCAÇÃO BCR/ABL OBSERVADA NO 
CROMOSSOMO PHILADELFIA
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Leucemia Linfóide Crônica
Trissomia do 12 em 30% dos casos.
14 q+ em 20%.
Alterações do 13 em 20%.
Deleção 6q em 10%.
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Leucemia Mielóide Aguda
Leucemia promielocítica aguda: rearranjo PML/RAR- t(15;17).
Leucemia mielomonocítica aguda: pesquisa da inversão do cromossomo 16
Leucemia monocítica aguda e leucemia aguda de lactentes: pesquisa de alterações envolvendo o gene MLL (11q23).
Leucemias com monossomia 7, 5 ou trissomia 8 para detecção de doença residual no controle pós terapia. 
Leucemia mielóide aguda com Ph ou BCR/ABL.
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Leucemia Linfóide Aguda
Cromossomo Ph.
Rearranjo do gene MLL.
Hiperdiploidia.
Rearranjo dos genes TEL/AML1t(12;21)
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Câncer de Mama
FISH é utilizado para demonstrar a amplificação de genes. 
A superexpressão de oncogenes tem papel importante na progressão de vários tumores.
25-30% dos tumores de mama e ovário tem amplificação do gene HER2/neu.
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HER2/neu é um proto-oncogene localizado no cromossoma 17 e que codifica uma oncoproteína transmembrana, a p185HER2.
A presença do HER2/neu determina rápida proliferação do tumor e muita agressividade.
Através de sondas de DNA complementares marcadas com fluorocromo, pode-se visualizar um número aumentado de cópias do gene em relação às 2 normalmente existentes.
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Cromossomo 17 em verde e os genes Her2 em laranja.
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http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/seminarios%20monitores/seminariofish.ppt#257,2,FISHROONEY D.E., CzZEPULKOWSKI B.H.. Human Cytogenetics -Essencial Data. Reino Unidio. Ed. Wiley, 1997.
Http://www.meds.com/molmime/ leukemia/guide/1660s13.jpg
http://www.institutofleury.org.br/site/calandra
http://www.mostgene.org/gd/gdvol13a.htm
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842005000200008&lng=en&nrm=iso&tlng=pt
http://www.slh.wisc.edu/cytogenetics/procedures/fish/index.php
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Obrigada
Obrigada!
Caracterização, prognóstico, diagnóstico e tratamento. Monitoramento da eficácia do tratamento