Apostila - Parasito

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FI! C T A I m p O R T A N T E
Este roteiro de t~cnicase pr~ticas de laborat~rio ~
parte integrante do li~ro têxto de Parasitologia Humana do Prof.DA.
VIO PEREIRA NEVES,9º ed. da Ed. livraria At~eneu adotado no Complexo
Educacional S~o Judas T.deu para os alunos dos cursos de Ci~ncias ffi-
ológicas,Nútri;ào,Extensào Universitária e alunc e do curso profissiD-
nalizante em Patologia CIInica(T~cnico),do Col~gio sic Judas Tadeu.
O uso do livro têxto na sua integra na bancada do laboratório tornou-
-se inconveniente para o aluno,visto qua com frequência estes livros
são danificados com corantes,reagentes e c~ntaminação com sangue e
fezes e~ exame. Para garantia de preservação de livro foi sugerido
fazer ~ápia xerox dos capItules referentes à prática de laboratório
como roteiro.Atendendo a essa precauçiL ~or parte dos alunos em con-
servar D livro.em referência aa seu alto valor didática-pedagógico,. "censultas e aprend~zado,pasou-se a usar estas copias nas aulas pra-
ticas.Outrossim exclarece-se que as cópias são tiradas pelo próprio,aluno intsressado pagando exclusivamente o valor da copia cobrado
pela copiadnra.Nio se trata de comercializaçic dsste rotsiro visto~
Que esta prática é proibida. •.. , , .A com~lem?ntaçao teorica,de cada espec~e de parasi-
ta estudado tem que ser no livro tixto priginal adotado no inIcio
do ano letivo • P~RASITCLOGIA HumANA • OAVIO PER:IRA NEVES, LIVRA-
R I'" .t\THf:NEU.
Docentes qu'e irão ministrar aulas práticas de labo-
, . iratnr í.eapoiados neste rote ro de Parasitologia:
Prof. ROBERTC f~RRA80lI
Profa.CLElOEmAR 5AmPAIO GOmES
Prof. IVAO TAKAYAffiA
Prof. ROBERTO DA COSTA
INDICATIVO DE ASSUNTOS
Aedes aegypti •••••. .......................
4ncylcstomid~o~ •••
.!\nopheles•••••••.
........ ............
Aeceris lymbricaides ••• ·...................
9alantidiuIII coli •.••••••••••••••••••••••••••••••
Cicl~ ~ioló~ic~ da mosca ••.•••••••••••••••••••••
Ciclo biolóoico dos ~ncylosto~ideo~ •••••••••••••
r . - .-I • t.;:_~r~l:;;a;;:.:;,ç,;r..:a:;;:.::o~..:u::..;;...e-=l~n~s..;e;;;..;:~o:;..;;..s•••••••••• • • • •• •• • •• • •• ••••• • •
Cisticf!rco cisticercose.e ......................· .
D erma tobia hominis(je=ne) ••••••• ............
Entam-o eba s (arneba 5) ••.••••••••••••• ...............
~squema5 de diversas parasitas ••• ...............
Ecninococcus oranulcsus •••••••••••••••••••••••••
[x<s'meparasitol~gico de !-<:ingue.••••••••••••••••••
Elefant!ase •••••••••••••••••••••••••••••••••••••
Extendido de sangue{esfregaço) ••••••••••••••••••
Exames parasito1ógico de fezes ••••••••••••••••••
Fasciola hepatica ••••••••••• ~•••••••••••••••••••
Gi;~r dia lambI ia. •••••••••••••••••••••••••••••••••
~i'ematozoários(p3.rasitas do sangye) ••••••••••••••,.Hematoxilina ferrica ••••••••••••••••••••••••••••
~ymenolepis ~ ••••••••••••••••••••••••••••••••
Ind~ca~ões Clt~ic3.~ e "2étado~.de exa~de f'ézes
!sospora belLi ••••••••••••••••••••••••••••.•••••
Larvas de Ancv~ostomideos •••••••••••••••••••••••
Larv~~~gUltas de ~ncylostamide3s •••••••••••••••
meios de cyltura ••••••••••••••••••••••••••••••••
m~todo para conservaçio de.fezes ••••••••••••••••
métodos de exames •••••••••••••••••••••••••••••••
metados de exames e esQUemas ••••••••••••••••••••
Notas importantes •••••••••••••••••••••••••••••••
Schistosoma mansoni •••••••• .....................
Stronoyloides stercoralis •••••••• • • • • •• •• •• •• • • •
- Tsenias cisticercose ••••••••••• ...............e
§_ Enterobius varmicularis •••••••••••• ••••• ••••••••
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03
Exame Parasitológico
de Sangue
INTRODUÇAO
Várias doenças parasitárias, tais como malária, filariose e doença de Chagas. especialmente
em sua fase aguda. podem ser diagnosticadas pelo encontro do parasito no sangue circulante.
Os métodos adorados para cvidenciação do parasito devem ser executados imediatamente
;"IpÓSa colheita do sangue. Caso isso não possa ser feito, há possibilidade de colher o sangue em
vidros contendo anticoagulantes (hcparina ou citrnto) e então, quando for possível. executar os
métodos de exame indicados. A hemoscopia assim feita é menos nítida do que quando em material
fresco.
COLHEITA DO SANGUE
Os locais mais usados são a polpa digital do anular esquerdo ou lóbulo da orelha, onde a pele
é fina e há boa irrigação sangüínea.
Com algodão molhado em álcool iodado ou álcool puro. limpa-se a superfície escolhida.
Com um alfinete nu :t~ulha de Bcnsnudc, previamente esterilizada, faz-se uma pequena picada na
pele. Por compressão, sai pequena gota de sangue, a qual poderá ser examinada por um dos
processos a seguir.
Um detalhe importante: ao se fazer a picada, o dedo ou o lóbulo da orelha devem estar bem
secos. Caso estejam molhados pelo desinfetante ou pelo suor, haverá hemólise das hernácias.
MÉTODOS DE EXAME
Direto
A gota é colhida no centro de uma lâmina, coberta com lamínula e examinada imediatamente
após, pois a coagulação é rápida. Caso queira retardar a coagulação, pode adicionar uma ou duas
gotas de salina. Levando-se essa preparação ao microscópio, poderão ser vistos os parasitos
porvcntura existentes. Esse exame direto ou a fresco permite visualizar os parasitos vivos,
movimentando-se.
Em esfrcgaços
Existem dois tipos fundamentais de csfregaços - O esfregaço em camada delgada e o
esfregaço em camada espessa. São conhecidos também, respectivamente, por gota estirada e gota
espessa. Ambos são muito utilizados. O primeiro é mais usado para identificação da forma e espécie
de vários parasitos. pois, quando é bem feito, os mesmos aparecem nitidamente. Jáosegundoé mais
utilizado em diagnóstico cpidemiológico. É um método de enriquecimento, isto é, a gota de sangue
é disposta numa pequena área e então examinada. Os parasitos aí presentes podem ser diagnosticados
com muita economia de tempo. mas a sua identificação específica é dificultada (ver Fig. 51.1).
A seguir, descreveremos cada uma dessas técnicas.
ESFREGAÇO EM CAMADA DELGADA
• colocar uma gota de sangue na extremidade direita de uma lâmina (esta deve estar
apoiada sobre a mesa);
• pegar outra lâmina, segurar por cima com a mão direita e, com uma inclinação de 45°,
encostar adiante da gota;
• deixar a mesma se espalhar pela superfície de contato das duas lâminas;
• puxar a gota espalhada ate o fim da lâmina;
• secar por agitação vigorosa imediatamente (se não secar rápido, haverá hemólise das
hemácias);
• corar pelo Giemsa ou Leishman conforme indicado adiante.
Esfregaço delgado Gota espessa
Fig. 51.1- Confecção de csfregaços sanguincos.
ESFREGAÇO EM GOTA ESPESSA (técnica utilizada pelo Prof. Leônidas de Mello
Deane)
• colocar Srnm? de sangue na lâmina;
• com o canto de outra, espalhar essa gota numa área de lcrrr';
• deixar secar ao ar durante seis a 36 horas;
• entre seis c 36 horas (não ultrapassar esses períodos) corar pelo Giemsa (uma gala de
solução-estoque por ml de solução-tampão);
• deixar em repouso por 30 minutos;
• lavar e examinar.
04
Cl~O o csfrcgnço tenha secado por mais de 36 horas. deve-se então proceder assim:
• colocar a lâmina com a i!0t3 espessa numa vasilha com á~ua destilada;
• deixarem repouso por 10 minutos. para dcscmnglobinizar:
• rcurur 3 lâmina cuidadosamente:
• deixar secar por alguns minutos;
• Ci... rr pelo .ilcool metilico (dois minutos) e corar pelo Giemsa (30 minutos).
CORANTES
Os mais usados são os derivados do Rornanowsky. Destes, os mais comuns são o Gicrnsa
e o Lcishrnan. As técnicas para sua preparação e emprego são as seguintes:
• Gícrnsa
Azur II ensina O,30g
Azur II O.08g
Glicerina 12.S0g
Álcool metílico 37,SOg
Esta é a solução-estoque. Pode ser preparada em laboratório ou comprada pronta. Para ser
usada. deve ser diluída em solução-tampão da seguinte forma: três gotas de corantc-cstoquc, para
cada 2m1 de tampão.
,\ solução-tampão, com pl! 7.2, é assim prcparad ••:
• solucâo-cstoquc A: Iosfato de sódio secundário (dissódico): dissolver I 1.i)Ú(lg desse em
I.(l(l(lllll de ;ígll:t clcxt il.u!»;
• solução-estoque 13: fosfato de potássio primário (monopotássico): dissolver l),073g
desse em I.OOOml de água destilada.
Essas soluções-estoques devem ser rnantidas em geladeira. Na hora de usar, misturar 72.Sml
da solução A, com 27,4ml da solução B. Para se corar pelo Gicrnsa. após feito oesfregaço, proceder
da seguinte maneira:
• fixar pelo álcool rnctrlicn: cinco gotas por dois minutos;
• preparar o cornntc: três gotas do Giernsa para 2ml da solução-tampão;
• cobrir o csfrcgaço e deixar em repouso por 20 a 30 minutos;
• escorrer o corante e lavar em água corrente;
• deixar secar e examinar au micruscópio .
• Leishrnan
Compra-se no comércio o pó, que é uma mistura de azul-dc-rnetileno e cosina, Para se
preparar o corante, dissolve-se O, ISg do pó em 1OOml de álcool metílico. Agitar frequentemente,
pelo espaço de três dias, quando então estará pronta para o uso.
Para se corar pelo Leishman, após feito o esfrcgaço, proceder da seguinte maneira:
• cobrir o csfrcgaço com seis ou sete gotas de corantc;
• deixar agir (fixar) por 15 segundos no máximo;
• adicionar então) 2 a 14 gotas de solução-tampão;
06
•
homogeneizar, soprando-se II cnrantc com a pipcra e deixar em repouso por 20 minutos;
escorrer o coruruc e lavar em ;ígua corrente; .
deixar secar e examinar ao rnicrnscopiu,
•
() eslrcga~ll co r.ulu pelo lcixluuun nú» ncccsxua de riX;I~;Il' prévia pc lo .ilcool mcuf ico, I'"is
este j;í faz parte da fórmula do cor ante. Em geral, as lâminas preparadas por esse método não sáo
muito durtiveis nem t50 perfeitas quanto pelo método de Gicrnsa, mas é uma técnica muito utilizada
em vista da rapidez e Facilidade de execução.
WUCHERERIA 8.4.NCROFTI E A FILARÍASE LINFÁTICA
\ficrot1lárias
." \lORFOI.()(;I.-\ DAS .\IlCROFtl.ARIAS
2 3 4 5 6
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Flg. 50_1 Wuchereria boncroiti.
A. Extremidade anterior da fê-
mea. vendo-se a vagina e o poro
genital (o). B. Ciclo evolutivo da
filária. no mosquito: I. microfilária
crnbainhada ingerida pelo inseto:
2. microfilária que já perdeu sua
bainha e passou do estômago para
a hemolinfa; 3 e 4. formas salsi-
choides localizadas nos músculos
toracicos do mosquito; 5. larva de
segundo estádio; 6. larva de tercei-
ro estádio. ou larva infectante. na
probóscida do inseto vetar. C.
Morfologia de microfilária sangui-
cola: a. bainha; b, estilete: c. célu-
las subcuticulares: d, espaço cor-
respondente ao anel nervoso: e. cé-
lulas somáticas; I. poro excretor:
g. celula excretora; h, corpocen-
trai (reservas nutritivas); i. primor-
dio genital; j. outras células em-
brionárias; k, poro anal; I. núcleos
caudais bem distintos e dispostos
em fila simples que não atinge a
extremidade posterior.
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F1g. 32.2 - CIcio da Wuchcrcria bancrofli. 1)Homem parasitado; 2) microfilâria sangue periférico [entre 22 c 4 horas);
3) Culcx quinquefasciatus ingerindo mícrofilâria; 4) microfilâria desembainhada no estômago e hemolinfa; 5 e 6) formas ~'II:,32.6 _ Wuchclcria bancrotu provocando altcraçôcs: A - mulher apresentando clcfanüasc tcdcma linfútico t'
sals/ch6ides nos músculos lordcicos do mosquito; 7) larva de 2" estãdio; 8) larva de 3" estádio ou larva injectam«; 9) larva I qllcralinizaçiJo cu/tlnea) das pernas emamas; B =-homem apresentando elefanttase do esc roto e edema linfático da pcma
infCS:lanle na probôscida tio inseto, que será depositada na pele do hospedeiro, Essas peneiram ativamente, caem lIal esquerda (segundo Mackie Ti Hunter G& Worlh B) C -elefanllase de pernas; O -hidrocele com inicio de elejarütase
circulação lill[d/ica, transformam-se em vermes adultos e, 7 a 8meses depois, iniciam a eliminação de microfilartos. dr t.,cr•.", ("eKundo Pcdrosa, Rocha & Fomes, 1994).
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Fig. 54.8 Panstrongvlus gemculutus. macho. As fé meas medem 22.5 a 2'1.:;
mm; os machos. 22 a 28 mm. A cor e castanha-clara ou castanho-alaranjada
clara. com manchas castanho-escuras ou negras em várias partes do corpo
Fig. 54.7 Panstrongvlus megistus. leme". O Inseto e grande e suas dimen-
sões ficam compreendidas entre 29 e 38 mm de comprimento por 12 a
14 de larg -ra. As áreas claras do conexivo e do dorso são avermelha >;. "'1
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Fig. 56.1 Anopheles [Nyssorhynchus} albitarsis.
Fig. 56_21 Aêdes aegypti, vetor de febre amarela e de dengue.
Planches hématologiques «SAN o o Z"
Grossissement 1 : 400 et 1 : 1200
1 : 1200
217. A. B. C. D. E. F.
Paludisme: tierce bénigne. Cycle de division de plasmo-
dium vivax, sang: A. B. C. anneaux et formes amibo'ides
jeunes, D. E. formes de division, F. mérozoites libres.
1 : 1200
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219. A.
Tierce bénigne.
A. anneaux et B. gamétocytes; goutte épaisse.
1 : 1200
221. A. B.
Leishmaniose, Leishmania donovanl dans les monocytes
de I'homme; frottis de moelle osseuse,
Color-atlon de Pappenheim.
09
Planche XXXVIII
1 : 1200
218. A. B. C. D, E.
Tierce bénigne. Cycle sexué de plasmodium vivax dans
le sang: A, B. C, gamétocytes femelles,
D, E, gamétocytes mâles; frottis sanguins.
1 : 1200
220. A, C,B.
Trypanosomiase: Trypanosoma gambiense:
A. homme, B. cobaye.
C. trypanosoma cruzi, cobaye; frottis sanguins.
1 : 400r-------~------~----~~--~
222. Filariose. Infection mixte à loa-loa et à dipetalonema
perstans dans Ia sang, chez I'homme; goutte épaisse.
A gauche, larve de loa-Ioa, à droite, de dipetalonema. y
Planches hématologiques «S A N O O Z»
Grossissement 1 : 1200
211. A.. B.
Fiêvre récurrente. Spirochête d'Obermeier;
frottis sanguin. A. préparation à l'encr e de Chine;
B. coloration de Pappenheim.
213. A. B. C. D. E.
Tierce maligne. Cycle sexué de plasmodium falciparum
dans le sang: A. B, et C. gamétocytes femelles,
D. et E. gamétocytes mâles; frottis sanguins.
215. A. B, C, D, E.
Paludlsrne : forme quarte. Cycle de division de
plasmodium malariae dans le sang: A.-D. formes
en bande, E. forme de division; frottis sanguins.
Planche XXXVII
212. A. B. C. D. E. F.
Paludisme: tierce maligne. Cycle de division de
plasmodium falciparum dans le sang: A.--E. anneaux
et F. forme de division ; frottis sanguins .
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214. A. B. C.
Tierce maligne. A. anneaux, B. forme de division,
C. gamétocytes (goutte épalsse).
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216. A. B. C. D.
Forme quarte. A. et 5, cycle sexué dans le sang :
gamétocytes; frottis sanguins. C. anneaux et D, forme
de division (goutte épaisse).
11
Exame Parosifológico de Fezes
INTRODUÇÃO
A coproscopia parasitária tem como objetivo evidenciar e identificar os parasitos que vivem
no tubo digestivo do homem ou os parasitos em que as fezes constituem o veículo normal para a
disseminação de suas formas para o meio externo. Entretanto, não existe um método de exame de
fezes capazde evidenciar todos os ovos. larvas de helmintos ou cistos e trofozoftos de protozoários
intestinais. Alguns métodos. entretanto. são mais usados rotineiramente, pois são capazes de
evidenciar maior número de formas, além de serem de execução fácil e barata (ver Tabela 52.1).
Destes, os dois mais utiliz-dos rotineiramente em quase todos os laboratórios d ~ málises clínicas
são o de sedimentação \.~v,mtânea (método de Lutz ou Hoffmann, Pons c 'Janer) ou o de
sedimentação por centrifugação (método de Ritchie-formol-éter-ou método de Blagg-MIFC).
Este último, por ser rápido e apresentar um material mais claro e nítido, deve ser o preferido.
Em geral, quando o clínico não suspeita de determinada parasitose intestinal, o exame de
fezes é feito por um dos métodos citados, recomendando-se a repetição do exame do mesmo
material ou de outra defecação no caso de resultado negativo. Entretanto, quando há suspeita de
determinada parasitose, pode-se fazer um exame com parte do material por um daqueles métodos
e com a outra parte fazer o exame específico, conforme mostrado na Tabela 52.1. Para que o exame
coproscópico seja o mais preciso possfvel, há necessidade de uma estreita colaboração entre o
laboratório e u médico. Já que este último deve sempre ler em mente que: I) algumas espécies de
parasitos são evidenciadas por técnicas especiais; 2) um exame isolado. onde o resultado é
negativo. não tem nenhum valor diagnóstico e 3) o material deve ser examinado o mais rápido
possível. Assim, é importante que o clínico ao examinar o paciente obtenha elementos básicos de
orientação para a escolha de determinada técnica. Esses elementos são: origem geográfica do
doente, história clínica (anamnese), resultados de outros exames laboratoriais, estar o paciente em
uso de algum medicamento que pode falsear os resultados. Devido à produção de cistos, ovos ou
larvas não ser uniforme ao longo do dia ou do ciclo do parasito, é recomendável que a colheita do
material seja executada da seguinte forma:
I) Quando há suspeita de alguma parasitose deve-se colher uma amostra de fezes por dia,
durante três a seis dias alternados, acumulando as amostras em um vidro com conservados.
Homogeneizardiariamente O material e encaminhá-Io ao laboratório, ao final do período
de três ou seis dias.
2) Para um exame de rotina, sem suspeita clínica formal, pode-se colher apenas uma
amostra de fezes e encaminhá-Ia ao laboratório.
Em vista da "alta incidência da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS), alguns
parasitos intestinais, até então esquecidos, vêm sendo observados com maior freqüência na rotina
lt
rarasitol(igica". Dessa forma "Julgamos que na rotina do exame rarasitológico de tezes hoi
necessidade de ser incluído sempre um método específico para ovos de hclrnintos, outro para cistos
de protczoários e outro para larvas. Nos casos de indivíduos imunocomprometidos, a rotina deverá
incluir a pesquisa de Cryptosporidium sp., bem como de outros coccídios até então menos comuns"
(Moura & cois., 1987) (ver Capítulo 17).
Frequentemente, as fezes são sem i-sólidas ou pastosas. Quando há necessidade de ser feito
(l exame em fezes líquidas (para pesquisa de trofozoítos de protozoários), é preciso que o paciente
tome um purgativo salino na noite anterior. °mais indicado é o Na2S04 (sal de Glauber).
Um cuidado especial, em qualquer exame, é o tipo de vasilha empregada para acondicionar
as fezes e a rotulagem (identificação) da mesma.
t.preciso orientar o paciente dizendo-lhe que a evacuação deve ser feita em urinol seco e parte
das fezes transferida para uma latinha própria ou vidro pequeno, de boca larga. Um ou outro devem
ser bem fechados. Chamar a atenção: uma latinha para cada paciente!
A rotulagem deve conter o nome do paciente, idade, data e, se possível, hora da coleta. A
remessa para o laboratório deve ser imediata.
MÉTODO PARA CONSERVAÇÃO DE FEZES
Freqüentemente não há possibilidade de remeter as fezes rapidamente ao laboratório ou
::.,tão examiná-Ias logo que cheguem. Nessas situaçôcs, há nncessidade de uso de conservadores.
Cs mais empregados são:
FRIO. Coloca-se o recipiente contendo as fezes na geladeira ou em caixas contendo gelo e
serragem. Enquanto a temperatura permanece baixa (5 a lOaC) não haverá putrefação e as fezes
podem ser examinadas dois ou três dias após emissão das mesmas.
FORMaL 5%. As fezes devem ser bem homogeneizadas nessa solução de formol: colocar
as fezes num vidro de boca larga que comporte o material, mais o dobro do volume em formoI5%.
Homogencizar bem. Assim feito, os cistos, ovos ou larvas permanecem conservados por mais de
um mês.
MIF. É a sigla de um conservador muito difundido, cujas iniciais significam Mertiolato (ou
mercuriocromo), lodo e Formol. A fórmula é a que se segue:
Água destilada 250m I
Sol. de rncrcurio-crorno a 1.500 250m I
Forrnol 2Sml
Glicerina 5ml
Usa-se como o formoI5%. No momento damicroscopia, adicionar gotas de lugol ao material
sedimentado para corar os cistos porventura existentes.
SAF. São as iniciais dos componentes de um dos fixadores mais largamente usados hoje. É
muito útil para fezes formadas e para fezes diarréicas, conservando bem os cistos e os trofozoítos.
Por essa característica substituiu o fixador de Schaudinn (que é extremamente tóxico), para
execução da técnica de hematoxilina férrica, no diagnóstico de trofozoítos de ameba e Giardia.
Fórmula do SAF:
Acetato de sódio 1,5g
Ácido acético 2,9ml
Formol 40% 4,Oml
Água destilada 92,5ml
Nota: Qualquer conservador é usado na proporção de dois partes dele para uma de fezes.
MÉTODOS DE EXAME
13
Nem sempre o número de formas encontradas nas fezes é suficiente pélra serem vistas num
simples exame direto (colocar uma gotícula de fezes na lâmina e examiná-Ia ao microscópio). Na
maioria das vezes h.i necessidade de examinar maior volume fecal, fazendo-se a concentração ou
enriquecimento das mesmas para evidcnciação das formas.
Os métodos de exame de fezes podem ser de dois tipos:
• qualitativos: são aqueles que acusam a presença de parasitos intestinais, mas não o seu
número provável;
• quantitativos: são os que permitem a contagem dos ovos nas fezes e indicam a
quantidade provável de vermes no paciente.
Métodos qualitativos
Os mais usados são (ver Tabela 52.1):
• centrífugo-f1utuação ou método de Faust: usado para pesquisa de cistos de protozoãrios:
• sedimentação espontânea ou método de Lutz (apresentado em 1919), também conhecido
como Hoffmann, Pons e Janer (HP J) (descrito em 1934): usado para diagnosticar ovos
de helrnintos. Ernj.regado também para evidenciar larvas de hclrnintos e cistos de
protozoãrios (Fig. 5':'.1);
• sedimentação por centrifugação: usado para diagnóstico de ovos de hclrnintos e cistos
de protozoários;
• flutuaçâo espontânea ou método de Willis: usado para pesquisa de ovos de helmintos
(principalmente ancilostorrudcos) e cistos de protozoários;
• método de Bacrrnann- Moraes: usado para pesquisa de larvas presentes em fezes frescas,
em cultura ou, ainda. para pesquisa de focos de larvas infectantes no solo (Fig. 52.2);
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FI~. 52.1 - Me'lndn de Lutz ou de Hoffmann. Pons c Jancr II/Pl). a) Frasco de borrei com [czcs, águac bastão; h) cálice
com a gaze c modo de transicrir /1.\' [('71'S dissolvidus 1111 águn; c) nílirc rum o srdimrnto pronto para exame e o ttquido
sobrenadantc.
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14
método de Rugai: com a mesma indicação do anterior, sendo de execução mais simples
(Fig. 52.3);
método de Sheather's (ou tlutuação em açúcar): especial para evidenciação de cistos de
coccidcos humanos ou animais.
A seguir, descreveremos os passos que devem ser seguidos para execução de cada método.
MÉTODO DE FAUST (ou centrífugo-t1utuação)
• diluir IOg de fezes em 20ml de água filtrada;
• homogeneizarbem;
• filtrar através de gaze, dobrada em quatro, num tubo de Wassermann;
• centrifugar por um minuto a 2.500rpm;
desprezar o líguido sobrenadante e a matéria depositada é ressuspensa em água e
ccntrifugada mais duas ou três vezes, até que o líquido sobrcnadante fique claro;
• depois da última lavagem, a água sobrcnadante é desprezada e o tubo é cheio com
2ml de uma solução de sulfato de zinco a 33% com densidade 1.180;
• centrifugar novamente por um minuto a 2.500rpm;
• os cistos (c ovos) presentes estarão numa película flutuante; a mesma é recolhida com
alça de platina, colocada numa lâmina junto com uma gota de lugol e coberta com
lamínula;
Fig. 52.2 - Método de Bacrmann-Moracs. a) Cálice contendo água morna (45°C); b) aparelho já montado, com as fezes
sobre a gaze, em contato com a água morna.
Fig. 52.3 - Método de Rugai. Fezes dentro da gaze em contato Com a água morna contida no cálice de sedimcltraljão
(segundo Pessoa. 1977).
15
• levar no rnicroscopio e examinar com aumento 10 x e 40 x.
~\lI~TODO DE LUTZ OU DE HOFFMANN, PONS E JANER (ou sedimentação
csponr.inca )
• aproximadamente 2g de fezes são colocados em um frasco de Borrei com cerca de
5ml de água. triturar bem com bastão de vidro;
• acrescentar mais 20ml de água;
• filtrar a suspensão para um cálice cônico de 200ml de capacidade. por intermédio de tela
metálica ou tecido de náilon com cerca de 80 a 100 malha por cm-, ou gaze cirúrgica
dobrada em quatro;
• os detritos contidos na tela, no náilon ou gaze são lavados com mais de 20ml de água,
agitando-se constantemente com o bastão de vidro, devendo o líquido da lavagem ser
recolhido no mesmo cálice;
• essa suspensão de fezes é deixada em repouso durante duas a 24 horas;
• completar o volume do cálice com água;
• fi ndo esse tempo, observar o aspecto do líquido sobrcnadantc para tomar uma das duas
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I'I~.~2.4- Cistos de protozodrios (aumento 40 x} c ''"OS de hclmintos (aumento! O.rl comum ente encontrados em exames
de fezes. a] E. eoli; b] E. histotyücn, c) G. lambha, di S. mansoni; el H, na na; f) Tenia sp; 111Ancylostomatidae recém-
emitido; h) Ancy/ostomatidaccmbrionado; i) E. verrnicularis-j) A. lurnbricoidcs, k) A.lumhricoidcs infcrtil: /) T.lrichiura.
16
alternativas: :I) li líquido está turvo - descarta-to cuidadosamente sem levantar ou
perder o sedimento e colocar mais água até o volume anterior e deixar por mais 6U
minutos em repouso; b) o líquido está limpo e o sedimento bom: proceder à colheita do
sedimento para exame:
existem duas técnicas de se colher o sedimento para exame:
a) no cálice completo com o sedimento e o líquido, introduzir uma pipeta até o fundo
e colher uma gota do sedimento (a pipeta é introduzida até o fundo do cálice com a
ponta oposta obliterada pelo dedo indicador; retirar o dedo para subir uma pequena
porção do sedimento na pipeta e rapidamente recolocar o dedo; em seguida retirar
a pipeta obliterada);
b) desprezar o líquido cuidadosamente, hornogeneizar o sedimento e colher uma
gota do mesmo (esse processo é melhor, pois a gota colhida é mais representativa do
sedimento).
• o sedimento colhido é colocado numa lâmina; adicionar uma gota de lugol, homo-
geneizar. colocar uma lamínula e examinar com aumentos 10x e 40x.
I\IÉTODO DE SEDIMENTAÇAo POR CENTRIFUGAÇÃO
Esse método tem um só princípio de ação (sedimentação por centrifugação) mas algumas
variáveis na execução e conservação das fezes. Assim, quando as fezes são conservadas em formol
10%, a técnica tem o nome de "método de Ritchie" ou "formol-éter": quando conservadas em MIF,
o nome já é "método de Blagg" ou "MIFC". A seguir será descrito o método de sedimentação por
ccntrifugação:
• colher <1:-' tc/e~ rcccm-cmiudas em liquido conservador de MlF. Iornu ~ ;<J% ou SAF;
• hornogeneizar bem;
• filtrar um a 2ml da suspensão (gaze cirúrgica dobrada em quatro) num tubo cónico para
centrifugação;
• acrescentar 4 a 5ml de der sulfúrico e agitar vigorosamente (importante para dcscngor-
durar o material);
• centrifugar por um minuto a 1.500rpm;
• com auxílio de bastão, retirar a camada de detritos;
• desprezar o líquido;
• com algodão, limpa-se as paredes do tubo (este deve permanecer com a boca voltada para
baixo);
acrescentar ao sedimento gotas de salina e/ou lugol;
• com pipcta, colher uma gota. colocar na lâmina, cobrir com lamínula, levar ao micros-
cópio, examinar com aumento 10 x e 40 x.
Recentemente, foi lançado no mercado o Coprotcst, que é um processo simplificado e seguro
de sedimentação por centrifugação. Consiste no seguinte:
• o paciente compra em farmácia o recipiente Coprotest, o qual já vem com o conservador
(M IF); coloca as fezes na cavidade do coletor, fecha e agita por dois minutos para
homogeneizar; envia ao laboratório;
• o laboratorista recolhe a amostra em tubo de centrífuga; acrescenta 3ml de acctato de
etila ou éter, agita bem e centrifuga por três minutos; despreza os detritos e o líquido
sobrcnadante, e acrescenta uma gota de lugol ao sedimento; recolhe uma amostra numa
lâmina, cobre com lamínula e examina ao microscópio.
MÉTODO DE WILLIS
• colocar 10g de fezes num frasco de Borrei;
17
• diluir J mesma em solução saturada de açúcar ou sal (N<lCI);
• completar <lvolume até a borda do frasco;
• c(,I<lc(r na h"ca d" frasco uma lámina. que deverá estar em contato com o líquido:
• deixar em repouso por cinco minutos;
• findo esse tempo. retirar rapidamente a lâmina. voltando para cima a parte molhada;
• cobrir com larrunula. levar ao microscópio e examinar com aumento 10 x c ~() x (pode-
se ou nàn corar pelo lugol).
I\IÉTODO DE BAERMANN-MORAES
• tornar R a IOg de fezes ou terra;
• colocar numa gaze dobrada em quatro;
• colocar o material assim preparado num funil de vidro, previamente cheio até quase a
borda com água a 45°C;
• deixar uma hora em repouso;
• findo esse tempo. colher 5 a 7ml da água, abrindo-se a pinça que obliterava o tubo de
borracha colocado na haste do funil (ver Fig. 52,2);
• a água pode ser coletada em vidro de relógio e examinada na lupa ou coletada em tubo
para centrifugação; centrifugar a I.OOOrpm por um minuto; examinar o sedimento em
microscópio,
Este método foi modificado por Willcot & C.ura, )<)RI). da seguinte forma:
• em tuhos cônicos de po lipropileno (Parasitokit) acoplar um pequeno funil do mesmo
material, munido de uma tela no final de sua haste;
• colocar as fezes nesse funil até atingir a tela; encher o tubo cônico com água e introduzir
o funil até a haste encostar na água;
• colocar () conjunto em banho-maria por ()O minutos a 42°C;
• retirar o funil e centrifugar o tubo a 3.000rpm por cinco minutos;
• desprezar () líquido sobrcnadantc e examinar o sedimento.
As maiores vantagens desta modificação é que se trabalho com amostras padronizadas de
material e o conjunto de tubos ocupa pouco espaço,
MÉTODO DE RUGAI. Muito semelhante ao anterior e baseado no mesmo princípio do
hidro e tcrrnotropisrno. Sua execução é a seguinte:
• tomar ~ a I()g de fezes ou terra;
• colocar numa gaze dobrada em quatro e fazer uma pequena "trouxa":
colocar o material assim preparado num cálice de sedimentação cheio de água morna
(45°C) até o meio;
• deixar uma hora em repouso;
• colher no fundo do cálice as larvas porvcnturu existentes, com auxílio de uma pipeta;
• examinar na lupa ou em microscópio,
Nota: Estes dois últimos métodos são baseados no hidro e tcrrnotropisrno das larvas, que
saem do material (fezes ou terra - esta para pesquisa de fontes de contaminação humana)
migrando para a .igua morna; por gravidade, se depositam no fundo do recipiente (funil, tubo ou
c.ilicc). Para se examinar larvas de helmintos, é preciso que estejam imóveis e, para isso, costuma-
se matá-Ias colocando gotas de lugol no sedimento ou na lâmina. Para identificar as larvas, ver a
19Fig.27.3.
MÉTODO DE SHEATHER'S (ou flutuaçâo em açúcar), especial para oocistos de
coccídios:
• misturar em partes iguais fezes e solução fisiológica de NaCI;
• filtrar a suspensão em gaze dobrada em duas panes;
• recolher o filtrado em um tubo de centrífuga, completando até a metade;
• completar o tubo com solução saturada de açúcar;
• cobrir o tubo com um pedaço (Iamínula) de plástico ou papel celofane transparente e
fixá-Io com uma gominha;
• hornogcncizar hemo por agitação;
• caso ncccssar io, complete com solução saturada de açúcar o volume até atingir a borda
do tubo;
cobrir com lamínu Ia e ccntrifugar por cinco minutos ou deixar em repouso durante uma
hora;
• retirar a lamínula, colocar sobre uma lâmina e examinar com aumento 40X.
Métodos quantitativos
Os mais empregados são:
• Método de Kato modificado por Katz e cols, É muito usado para o diagnóstico e
contagem de ovos de S. mansoni, A. lumbricoides, T. trichiura e Ancylostomatidae
(neste último. o diagnóstico é possível quando as lâminas são examinadas no máximo
ate duas horas apus sua i,rçparação, pois, uma vez decorrido maior tempo, lI:; ovos se
tornarão transparentes e pouco visíveis).
• Método de Stoil-Haushecr. É muito usado para contagem de ovos de anci lostomatídeos
(N. americanus e A. duodenaley e outros Nematoda.
A seguir, descreveremos os passos que devem ser seguidos para a execução de cada um dos
métodos acima.
MÉTODO DE KATO, MODIFICADO POR KATZ E COLS. Pode ser feito a partir de
fezes frescas ou conservadas em M IF ou torrnol, mas não a partir de fezes diarréicas. Para se
executar a técnica a partir de fezes conservadas. as mesmas não devem estar Iiquctcitus e o
conservador deve ser desprezado no momento do exame.
• preparar uma solução de verdc-rnalaquita (esse produto tem a finalidade de conservar
e clarear as fezes a serem examinadas) usando-se a seguinte fórmula:
Glicerina 100ml
Água destilada 100ml
Verde-malaquita a 3% 1ml
• cortar papel celofane semipermeável (rnolhável) em pedaços de O,24mm por 30mm, e
deixá-Ios mergulhados na solução de verde-malaquita por 24 horas;
• colocar sobre um pedaço de papel higiênico, a amostra de fezes a ser examinada;
• comprimir a parte superior com um pedaço de tela metálica (marca IBRAS - São
Bcrnardo do Campo - n~ 120 - fios, urdume e trama: O,09mm. Nessa malha só passam
ovos de hclmintos e detritos menores do que eles);
• retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-Ias, com auxílio do
palito, para um cartão retangular, contendo no seu centro um orifício de 6mm de
diâmetro (as fezes são colocadas nesse orifício);
19
• ap('lS encher cornplctarncntc o orificio. retirar o cartão, cuidadosamente, deixando as
fezes sobre a lâmina de vidro:
cobrir as fezes COI11a lamínula de papel celofane, comprimindo a lâmina, após tê-Ia
invertido, contra uma folha de papel absorvente (higiênico);
• at:uaruar uma a duas horas e examinar ao microscópio (todos os campos);
• o número de ovos encontrados no csfrcgaco Iccal. multiplicado por 23, corrcspondcrá
ao número de ovos por grama de fezes.
MI.TODO DE STOLL-HAUSHEER
• utilizar frascos tipo Erlcnrncycr, estando no gargalo do mesmo indicados os níveis
correspondentes a 56 e 60 milímetros cúbicos;
• colocar no frasco solução decinormal de soda até a marca inferior, correspondente a
56cm';
• juntar fezes até que o nível do líquido atinja a marca superior correspondente a 60 em':
• introduzir no frasco algumas pérolas de vidro, fechar o recipiente com rolha, de
preferência de borracha. parafinada ou envolta em papel-alumínio. Agitar fortemente,
a fim de obter sllsl'enS;'" bastante homogênea:
• após a agitação, retirar U, 15em1 da suspensão, usando pipct« de um ccnt ímcl rr i, gf;Jdllada
em centésimos;
• depositar essa quantidade de material em lâmina, cobrindo-a com lamínula de 22 x
44mm;
• contar o número de ovos na preparação toda, empregando c chariot do microscópio e
objetiva de fraco aumento (IO x);
• calcular o número de ovos por grama de fezes, multiplicando por 100 o valor encontrado.
Ao serem colocadas as fezes no frasco, a parte do gargalo superior à marca correspondente
a (111mlprecisará permanecer limpa, para que não exista excesso de material a ser examinado.
É conveniente efetuar as agitaçôcs estando a rolha voltada para baixo e pressionada pelo dedo
indicador; assim, dificilmente as pérolas de vidro ocasionarão quebra do frasco.
Para ser obtida suspensão adequada das fezes, é recomendável, após a agitação inicial, apenas
realizar o exame depois de 12 a 24 horas, uma vez que, dessa maneira, o contato prolongado com
a sIlda será mais benéfico. Durante essa fase, o frasco precisará permanecer em geladeira ou em
111C11onde não seja elevada a temperatura ambiente, a fim de que não ocorra evolução do embrião.
Antes da retirada da quantidade de suspensão referida, decorrido o período de espera, é
necessário agitar o frasco durante algum tempo, a fim de ser conseguida amostra homogênea. A
pipctagern deverá ser praticada logo após a agitação, sendo aconselhável aspirar material da parte
central do frasco.
O exame de O,I5ml de suspensão em uma única preparação não é aconselhável. sendo melhor
depositá-Ia em duas lâminas, sob Iamínulas de 24 x 32mm; essa mesma alternativa poderá ser
executada em uma única lâmina, se assim for julgado mais conveniente.
Alguns laboratoristas preferem coletar somente 0,075ml da suspensão, contar o número de
ovos presentes e multiplicar, ao final, por 200; agem dessa forma por considerarem melhor
trabalhar com menor quantidade de material.
Convém repetir duas ou, especialmente, três vezes as contagens, sendo coletado igual
número de amostras da suspensão; assim, obtida a média respectiva, o resultado será sensivelmente
mais rigoroso.
O método em questão é usado sobretudo para avaliar quantitativamente as infecções por
ancilostomídeo. No entanto, na prática, o número de ovos de outros hclmintos nas fezes é
freqüentemente apreciado por esse processo. Inclusive, de acordo com o tipo de parasitose,
comumente é calculada a quantidade de vermes albergada pelos pacientes, levando-se em conta a
consistência das fezes, através de constantes numéricas previamente estabeleci das.
20
Lugol
A solução de lugol, indicada para corar cistos de protozoarios ou matar larvas de he\mintos
para exame microscópico, possui a seguinte fórmula:
lodo cristais 5g
lodeto de potássio 10g
Água destilada IOOml
Na l'ig. 52.4 apresentamos alguns cistos de protozoarios e ovos de helmintos mais
freqüentemente vistos no organismo humano.
Hematoxilina Férrica: Processo Rápido de Coloração
de Protozoários Intestinais
I. o material. devidamente conservado no fixador SAF, é ccntrifugado em pequenos tubos,
desprezando-se o sobrcnadantc e usando () sedimento para a coloração.
2. Uma gota do sedimento obtido no item I deve ser ernulsionada em uma pequena
quantidade de soro sangüíneo, inativado sobre uma lamínula fina. presa por uma das
hord;IS a um pedat;o de rolha de borrucha de vidro de penicilina partida ao meio; prende-
se a lamínula a este suporte, encaixando-a num entalhe que se faz na face plana do
mesmo, por meio de um bisturi ou de uma lâmina de barbear; o suporte de borrach ••tem
a finalidade de facilitar a manipulação do preparado durante os diferentes tempos de
fixação e coloração, e permitir a identificação do material, mediante a gravação de um
número numa das faces do referido fragmento de borracha; pude-se, assim, corar
amostras íccais de diferentes pacientes ao mesmo tempo.
3. Sem deixar secar os estrcgaços, que não devem ser muito espessos, colocá-Ias com a face
contendo o material sobre novo fixador SAF, dentro de uma placa de Pctri por dois a
cinco minutos.
4. Passar os cstrcgaços parao álcool a 50%; nesta passagem, que se faz prendendo o suporte
de borracha por meio de uma pinça pequena, o esfregaçoserá imerso na solução
alcoólica com a face contendo o material para cima.
5. Imergir os cstrcgaços no álcool a 70% iodado, istu é, contendo algumas gotas de tintura
do iodo, de modo a adquirir uma cor de vinho do Porto: dois minutos.
6. Transferir os cstrcgaços para o álcool a 95%; dois minutos.
7. Passar os esfregaços para os álcoois a 70% e 50%; dois minutos em cada um.
8. Lavá-Ias em água corrente; dois minutos.
9. Mordcnçá-los no alúmen de ferro a 2%, a frio: cinco minutos.
10. Lavá-Ias em água corrente: dois minutos.
11. Corá-Ias numa solução aquosa de hematoxilina a 0,5%, preparada no mínimo com 48
horas de antecedência: cinco minutos.
12. Lavá-Ias em água corrente: dois minutos.
13. Colocar os esfrcgaços em solução aquosa de ácido acético a 7%: einco minutos.
14. Lavar em água corrente: dois minutos.
15. Diferenciá-Ias no alúmen de ferro a 2%. Não é necessário o uso de microscópio para a
diferenciação: adquirindo o esfregaço uma coloração cinzento-azulada clara, a dife-
renciação ter-se-a processado satisfatoriamente.
16. Lavar os esfregaços em água corrente: cinco minutos.
17. Desidratá-Ios nos álcoois a 70%, 80%, 90% e absoluto, pernanecendo dois minutos
em cada um deles.
~
.....••
,......
-r-,
~
""'
...--- IR .
IC) .
...---
21
Clarificar (1S csfregaços no crcosoto, que poderá ser aquecido ligeiramente.
Passar os esfrcgncos pelo xilol e montá-Ias na resina sintética (bálsamo).
Obscrvacâo: Os esfregaços precisam conservar-se úmidos durante todos os tempos da
coloraçáo, desde o momento em que 5;10 feitos até a montagem final; os cstrcgacos secos devem
ser desprezados. A melhor maneira de se fazer o csfrcgaço é espalhando-se as fezes na lamínula
com auxílio de um palito.
Para facilitar, indicaremos na Tabela 52.1 os métodos mais usados e respectiva indicação:
Tabela 52.1
Indícuções clínicas e métod ••, de exames de fezes
Indicação Métodos Estruturas observáveis
Exames
de rotina
Sedimentação por ccntrifugação ou
espontânea (HP J)
Cistos. ovos e larvas
(raras)
Ascaridíasc Os mesmos acuna Ovos
Ancilostonuasc Os mesmos acima ou o Willis Ovos
Tricurose Os mesmos acima Ovos
Esquistossornosc Sedimentação por ccntrifugação ou
espontânea (HPJ) e Kato
n ':rmann-Moraes ou Rugai
Ovos
Estrongiloidíase Larvas
Eruerobiose fita gomada (Graharn) Ovos
Tcníasc Tarnização ou fita gomada (Graharn) Ovos
Giardíasc" Faust, sedimentação por ccntrifugação
ou espontânea (HPJ)
Cistos
Arncbiasc" Fezes formadas: os mesmos acima
Fezes diarrcicas: hcmatoxilina férrica
Cistos
Trofozoítos
'()~ exames dessas duas parasitoses apresentam maior positividade quando o material (fezes) é reco-
lhulo 11','.\' I',',,'.\' /"" .\'1"",(/1/(/ I" homoecncizado em um so vidro contendo conservador .
• J
22
Meios de Cultura
Freqüentemente há necessidade de se usar meios de cultura para manutenção ou mesmo
cvidcnciaçào (diagnostico) de algum parasito. Existem vários meios de cultura, sendo que cada
luborutório prefere usar um ou outro. A seguir, daremos a fórmula, o modo de preparar e a finalidade
de alguns meios mais empregados rotineiramente em parasitologia e que dão excelentes resultados.
Meio de Diarnond, 1Y75 (TYM - Trypticase- Yeast-Maltose) para cultura axênica de
tricomonadídeos:
Tryptone (Difco) ou Trypticase (BBL)
Extrato de levedo (Oifco)
Maltose (C'2H2P,,) (DIFCO)
L-cisteina, cloreto (C]H7NO;;S.HCI)
Ácido ascórbico (C(,H.oó)
Hidrogenofosfatr:> dipotássico (K,HPO.)
~iidrogenulosta,o de potássio (KHl0.)
Agar (Difco)
Água dcstilada-deionizada
20,Og
10,Og
5,Og
I,Ug
0,2g
0,8g
O,Hg
O,5g
900,Oml
pH 6,0
Dissolver os sais-tampão em 600ml de água. Acrescentar e dissolver os ingredientes
remanescentes na ordem apresentada, com exclusão do ágar; ajustar o pH em 6,0 com solução de
NaOH t N e adicionar o ágar. Para outros tricomonas estabelecer o pH entre 6,8 e 7,0. Distribuir
nos volumes requeridos e autociavar (121°C por 15 minutos). Antes do uso suplementar com 10%
(v/v) de soro de cavalo ou bovino, estéril e inativado (56°C por 30 minutos). Após, acrescentar
1.000 UI/ml de penicilina G potássica e 1mg/ml de sulfato de estreptomicina. Incubar o meio
completo durante a noite. a 37°C, para teste de esterilidade. Armazenar o meio completo à
temperatura de 4-5°C até 10 dias.
Meio de Stuart, I ()5() - Para transporte (conscrvucào temporária) de tr icomonadidcos:
Tioglicolato de sódio I,Ug
Glicerofosfato de sódio IO,Og
Cloreto de cálcio O,Ig
Azul-de-rnetileno O,002g
Ágar (Difco) 2,Og
Água destilada q.s.p. 1.000,01111
pH = 7,3
23
Dissolver 0S Ingredientes em I.OOOml de água e distribuir em tubos com rosca (screw-
Cl/rpl'Ô) I () x IOOmm. Pyrcx n 91\25. na razão de 7ml por tubo.
Autoclavar (121 "C por 15 minutos). Deixar os tuhos solidificarem na posição vertical. O
meio xolidi íicado moxt r«, f.'.cr:dmenle. uma zonn azul de aerohiose até 1/3 da altura do meio.
Quando csta zona ultrapassar mais da metade do meio. ele nâo deve ser utilizado rara os fins
prc\ istos.
A incorporação do material a examinar ao substrato se realiza através de swabs, estéreis e
secos. preparados com algodão não absorvente ou de poliéster, previamente mergulhado em
solução-tampão de fosfato de Sórenscn 0.067 M, pH 7,4.
Os swab são introduzidos no meio de transporte até a metade de seu tamanho. Cs tubos são
fechados hermeticamente e conservados sob refrigeração (4-5°C) até o momento do exame
microscópico e da inoculacáo nos meios de cultura.
Solução de álcool polivinílico f'ixador, 1949 (APV) - Para fixar protozoários intestinais e
tricornonadidcos:
Ácool pol ivinílico, Elvanol 90-25. pó
Solução aquosa saturada de HgCI~
Acido acético glacial
Glicerina
5,Og
93,5ml
S,Oml
1,5ml
Meio de NNN
Essas letras representam as iniciais de McNeal, Novy e Nicolle, seus autores. Muito utili-
Z;IU" para isolamento c rnnnutcncâo de espécies do gênero Leishmania ou Trypanosona cruzi,
Fórmula:
Ágar
N:ICI
fi ,O destilada
14g
6g
()(}Oml
• colocar esses ingredientes num balão e aquecer até a fusão do ágar;
distribuir SOml dessa solução em Erlenmeyer e esterilizar a 1200e por 20/30 minutos em
autoclave:
• adicionar 20% de sangue humano ou de coelho (desfibrinado) e colhido asscpticarnente:
• manter nesses frascos (1U distrihuir em tuhos de ensaio ou garrafas de Roux. e guardar
em geladeira;
• no momento do uso, adicionar a "fase líquida", que é assim preparada:
• para l.eishmania: adicionar alguns ml de salina 0.75%;
para T. cruzi: adicionar alguns ml de água pcptonada. que é assim preparada:
Pcptona
NaCl
HP destilada
IOg
Sg
1.000ml
Acertar o pH para 7,2 a 7,4 c em seguida autoclavar a 120°C durante 20/30 minutos.
• feito o inoculo do material, manter nas seguintes temperaturas:
Leishmania
T. cruzi
• repiques são feitos de acordo com o comportamento da cultura.
24
Meio de UT
Essas letras representam os principais ingredientes do meio, ou seja: Liver Infusion Triptose.
Muito utilizado para isolamento e manutenção de T. cruzi ou espécies do gênero Lcishmania
h'nmula:
Solução I
NaCI
KCI
Na,HPO,
4,Og
O,4g
8,Og
Solução 2
Triptose
Infuso de fígado(Difco)
HP destilada
5,Og
5,Og
880ml
Como preparar:
• dissolver o infuso de fígado em 200ml da HzO destilada, em banho-mana ou chama
de gás;
• filtrar em algodão ainda quente;
• recolher o filtrado e juntar com os ingredientes das soluções I e 2;
• acertar o pH entre 7,2 e 7,4;
• acrcsc-r, 'Ir 100ml (10%) de soro bovino;
• inativar a 68°C durante uma hora, agitando o meio de 5 em 5 minutos;
• acrescentar 20ml (2%) de hemoglobina (que é assim preparada: coletar I litro de san-
gue de bovino, deixar em repouso, retirar o soro e suspender as hernacias em salina;
U':lItlllll!;;;lr " 2.()IHlrl'l1l dur.uuc dois miuutn», n-xxuspcndcr ('01 salina c ccntrifugar
novamente; colher !Oml de papa de hernáciase colocar em IUUml de agua destilada):
• acrescentar antibióticos:
- penicilina li potássica: ZUU-SUOU/ml: adicionar 5011 de água destilada em um frasco
de I.OOO.OOOU; utilizar 2,4ml dessa solução para cada litro do meio. (Por ter
aparecido resistência de bactérias e para evitar contaminação por fungo, a penicili-
na pode ser substituída pela Fungisona - Anfotericin B -, que é assim utilizada:
2 a 5 microgramas do produto por ml do meio.)
- cstreptornicina: 50-IOOmg/ml: acrescentar 5ml de água destilada em um frasco de
I g, retirar 0,5ml desta solução para cada litro do meio.
• filtrar em Zcits e distribuir a desejar.
Coprocultura
!'ara se realizar a cultura de Iczcs para pesquisa de larvas de hclrnintos, pr incipalmcutc
Ancylostomatidae ou Strongyloides stcrcoralis, podemos usar um dos métodos abaixo:
Método de Loos
• misturar partes iguais de fezes e carvão animal ou carvão vegetal, triturados em grãos
pequenos (tamanho de arroz);
• umedecer ligeiramente (e também nos dias seguintes);
• colocar a mistura em placas de Petri e deixar em repouso à temperatura de 25°C;
• dois a cinco dias após. recolher as larvas pelos processos de Bucrrnann-Morucs ou de
Rugai (Capitulo 52. Figs. 52.2 e 52.3).
Método de Brumpt
• espalhar as fezes em camada sobre papel de filtro colocado no fundo do uma placa de
Petri.
• umedecer ligeiramente (c nos dias seguintes também).
• dois a cinco dias após. recolher as larvas pelos processos de Bacmann-Morncs ou de
Rugai (Capítulo 52. Figs. 52.2 e 52.3).
Lcrvo tlfestCl1te de
Ancylostoma duodenole
(3' "'00101
Larva Infestonte de
Necotor omenconus
(YH'ÓQIO)
O#Ilolhtl do toca06101176 do boca
Otlfalhtl <lb nltlsflfloOtIlalhtI do int.slina
o.tolhtl do cauda
fi do lJofi'lho
25
FI~. 53.1 - Detalhes de larvas infcctantes de N. americanus c A. duodenale para indcntificaçâo especifica (foto
filentilmente cedida por Lúcia de Laccrda Correa ct aI. Rcv. Inst. Adolpho Lutz; 39 (2): 145, 1979).
Método de Haruda & Mori
• retirar O..'ig de fezes frescas depositadas em "urinol" seco e estéril;
• cortar uma tira de papel de filtro medindo 3cm de largura por IScm do comprimento,
dobrada longitudinalmente ao meio;
• com um palito estéril espalhar as fezes no papel de filtro, deixando livre o terço inferior
do papel;
• introduzir a tira de papel (com o terço limpo para baixo) em um tubo de ensaio de
2,0 x 20,Ocm contendo 7ml de água destilada (o nível dessa água não deverá atingir as
fezes espalhadas na tira de papel);
• arrolhar o tubo com rolha de algodão e deixar em repouso na vertical em temperatura
ambiente (24-2HOC) durante 10 a 14 dias;
• findo esse tempo, examinar a água do fundo do tubo para ver se já existem larvas;
para m.uar a~ l.uvu-, aquccer " tuh" em hanho-rnar ia a 50°(' durante 15 minutos ou
acrescentar gotas de lugol;
• para rccol her as larvas, pode-se simplesmente pipetar o sedimento do tubo ou centrifugar
() conte Lido do mesmo; examinar ao microscópio com aumento IOX e 40X,
CRIAÇÃO DE INSETOS
Alguns insetos são de fácil criação em laboratório e às vezes necessários para estudos e
pcsqu isas. Daremos a seguir a técnica para criar duas espécies de díptcros muito comuns em nosso
meio, e uma para criar barbeiros.
r
26
E
o
O~
A
B c
Fig. 53.2 - a) Gaiola para criação de M. domestica e Culiaidae; b) suporte de papelão; c) cristulizador com suporte (b)
dentro, preparado para crtar "barbeiros ".
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27
• iniciar a coleção a partir de insetos adultos obtidos em outro laboratório especializado
ou no campo; neste último caso há necessidade de cuidado especial, em vista do inseto
poder estar infectado e eliminar o Trypanosoma cruzi em suas fezes ou urina;
• com as mãos protegidas por Iuvas e usando pinças longas, colher os insetos colocando
machos c fêmeas (extremidade posterior do abdome pontuda) juntos (Figs. 36.1 e 36.4);
• alirnc nta-Ios semanalmente, oferecendo pombo ou galinha previamente amarrados; a
ave é colocada deitada sobre a cobertura de pano, retirando-se algumas penas da coxa
e do tlanco exposto. para facilitar a hernatotagia (os "barbeiros" se alimentarão,
introduzindo a prosbóscida através do pano, até atingir a pele da ave);
• deixar em repouso por 30 a 60 minutos em local quieto e preferentemente escuro;
• manter os cristatizudorcs em temperatura ambiente, ou melhor ainda. em temperatura
entre 24-28°C e umidade relativa do ar entre 60-70%;
• rotular os eristalizadores com o nome da espécie, origem e data do início da criação;
uma a duas vezes por semana recolher os ovos em cristalizadores, deixando-os em
ambiente quieto e escuro até a eclosão (período de incubação é de IS a 20 dias);
• de ovo até adulto os "barbeiros" passam pelas seguintes fases: ovo-eclosão-ninfa
l-rnuda-ninta 2-muda-ninfa 3-muda-ninfa 4-muda-ninfa S-muda-adulto; esse ciclo
demora em média seis a oito meses, sendo que o inseto adulto pode viver por mais de
um anuo
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)~
.J
Fig. 21.1 As amebas que r~rasitam o intestino humano
A. Eruamoeba histoiytica, forma trofozoítica pequena
(minuta) e não-parogéníca. B. E. histolytica, forma troto-
zoítica grande (magna) cuja atividade patogênica é carac-
terizada pela presença de hemácias fagocitadas. em seu
ciroplasrna. C. Entamoeba coli, trofozoíta. D e E. Enta-
moeba hartmanni, trofozoítas. F e G. Endolimax nona
trofozoítas. H. Dierüamoeba [ragilis. I. Iodamoeb a
bütscnlii. 1. Cisto maduro de E. coli. K. Cisto de Endo-
limax nona. L. Cisto de E. hartmanni. M. Cisto maduro
de E. histolvtica. N. Cisto jovem de E. histolytica. ()
Cisto de Iodamoeba butschlii.
A
B
o
F
H
28
Balantídíum Calí e Balantidíase
INTRODUÇÃO
A balantidíase é uma infecção do grosso intestino que, em
suas formas mais típicas. produz diarréia ou disenteria, muito seme-
lhante clinicamente à amebíase. Seu agente etiológico é um proto-
zoário ciliado - Balantidium coli - pertencente à ordem Trichosto-
matida, da subclasse Holotrichia (veja o Capo 9).
Ainda que apresente distribuição geográfica cosmopolita, os
casos humanos são observados raramente e se relacionam em geral
com a presença de porcos infectados .
.",""
Fig. 30.1 Balantidium coli é o maior dos protozoários que parasitam o
homem. É diagnosticado raramente em casos de disenteria, sendo encon-
trado freqüentemente no intestino do porco. (Segundo Wcnyon. 1926.)
B
Fi!:. 20.1 Flageladll' LIas cavidades naturais do homem. A. Tich omonüs
vaginalis, parasito que habita o aparelho geniturinário. B. Trichomonas
tenax, da cavidade bucal. C. Pentatrichomonas hominis que. como todos
os demais enumerados a seguir. é encontrado no intestino. D. Giardia lam-
blia. trofozoíta. E. Cisto de Giardia. F. Chilomastix mesnili. trofozoíta.
G. Cisto de Chilomastix, H. Retonamonas intestinalis. I. Enreromonas ho-
minis.
Fig. 20.9 População de G. intesunalis cultivada sobre um substrato de colá-
geno, onde os trofozoítas se fixam por meio do disco ventral. Foto de
Fátima Knaippe.
29
-:\2' \
:.\; .
Fig. 20.2 Ultra-estrutura de Trichomonas (esquema baseado em dados de
microscopia eletrônica). Os flagelos estão seccionados e seus blefaroplastos
são envolvidos pela peita: à esquerda do núcleo vê-se a costa, cercada
de hídrogenossornos. e à direita o aparelho de Golgi com duas fibras paraba-
sais: o axóstilo percorre o eixo celular. fazendo saliência no extremo inferior.
Carboidrato
I
2NAO]\
2 NAOH __ . I GOP GTP
FOSloeno,lporuva,o- __oU -O.a'acelalo
AOP ~ i cC ItNAOH
ATP --1' CO2 4\ NAO
Aceta:de;do--- - - _.-p;ru~ato - -L--Malato
; I r I
~-NAOPH-----y x---..I NAOPH NAOP
9i'--NAOP ~XH-'T
I r-\
Etanol Acetil-CoA CoA
AOP~~
ATP~7
Aeetato
Fig. 20.10 Metabolismo dos carboidratos em Giardia intestinalis, dando co-
mo produtos finais etanol, ácido acético e CO •. As enzimas envolvidas
são: I, glicolíticas; 2, carboxiquinasedo fosfoenolpiruvato; 3, piruvatoqui-
nase; 4 e 5, desidrogenase málica; 6, piruvato-sintase; 7, acetil Co. A sintase:
8, desidrogenase: e 9, õxído-redutase.
30
Fig. 24.2 Evoluçao ele um CUCUelIU.A. Ciclo a"cxuaelu t csqurzogómco) que se repele cerro numero ele vezes. segundo a espécie. B. Microgamelogênese
com formação dos garnetas masculinos. C. Macrogarnetogenese e fecundação do garneta feminino por um microgameta. dando origem ao oocisto.
D. Formação dos esporozoúas que se dá geralmenle no meio exterior. O processo de reprodução sexuado (de B a D) constitui a fase de multiplicação
esporogonica. E. Libertação dos esporozouas. no organismo de um novo hosoedeiro.
A B
o
c
E
Fig. 24.3 As trés figuras superiores representam oocislOs de Isospora belli,
em diferentes estádios de maturação. A. Na fase inicial, com um só esporo-
blasto. B. Em seguida, com dois esporoblastos que já produziram cada
qual seus esporocistos. C. Oocisto maduro. C?m dois esporocistos. contendo
quatro esporozoítas cada, além de granulaçoes do corpo residual. As duas
figuras inferiores representam formas infectan~es de Sarcocystis hominis.
D. Dois esporocistos maduros e ainda envolvidos pela frágil membrana
do oocisto. E. Um esporocisto isolado. depois da ruptura do OOClstO.
Giardia lamblia
CISTO
31
DE FREI/TE DE PERFlL\
FORMA VEGETATIVA
Trichomonas
Balantidium coli
Schistosoma mansom
T_ hominis T. v4qin41is
•v.. '. .\;~.. --- ,'./-. ,, "CISTO
FORMA VEGETATIVA
Tenia saginata
ôvo
ÔVO
Tenia sotiurn
ÔVO
CABECA
ANEL GRÁVIOOCABEÇA
Hymenolepis nana
32
•'~.---..... qQ~~~:,• 1 -.,i~,·~·.- ...:
ôvo
stronovtoides stercoralis
~ PARTENOGENÉTlCA PARASITA
ovos
Enterobius vermículares
ôvo
Ascaris lumbricoides
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Trichocephalus trichiuras
ôvo
Necator americanus
Ó~~±§,e~
~
I\ncylostoma duodenale
ovos
33
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ó~=,~
~~
LARVAS
ovos
ANCILOSTOMIDEOS STRO NGYLOIOES
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Ve:ST. BUCAL CAUDA VE:ST. BUCAL CAUDA
---. 4"el polar
co"óide
~ Pelíeulo
---. _ t.IIierotúbLlIO
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subpelieulor
Mieronemo
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Ropirio
+-,
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---... Apor~l"o de GOI9;
.-...
NúcleO
--..,
NLlCIIÍOIO
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Mitoeô"clrio
FIg.16.1- Esquema de um protozoârio (Toxoplasma gondii) representante do filoApicomplexa, caracterizado por: anel
poIDr,cOfl6itJ" ",icrolÚbulo subpe/icular, micronema e roptrias (esquema gentilmente fornecido pelo Dr. Levine, através
do Prof. José Divino Limo).
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Fig. 31.5 Ovos de diferentes espécies de Schistosoma. A. S. mansoni. B.
s. naematobium. C 5. japonicum. D. s. intercatatum, E. S. bovis.
Fig. 32.8 Representação esquemática de ovo. miracídio e cercária de Schis-
tosoma munsont.
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Fig. 38.1 Taenia saginata (representação esquernatica). A. Segmentos do estrobilo onde se vc: u. escolex: h. coto: c. proglores jovens; d, proglotes
maduras; e. proglotes grávidas. a última das quais se desprende por apólise. B. Escólex com suas quatro ventosas. C. Organização de uma proglote
madura; a. canal osrnorregulador: b, útero; c. testículos; d. canal deferente; e. bolsa do cirro ; J, poro genital: g. vagina: h. ovário: i. ootipo: j, glândula
vitelina, D. Proglote grávida. com suas ramificações uterinas numerosas e dicotórnicas.
fil:. ~8.2 Tarnia saginata. Desenho do escólex. tal como se vê à microscopia
eletrónica de varredura. com quatro ventosas e sem rastro ou acúleos.
FIg. 38.6 TQ~n;Qsolium (dese h . . . -
Acúleos da primeira e da segU:d:~ e:?uemcatolCOS). A. Escólex armado. B.
Ia as. . vo. D. Anel grávida.
T. aOlium
36
T. ao;inoto
P.Q.
e.m.
p.g.
Fig. 22.2 _ Características para identificação das tênias humanas: T. solium: escolex com rastro armado; proglote
gravida. com ramificações uterinas pouco numerosas c dendriticas; T. saginata: escólex sem rostro; progiote grávida, com
muitas ramificações utcrinas c dicotámicas. p.g. -poro genital; e.m. -s-esjincter musculoso, sá encontrado em T. saginata.
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-4
• c
.11l.22.3 - Cysticercus cellulosae (larva da T. solium}: A -s-normal. nos tecidos; B -s-dcsenvaginado (notar ventosas e
rostroarmado}; C -ovos da Taenia sp (ígualporo T. solium eT. saginataj, I -rastro; 2 -ventosa; 3 -pescoço ou colo;
4 - vcsicula .
DESENVOLVIMENTO E ESTRUTURA DO CISTICERCO
37
Fig. 39.1 Esquemas representando a forma larvária de Taenia solium (tarn-
bém denominada Cysticercus cellulosae}. A. Vesícula translúcida, que per-
mite divisar no interior o receptaculum capitis. B. Corte longitudinal da
vesícula passando pelo receptaculum (a) e pelo escõlex invaginado (b); as
"vilosidades" (c) correspordem às pregas formadas pelo tegumento enru-
gado do escólex e do colo: um líquido hialino (d) preenche o espaço re 'tante
sob a parede do cistlcerco (e). C. Cisticerco desinvaginado em que se vê,
por transparência, o receptaculum capins (a) e, externamente, o escõlex
(b) e o colo (e).
Fig. 39.3 Cistícercose cerebral: a localização aleatória dos cisticereos no
sistema nervoso central, provocando fenômenos compressivos, obstrutívos
e inflamatórios, explica a variedade de quadros clínicos observados.
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HIMENOLEPiASES. DIFILOBOTRÍASE E OUTRAS CESTOmÍASES
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Fig. 41.1 A. Desenho de exemplar adulto de Hymenolepis nona
cujo tamanho varia entre 2 e 10 em de compri.nento. 8. Escólex
de H. nona. C. Escólex de H. diminuta. D. Esco'ex de Dipylidium
caninum. E. ovo de H. nona, com seus filamentos polares. F. Ovo
de H. diminuta, sem filamentos. G. Saco ovígero de Dipylidium.
H, Representação esquemãtica de uma proglote madura de Hyme-
nolepsis: a. ovário; b, glândula vitelina; c. testfculo; d, canal defe-
rente; e, bolsa do cirro; f, poro genital; g, vagina; h, receptáculo
seminal.
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c
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I
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I
Fig. ZJ.l- Echinococcus granuíosus -ti - Verme aauuo: tI-roslro armado; Y -ventosas; Pj -proglole jovem; PIII
- proglote madura; Pg - proglote grávida; 8 - Cisto hidático ou hidâsid« (medindo cerca de 5cm de diám~l,ol
apresentando: a -i-membrana adventícia (produzida pelo órgão parasisado); b -s-membrana anista; c -memb,o""
prollgcra; d -s-vesicula prollgera; e -s-escôlex (ou protoescoleces}; ala -s-areia hidâtica.
B
39
Fig. 43.2 Extremidade anterior de Ascaris lumbricoides, vista em micros-
copia eletrônica de varredura. Em ..vno da boca (M), encontr .rn-se três
lábios providos de papilas sensorial> \andicadas pelas flechas). (Segundo
Ishii. Habe & Wakatsuki. 1972.)
c
" Fig. 43.1 Ascaris lumbricoides. A. Fêmea. com o extremo posterior retilí-
neo. B. Macho, com a cauda enrolada ventralmente.
Fig. 43.6 Ovo de Ascaris, visto à microscopia eletrônica de varredura. Ele
mede. em média, 45 micrômetros de largura por 60 de comprimento. (Segun-
do Ishii, Habe & Hataba, 1974.)
e,
9
Fig. 43.3 Corte transversal esquemático de um Ascaris. ao nível da região
esofagiana. Na parede do corpo vêem-se: a. cutícula; b, hipoderma; c.
cordão dorsal; d, campos musculares; e. cordão lateral; f, canal excretor;
K.feixe nervoso: h. miocélula com prolongamento que alcança o feixe nervo-
so no cordão ventral; i, cordão ventral; j, feixe nervoso ventral. Internamente
está a faringe musculosa (k). com sua luz trirradiada, envolvida pelo líquido
do pseudoceloma (I). (Redesenhado, segundo Levine - Nematode Parasites
of Domestic Animais and of Man, 1968.)
A
40
Fig. 43.7 Ovos e larvas de Ascaris /umbricoides. A. Ovo recém-eliminado.B. Ovo embrionado no meio exterior. C. Ovo infértil. D. Eclosão da
larva infestante, no tubo digestivo do hospedeiro. E. Larva isolada do pulmão.
c
FI!:.31.1- Trichuris trichiura:A -fêmea; B -macho; C -ovo:' a -s-ãnus; b -útero; c =-ovario; d -vagina; c
, fil" 'f canal dcicrmte: "--e'plculo; h -s-cloaca: I-resllcu/o (adaptado de Rey, /973).'ormRc , I,ormr, -- fi 11. , ('t •
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Fig. 27.2 - Ciclo biológico de Ancylostomatidac de humanos: a) ovo recém-eliminado com as fezes; b) ovo com larva de
primeiro estádio; c) cc/osão de larva de primeiro estádio; d) larva de primeiro estádio. com tamanho original de JOOJun;
c) formação da larva de segundo estádio, com tamanho original de 4001U7!; f) larva de terceiro cstâdio ou infcctante, com
tamanho original de 6001U7!. As linhas tracejadas e selas indicam as vias de penetração da larva infectamc: I)
Transcutánca: circulação, cava, coração, pulmão, traquéia; [atinge, laringe (ingcstão), csôfago. estômago e intestino
delgado; 2> Oral: ingestâo. CSÔfa!{D, cstómaeo c intestino delgado.
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Fig. 46.2 Extremidade anterior dos ancilostomídeos. A. Cápsula bucal vista lateralmente. a. Abertura da cápsula: b, dente ventral; C. espessamente
cuticular da parede da cápsula; d, lanceta; e, dente dorsal (canal da glândula esofagiana dorsal): [, superfície dorsal; g, superfície ventral; h, esófago.
B. Ancylostoma duodenale. C. Necator americanus. D. Ancylostoma braziliense. E. A, caninum.
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Flg. 46.1 Organização geral dos ancilostomídcos. A. Macho. li. Fêmea.
C. Ovos. Localização dos órgãos: a. cápsula bucal; b, glândulas cefãlicas:
c. testículos; d, vesfcula seminal; e. canal ejaculador; f. espículos; g. bolsa
copuladora; h. faringe; i. útero;;. ovário; k, intestino; I. reto e ânus.
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vis(,d; D -s-lorva rabditôidc de Strongyloides stercoralis, .1-vestlbu/o bucal pequeno (211m);4 -primórdio genital de vida livre; 4) ovos; 5) larva robdisáide; 6) larva fifurióide ill'"ctllll'" {proveniente do ciclo direto c do indsrct» (lU
ir vi,~(vd; C -larva filar;ó;de de Ancylostomattdae: 5 -s-prcsença de bainha; 6 -cauda ponteaguda; D =Iarva liIarióide scxuado]; 7) penetração ativa 11/1 pele, seguindo es:.'~trajeto: pele"su"glle·cumçâ"·I'/I/l11ú",·f"rill"~e·Jl'glwidils-illl"";'IC'·
l/C S. stercoralis. 7 -('sô/ago longo [quase metade do comprimento da larva); 8 -cauda bifurcado. [êmea s partcnogcnéticas adultas (a). No intestino delgado, as [êmcas partenogrnéticus iniciam a eliminaçà •• d" ,1\'(1)
Iarvadu: ••cerra de um mês "pós li ill/'·(""·üo.
~
~
44
Fig. 57.9 Dermatobia hominis e a
transmissão do berne. A. O inseto
adulto. B. Culicíneo sobre o qual
a Derrnatobia fixou seus ovos. ven-
do-se abaixo um dos ovos opercu-
lados. com maior aumento. C. Lar-
va da Dermatobia ou berne. desen-
volvendo-se na pele de um pacien-
te. O gado constitui a principal fon-
te para a existência dessa miiase
tipicamente rural.
Fig. 57.10 A. Penca de ovos (P) de Dermaiobia hominis colados
ao abdome de uma mosca hematófaga (Neivamvia], vendo-se al-
guns (e) com o opérculo aberto e a larva projetando-se para (ora
(segundo Neiva e Gomes). B. Larvas de Dermatobia de primeiro
e último estádios. que correspondem ao berne.
Fig. 57.5 Ciclo vital de uma mosca. ai Ovos, que segundo as condições
ambientais eclodem dentro de 8 horas ou alguns dias; b} a larva alimenta-se
de detritos variados e sofre três mudas antes de pu par. por volta do quarto
ou quinto dia: c) a pupa (no interior do pupário) permanece enterrada
no solo por igual tempo, dando por fim nascimento à forma alada adulta;
d} inseto adulto.
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	Scan_Doc0005.pdf
	Scan_Doc0001.pdf