métodos intrumentais de análise

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INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE FARMÁCIA 
ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS 
DISCIPLINA: 
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
	Curso: FARMÁCIA
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
Análise em Espectrofotômetro I 
Espectro de Absorção e Análise de Amostra Desconhecida
	AULA
1
	MATERIAIS
	QUANTIDADE (BANCADA)
	Papel milimetrado
	1 folha
	Água Destilada
	1 frasco (Pisseta)
	Alaranjado de Metila (4,0 mg.L-1)
	1 frasco (10 mL)
	Amostra com teor desconhecido de Alaranjado de Metila
(verificar o teor a ser utilizado com o professor sendo recomendado concentração entre 1 mg/L e 5 mg/L
	1 frasco (10 mL)
	Pipeta Automática 1000 L
	1 unidade
	Recipiente para descarte de líquido
	1 frasco
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Espectrofotômetro
	1 aparelho para cada 2 bancadas 
	Papel Absorvente
	1 unidade
	Cubeta de Quartzo ou Vidro
	1 unidades para cada aparelho
OBJETIVO:
Efetuar varredura de comprimento de onda no espectro visível para análise do alaranjado de metila por espectrofotometria. Determinar o comprimento de onda a ser empregado em uma análise espectrofotométrica do alaranjado de metila.
PROCEDIMENTO:
PARTE I: Determinação do Espectro de Absorção
Ajustar o comprimento de onda no aparelho para = 440 nm.
Adicionar água destilada à cubeta de quartzo tomando cuidado para que o volume adicionado permita a passagem pela amostra do feixe de luz emitido no interior do aparelho.
Limpar a cubeta com papel absorvente.
Zerar o aparelho.
Adicionar solução de alaranjado de metila (4,0 mg.L-1) à cubeta de quartzo.
Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho.
Ajustar novo comprimento de onda no aparelho e repetir os itens 2 a 6.
Completar a tabela com os valores de absorbância obtidos em cada comprimento de onda ajustado no aparelho.
Tabela 1: Varredura de absorbância em diferentes comprimentos de onda para análise de solução de alaranjado de metila 4,0 mg.L-1.
	(nm)
	A (nm)
	440
	
	450
	
	460
	
	470
	
	480
	
	490
	
	500
	
	520
	
Obter o pico de absorbância para análise de solução de alaranjado de metila por espectrofotometria. nm
Discussão: Montar o gráfico que represente o espectro de absorção do alaranjado de metila tendo a absorbância (A) como ordenada e comprimento de onda () como abscissa. Marcar o ponto onde ocorreu o pico de absorbância e indicar o comprimento de onda a ele relacionado. 
PARTE II: Determinação da Absorbância de Amostras de concentração desconhecida de Alaranjado de Metila
Ajustar o comprimento de onda correspondente ao pico de absorção para o Alaranjado de Metila (Max) (Definido após análise dos resultados da Parte I).
Adicionar água destilada à cubeta tomando cuidado para que o volume adicionado permita a passagem pela amostra do feixe de luz emitido no interior do aparelho.
Limpar a cubeta com papel absorvente.
Zerar o aparelho.
Adicionar solução de alaranjado de metila (concentração desconhecida) à cubeta de quartzo.
Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho.
 Abs
	Curso: FARMÁCIA
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
Análise em Espectrofotômetro II
Montagem de Curva de Calibração para Análise de Alaranjado de Metila
	AULA
2
	MATERIAIS
	QUANTIDADE (BANCADA)
	Papel Milimetrado
	1 folha
	Água Destilada
	1 frasco (20 mL)
	Alaranjado de Metila (1,0 mg.L-1; 3,0 mg.L-1; 5,0 mg.L-1; 8,0 mg.L-1; 10 mg.L-1) (Preparado pelo técnico)
	1 frasco (20 mL)
	Recipiente para descarte de líquido
	1 frasco
	Micropipeta Automática (1000 L)
	1 unidade
	Ponteiras de 1000 L
	10 unidades
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Espectrofotômetro
	1 aparelho para cada 2 bancadas 
	Papel Absorvente
	1 unidade
	Cubeta de Plástico ou Vidro
	1 unidade para cada aparelho
OBJETIVO:
Montagem da Curva de Calibração (concentração versus absorbância) para análise do alaranjado de metila por espectrofotometria.
PROCEDIMENTO:
Ajustar o comprimento de onda no aparelho para = 460 nm.
Adicionar água destilada à cubeta de quartzo (branco). 
 Limpar a cubeta com papel absorvente.
 Zerar o aparelho.
 Com auxílio da micropipeta automática, adicionar as soluções preparadas, uma a uma, à cubeta e efetuar a leitura no aparelho. Lavar a cubeta com água destilada entre cada solução padrão analisada.
 Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho.
 Completar a tabela com os valores de absorbância obtidos.
OBS: Descartar as amostras lidas no aparelho em frasco de descarte adequado.
Tabela: Resultados de Absorbância (A) para as diferentes concentrações de Alaranjado de Metila
	Concentração (mg/L)
	Abs
	1,0
	
	2,5
	
	5,0
	
	8,0
	
	10,0
	
OBSERVAÇÃO: MONTAGEM DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E EQUAÇÃO DA RETA:
Em papel milimetrado, montar a curva de calibração Abs Vs. Concentração. 
DEMONSTRAÇÃO DO PROFESSOR: O professor irá escolher os dados de um dos grupos e utilizar software apropriado para demonstrar a obtenção da equação da reta e coeficiente de correlação (r) correspondentes à curva de calibração. 
Equação de Reta (Calibração): 
Abs = _______ x [Concentração] + ______
Análise do coeficiente de correlação (r): o valor calculado deverá estar próximo a 1,000 que seria o indicativo de boa correlação entre a absorbância lida no aparelho e a concentração da substância na amostra 
Com a equação de reta correspondente à calibração para a dosagem de Alaranjado de Metila efetuar o cálculo do teor (concentração) desta molécula que estava presente na amostra desconhecida analisada na prática 1 (Parte II). 
	Curso: FARMÁCIA
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
Análise por Cromatografia em Camada Delgada I 
Análise Cromatográfica de Analgésicos
	AULA
3
	MATERIAIS
	Pinça metálica
	Bastão de vidro
	Capilares
	Placa de petri
	Acetato de Etila
	Ácido Acético Glacial
	Placa de Sílica
	3 béqueres de 50 mL 
	Almofariz
	EQUIPAMENTOS
	
1 Cuba Cromatográfica a cada 3 grupos
	1 Banho de Aquecimento (40°C) a cada 3 grupos
	Lâmpada de UV 
	Reagentes
	50 mL Solução de Extração (25 partes de acetato de etila, 1 parte de etanol e 1 parte de ácido acético) por grupo
	Ácido Acetilsalicílico, Paracetamol e Ibuprofeno (ou Dipirona) puros (máteria-primas) – 100 mg de cada substância
OBJETIVO:
Avaliar a separação de princípios ativos de ação analgésica pela técnica da CCD. Estudar o emprego de técnicas cromatográficas para separação e análise de substâncias em função de sua estrutura química e do fenômeno de adsorção cromatográfica. Serão analisadas amostras de aspirina, paracetamol e coristina D.
PROCEDIMENTO:
Parte 1: Preparação das Amostras de Analgésicos (PREPARADO PELO TÉCNICO)
Transferir para béquer, previamente, a amostra da substância a ser analisada.
Repetir o procedimento para as outras duas amostras.
EM CAPELA: A cada béquer, adicionar 10 mL de solução de extração.
Com auxílio de bastão de vidro, efetuar agitação.
Levar os béqueres a banho de água e deixar por 5 minutos em aquecimento moderado (40°C).
Aguardar a decantação das partículas insolúveis.
PARTE 2: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA:
O técnico deverá deixar preparada uma cuba contendo a fase móvel (acetato de etila com 0,5% de ácido acético glacial). Deverá esperar tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. Manter a cuba coberta até o momento da análise.
O aluno deverá iniciar o seguinte procedimento:
Em uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm) efetue duas marcações (cerca de 1 a 2 cm da extremidade) indicando o ponto de aplicação da amostra e o ponto onde se indicará o final da corrida.
Utilizando um capilar, aplique duas porções de cada extrato sobre uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm) a 1,0 cm de uma das extremidades.
Colocar, cuidadosamente, a placa de sílica na cuba, evitando que o ponto de aplicaçãoda amostra mergulhe no solvente.
Aguardar até que o solvente atinja, cerca de, 0,5 cm do topo da placa, remover a placa e marcar a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel).
Para que seja possível a visualização na placa de sílica é necessário levar até uma lâmpada de UV (utilizar óculos de segurança e obedecer a todas as regras de segurança quanto ao uso deste tipo de lâmpada passadas pelo professor no momento da visualização).
Marcar, com auxílio de lápis, o ponto visualizado para cada analgésico após a corrida na placa de sílica. 
Com auxílio de régua, determinar a distância de cada ponto e calcular os valores de Rf.
Analise o resultado da CCD e indique qual a molécula presente em cada mancha cromatográfica obtida.
Relacione a molécula ao valor de Rf calculado para cada mancha:
	Molécula
	Rf
	Ibuprofeno
	
	Paracetamol
	
	Ácido Acetilsalicílico
	
	Dipirona
	
Principais Princípios Ativos presentes nos Analgésicos:
Acetaminofeno (Paracetamol)
Ácido Acetilsalicílico
Molécula de Dipirona Sódica
	Curso: FARMÁCIA
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análise
Análise por Cromatografia em Coluna de Troca Iônica 
Hemoglobina Glicada em Amostra de Sangue
	AULA
4
	MATERIAIS POR BANCADA
	Coluna de Separação para Hb- Glicada (Kit Labtest) – 1 unidade
	Tubos de Ensaio Grandes – 3 unidades
	Micropipeta (1000 microlitros) – 1 unidade
	Micropipeta (10 – 100 microlitros, ou equivalente) – 1 unidade.
	Ponteiras de 1000 microlitros.
	Ponteiras de 100 microlitros, ou equivalente.
	EQUIPAMENTOS (A CADA 2 BANCADAS)
	Espectrofotômetro ( = 415 nm)
	Cubeta de Quartzo – 1 unidade por equipamento
	Reagentes por BANCADA
	Água Destilada
	Amostra de Hemolisado - 100 microlitros (fracionado)
	Tampão de Separação (Frasco 1 – Kit Labtest) - 5,0 mL (fracionado)
OBJETIVO:
Avaliar a separação das frações de hemoglobina glicada e normal em coluna de troca iônica. Determinar a porcentagem de hemoglobina glicada em amostra de sangue.
PROCEDIMENTO:
Parte 1: PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DE HEMOLISADO (Técnico do Laboratório)
Pipetar em tubo de ensaio, 1,0 mL de amostra de sangue total (coletado com EDTA) bem homogeneizado.
Centrifugar a 2000 RPM por 5 minutos. Retirar o plasma sem ressuspender às hemácias.
Adicionar 3,0 mL de NaCl (0,85%), homogeneizando o tubo.
Centrifugar e remover o sobrenadante sem ressuspender às hemácias. 
Ressuspender as hemácias em 3,0 mL de NaCl (0,85%). Centrifugar e acertar o volume para a marca de 1,0 mL, retirando o excesso de sobrenadante.
Em um tubo de 12x75, adicionar 0,4 mL de solução hemolisante (Frasco 2 – kit) e 0,1 mL de amostra de hemácias.
Agitar, vigorosamente, por 20 segundos.
Aguardar 5 min para que ocorra a hemólise.
PARTE 2: PREPARAÇÂO DA COLUNA DE TROCA IÔNICA (Técnico do Laboratório)
Nomear um tubo de ensaio como “Tampão”.
Acomodar a coluna de Troca Iônica sobre este tubo de ensaio e retirar a tampa superior da coluna.
Introduzir o bastão fazendo movimentos giratórios descendentes e ascendentes para suspender a resina (fase estacionária).
 Remover a tampa inferior e acomodar novamente a coluna (verticalmente) sobre o tubo de ensaio “Tampão”.
Obs: Não permita que a ponta da coluna entre em contato com o líquido transferido para o tubo.
Aguarde que todo o líquido penetre no interior da resina (fase estacionária). Lacre a base da coluna com parafilm (ou equivalente) até o momento de utilização dos alunos na prática.
PARTE 3: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA (Executado pelo grupo de alunos no dia da prática):
Uitlizar os Equipamentos de Proteção Individual solicitados pelo professor (luva de procedimento, óculos de segurança, touca e máscara).
Enumerar dois tubos de ensaio como “1” e “2”.
Adicionar ao tubo “2”: 7,0 mL de água destilada e 0,02 mL (20 microlitros) de amostra de hemolisado. Homogeneizar e deixar na estante de tubos.
Acomodar a coluna no tubo “1”.
Adicione 0,05 mL (50 microlitros) de amostra de hemolisado sobre a resina. (Com cuidado para evitar formação de bolhas de ar).
Aguardar que o hemolisado penetre no interior da resina.
Adicionar, lentamente (com a adição pela parede da coluna), 3,5 mL de tampão (Frasco 1 - kit).
 Aguardar até que todo o tampão penetre no interior da resina. Homogeneizar o líquido coletado no Tubo “1”.
 Levar os tubos “1” e “2” para o espectrofotômetro, previamente ajustado em  = 415 nm, zerando com água destilada.
Efetuar a leitura das absorbâncias dos dois tubos (A1 e A2).
 Efetuar o cálculo do teor de Hemoglobina Glicada na amostra de sangue:
Obs: Considera-se como valor de referência um teor de HbGl entre 5,3% e 8,0%.