4 Sequenciamento

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Sequenciamento de DNA
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Tipos sequenciamento de DNA
Sequenciamento manual
O Primeiro método de sequenciamento do DNA foi desenvolvido por Sanger e colaboradores (1979), conhecido também como método do término do crescimento da cadeia. 
Sequenciamento automático 
Utilizados em larga escala, como por exemplo em projetos genoma (leitura do gel e o processamento de sequências são realizadas através de computadores). 
No sequenciamento automático os nucleotídeos estão marcados com fluorocromos ao invés de isótopos radioativos. 
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Sequenciamento de Sanger (manual)
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Sequenciamento de Sanger
Fred Sanger, bioquímico inglês, está entre as únicas 5 pessoas que já foram agraciadas com dois prêmios Nobel. 
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Didesoxinucleotídeos
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Didesoxinucleotídeos
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Didesoxinucleotídeos
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Sequenciamento de Sanger
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Sequenciamento de Sanger
Baseia-se no principio em que, num dado momento da extensão (semelhante à PCR), uma pequena porcentagem de moléculas irá incorporar um ddNTP e neste caso a reação de alongamento da cadeia será automaticamente interrompida naquele sítio...
Mas o que são ddNTP???
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Sequenciamento de Sanger
Uma vez terminadas as reações de extensão, cada fragmento recém sintetizado é separado em gel desnaturante de poliacrilamida-ureia e a seguir autoradiografado.
Como este tipo de gel tem alto poder de resolução, é possível então visualizar na autoradiografia cada um dos fragmentos sintetizados como uma banda específica. 
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Sequenciamento: separação dos fragmentos
Cada um dos produtos das 4 reações, contendo uma pequena quantidade de um dos quatro didesoxinucleotídeos, são aplicados no gel e realizada a eletroforese.
 Como a polimerização ocorre apenas no sentido 5’ a 3’, os fragmentos menores estarão em 5’ e os maiores na direção 3’
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Sequenciamento: separação dos fragmentos
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Sequenciamento: separação dos fragmentos
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Vamos praticar...
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Sequenciamento automático
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Sequenciamento automático
A reação de sequenciamento é realizada através do método de Sanger (1979), do mesmo modo que no sequenciamento manual.
Entretanto, no sequenciamento automático os nucleotídeos estão marcados com fluorocromos ao invés de isótopos radioativos.
Quatro diferentes fluorocromos são empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em diferentes comprimentos de onda. 
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Eletroforese
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Em uma investigação de estupro seguido de morte, na tentativa de identificação do
criminoso por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), os
investigadores coletaram material junto ao corpo da vítima. A respeito desse assunto,
julgue os itens seguintes e assinale a falsa:
a) Sangue, cabelo e sêmen encontrados no local do crime constituem material com
potencial para fornecimento de DNA para a realização da técnica de PCR.
b) A técnica de PCR possibilita a clonagem de seqüências específicas de DNA, de
forma rápida, numerosa e sem a necessidade de uma célula viva.
c) Por ser bastante simples, a técnica de PCR dispensa o uso de luvas descartáveis,
reagentes e soluções de alta qualidade ou micropipetas de uso exclusivo.
d) Independentemente da técnica de PCR, a presença de espermatozóides do
criminoso em esfregaço vaginal da vítima de estupro possibilita a identificação inequívoca
deste.
e) Além da molécula de DNA, o RNA também pode ser usado como molde original
para a técnica de PCR.
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 Observe as ilustrações dos géis abaixo e identifique o tamanho aproximado dos fragmentos de DNA (bandas) analisados usando como base o marcador de tamanhos moleculares de fragmentos de DNA
Eletroforese 2:
1 - M = 250 pb
2 - _______ pb
3 - _____ pb e _____ pb
4 - _______ pb
5 - _______ pb
Eletroforese 1
1 - M = 100 pb
2 - _______ pb
3 - _______ pb
4 - _______pb
5 - _______ pb e ___ pb
6 - _______ pb
7 - _______ pb e _____ pb
8 - _______ pb
9 - _______ pb e __ __ pb
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Determine a sequencia do fragmento de DNA
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