Reações Enzimáticas

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Universidade Pitágoras Unopar
Relatório de Aula Prática:
Laboratório de Engenharia Química II
REAÇÕES E ATIVIDADES ENZIMÁTICAS
 	
Londrina - PR
2019
Acadêmicos:
Fabíola de Souza
Juliana Matsumoto
Juliana Ramalho
Relatório de Aula Prática:
Laboratório de Engenharia Química II
REAÇÕES E ATIVIDADES ENZIMÁTICAS
Relatório entregue como requisito de avaliação parcial da disciplina Laboratório de Engenharia Química II do curso superior de Engenharia Química da Universidade Pitágoras Unopar – Campus Catuaí. 
Prof. Ma. Caroline Coldebella
Londrina - PR
2019
Sumário
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Lista de Figuras
	Figura 1. Glicose Oxidase...................................................................................11
Figura 2. Curva de temperatura ótima e pH ótima na atividade enzimática.......12
Figura 3. Gráfico efeito do pH e Temperatura da atividade enzimática..............13
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Lista de Tabelas 
	Tabela 1. pH Ótimo De Enzimas......................................................................8
Tabela 2. Procedimentos realizado em de cada medição – Temperatura ....15
Tabela 3. Procedimentos realizado em de cada medição – pH.....................16
Tabela 4. Valores de concentração (mg/mL) com a variação de temperatura....................................................................................................17
Tabela 5. Valores de concentração (mg/mL) com a variação de pH.............19
Lista de Gráficos
	Gráfico 1. Temperatura x Concentração.......................................................18
Gráfico 2. pH x Concentração.......................................................................19
Resumo
O potêncial hidrogeniônico que indica a acidez, neutralidade ou alcalinidade em uma solução aquosa é conhecido como pH que é uma forma de demonstrar a concentração de íons de hidrogênio (H+) em solução. O prefixo “p” significa “logaritmo decimal negativo de”. Assim, pH é o logaritmo negativo da concentração de H+ em um solução, em molaridade. A escala atual de medição de pH oscila entre 0 a 14, um exemplo é uma solução com pH 7 que terá uma concentração de H+ de ordem de 10-7M (TENUTA; TABCHOURY; CURY, 2019).
	A medição do pH pode ser realizado por um pHmetro que consiste em um eletrodo acoplado a um potenciômetro e por fitas medidores que usam como indicador a cor. A cor do indicador varia com o pH da solução, porém os mais utilizados são a fenolftaleína, alaranjado de metila e azul de bromofenol (MORAIS, 2019).
	A atividade enzimática depende do pH para sua eficiência, toda enzima tem o seu pH ótimo ou seu intervalo de pH para sua atividade máxima, um pH maior ou menor pode interferir no desempenho da enzima (ACOSTA, 2019).
	A Tabela 1 a seguir apresenta alguns valores ideias para diferentes tipos de enzimas: 
Tabela 1. pH Ótimo De Enzimas
	Enzimas
	pH
	Pepsina
	1,5
	Fosfatase ácida
	4,5
	Urease
	6,5
	Tripsina
	7,8
	Arginase
	9,7
Fonte: Coelho (2019).
 
	A Alteração de pH da enzima além da diminuição da eficiência pode ter outros efeitos, como, a alteração da carga de aminoácidos da molécula (interação eletrostática), afeta a estrutura da molécula, desnaturação ácida quando o pH está abaixo do ideal que acarreta no desaparecimento das cargas negativas e a desnaturação alcalina que ocorre com o pH acima do ideal e acarreta no desaparecimento das cargas positivas (COELHO, 2019).
	A temperatura nada mais é do que a uma grandeza física que mede o estado de agitação das partículas de um corpo, caracterizando o seu estado térmico. Quanto maior o seu valor, maior é a energia cinética média dos átomos do corpo (ACOSTA, 2019).
	A grandeza que é essencial nos dias de hoje pode ser medida de inúmeras formas, sendo a mais conhecida e utilizada o termômetro de dilatação de líquido em recipiente de vidro e dilatação de líquido em recipiente metálico, termopar e elétricos. O medidor de temperatura deve ser adaptado para a superfície que se deseja saber a medida (ACOSTA, 2019).
	O desequilíbrio da temperatura na atividade enzimática pode acarretar na desnaturação por desdobramento da molécula, a desordem da enzima e ainda na acelera a eficiência da enzima (COELHO, 2019).
Objetivos
Analisar o efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática, encontrar o pH mais próximo do ótimo da glicose oxidase e identificar a aplicação da glicose oxidase na indústria 
Fundamentação Teórica
As enzimas são proteínas com alto poder catalítico, são especializadas na catálise de reações biológicas e devido a isso, são muito melhores aos catalisadores produzidos pelo homem. São essenciais para o metabolismo das células e diversas reações químicas, atuam em concentrações muito baixas e em condições amenos de pH e temperatura. Desse modo, é de extrema importância conhecer as condições de operação e saber controlá-las em processos industriais (VIEIRA,2009).
Foi utilizado glicose oxidase (GOD) para a realização deste experimento, no qual é uma enzima que houve um grande crescimento de utilização para a composição de biossensores para detectar níveis de glicose sanguínea, é considerada como conservante natural e é muito comum ser encontrada no mel. São presentes em organismos aeróbios e oxida a glicose para ácido glucônico (SOUSA,2007).
A produção de GOD tem um aumento significativo em ambientes com alta concentração de oxigênio e glicose, mas segundo as pesquisas, nenhuma desta enzima pode ser obtida em ambientes onde a concentração do oxigênio dissolvido é menor que 7% e por isso, estão realizando projetos para tentarem otimizar essa produção (SOUSA,2007).
A glicose oxidase tem grande importância comercial, além de ser utilizado na produção de ácido glucônico, é muito utilizada na indústria farmacêutica e na produção do vinho também. Em indústrias alimentícios, a GOD é usada para remover o oxigênio das bebidas como uma fonte de peróxido de hidrogênio, conservando os alimentos e reduzindo o escurecimento enzimático (VIEIRA,2009).
Figura 1. Glicose Oxidase
Fonte: Vieira (2009)
A temperatura e o pH foram os dois fatores que influenciaram no experimento da enzima glicose oxidase (MAFRA,2013).
A velocidade da atividade enzimática aumenta quando a temperatura é aumentada também. Logo que acontece isso, as moléculas se agitam, tendo mais possibilidades das moléculas se chocarem e gerarem reação. Devido a agitação, se a temperatura for muito além, as ligações responsáveis por estabilizar a estrutura da enzima é rompida. Entretanto, a velocidade da reação aumenta até certo ponto e após determinada temperatura, a velocidade declina, mesmo aumentando a temperatura (MAFRA,2013). 
Devido a uma repulsão de cargas, mudanças extremas de pH alteram a estrutura da enzima. Mas, do mesmo modo como acontece com a temperatura, ocorre com o pH também, ou seja, só ocorre o declínio após o aumento do pH aumentar a velocidade de reação até atingir o valor considerada ótima e esse decréscimo acontece de forma muito rápida (SOUSA,2007).
Figura 2. Curva de temperatura ótima e pH ótima na atividade enzimática
Fonte: Mafra (2013).
Pode-se considerar que a velocidade de reação aumenta ou diminui por um fator de 2 a cada variação de 10ºC e a faixa de temperatura entre 20 a 40% (FOGLER,2009).
A oxidação da glicose a ácido glucônico, ocorre com pH 5,1 e a 35ºC. Ocorrendo um aumento de 50 a 100% caso a reação seja conduzida em meio saturado por oxigênio (FOGLER,2009).
Figura 3. Gráfico efeito do pH e Temperatura da atividade enzimática
Fonte: Fogler (2009).
O pH de máxima atividade foi de 6. No intervalo de 4 a 7 apresentou mais de 50% da atividade máxima e quando o pH é igual a 8 perdeu-se totalmente a sua atividade. A temperatura máxima foi de 55ºC, e na temperatura acima de 40ºC apresentou atividade máxima de 50% (FOGLER,2009).Parte Experimental
Materiais e utilizados
Tubos de ensaio
Estante para tubos
Pipetas 
Banho de gelo
Banho maria
Padrão de glicose 0,1 mg/ml 
Glicose oxidase
NaOH (0,5N)
Tiras reagentes para pH ou pHmetro
Pipetador
Pêra 
Pipeta automática
Ponteiras
Espectrofotômetro (510 nm)
Procedimento experimental
Atividade 1: Efeito da temperatura
Para realizar a atividade, primeiramente separou-se todas as matérias para execução da mesma. Em seguida preparou-se quatro tubos de ensaio de acordo com a Tabela a 2, inserindo a quantidade de substrato e enzima analisando o pH e o tempo de reação para determinar o efeito da temperatura.
Tabela 2. Procedimentos realizado em de cada medição - Temperatura
	Tubo
	1
	2
	3
	Branco
	Volume de GOD (mL)
	4
	1
	1
	1
	Temperatura e tempo de incubação
	Gelo
2 min
	BM 37°C
2 min
	BM 60°C
2 min
	Temperatura ambiente 2 min
	Volume Padrão de Glicose (mL)
	0,04
	0,04
	0,04
	*
	Temperatura e tempo de incubação
	Gelo
5 min
	BM 37°C
5 min
	BM 60°C
5 min
	Temperatura ambiente 5 min
	Volume de NaOH (mL)
	0,04
	0,04
	0,04
	0,04
*Adicionou-se 0,04 ml de água destilada no branco. 
Em seguida, depois do preparo dos 4 tubos com o volume de GOD, realizou as fases subsequentes para que fosse possível analisar o valor da absorbância.
Atividade 2: Efeito do pH
Para a segunda atividade, preparou os quatros tubos com as quantidades determinadas na Tabela 3, que foram submetidos aos substrato e enzima analisando a temperatura e o tempo de reação para determinar o efeito do pH.
Tabela 3. Procedimentos realizado em de cada medição – pH 
	Tubo
	1
	2
	3
	Branco
	Interferente (mL)
	HCL
	NaOH
	Água destilada
	Água destilada
	Volume de GOD (mL)
	1
	1
	1
	1
	Volume Padrão de Glicose (mL)
	0,04
	0,04
	0,04
	*
	Temperatura e tempo de incubação
	BM 37°C
5 min
	Volume de NaOH (mL)
	0,04
	0,04
	0,04
	0,04
*Adicionou-se 0,04 ml de água destilada no branco. 
Depois da preparação dos quatros tubos de ensaio, realizou a fases da tabela acima até a adição de glicose oxidase ao meio interferente, então realizou-se a medida do pH para poder comprar com a medição após o período de incubação e medição da absorbância.
Resultados e Discussões
Resultado: Efeito da Temperatura
Realizou-se a medição da temperatura durante o procedimento, obtendo temperaturas que estão demonstradas na Tabela 3. Depois de realizar os procedimentos citados no procedimento experimental, realizou-se a medição da absorbância com auxílio do Espectrofotômetro. 
Com os valores obtidos de absorbância descritos na Tabela 4, realizou-se os cálculos para determinar a concentração de produto, utilizando K=1,5, obtendo os seguintes resultados:
A = K .c
Tabela 4. Valores de concentração (mg/mL) com a variação de temperatura
	Tubo
	Temperatura (°C)
	Absorbância
	Concentração (mg/mL)
	1
	0
	0,295
	0,197
	2
	39,3
	0,290
	0,193
	3
	60,4
	0,306
	0,204
	Branco
	(36,3) Temp. Ambiente
	0,034
	0,023
A partir dos resultados obtidos, foi construído um gráfico de temperatura (eixo x) pela concentração (eixo y):
Gráfico 1. Temperatura x Concentração
Com auxílio do gráfico, pode-se concluir que há uma relação, pois com aumento da temperatura ocorreu um aumento de concentração, porém não é conclusivo, pois variando da temperatura 0°C para 39,3°C ocorre uma pequena variação.
Resultado: Efeito do pH
Para a realização dos cálculos da variação do pH no experimento, realizou-se o procedimento 2.2.1, e em seguida analisou a absorbância das amostras, demonstradas na Tabela 5. 
Com os valores obtidos de absorbância demonstrados na Tabela 5, realizou-se os cálculos para determinar a concentração de produto em relação a variação de pH, utilizando K=1,5, obtendo os seguintes resultados:
A = K .c
Tabela 4 – Valores da concentração de produto formado em relação ao pH final e Absorbância
Tabela 5. Valores de concentração (mg/mL) com a variação de pH
	Tubo
	pH
	Absorbância
	Concentração (mg/mL)
	1
	1
	0,030
	0,020
	2
	12
	0,094
	0,063
	3
	7
	0,378
	0,252
	Branco
	7
	0,000
	0,000
A partir dos resultados obtidos, foi construído um gráfico de pH (eixo x) pela concentração (eixo y):
Gráfico 2. pH x Concentração
Conclusão
Analisando os resultados dos experimentos conclui-se que concentração da Glicose Oxidase tem alteração na sua atividade quando alteramos a temperatura e pH. Na temperatura houve uma pequena variação na temperatura de 39,3°C que apresentou uma concentração menor, mas apresentou-se ser coerente, onde quando se aumenta a temperatura, aumenta a concentração. Já no pH, as medições das absorbâncias podem ter sido incorretas, pois com a diferença de pH, não ocorreu tanta variação do pH 1 para 12, mas houve uma grande divergência no pH do tubo 3 que estava com água destilada e pH 7, que apresentou uma concentração muito maior. O correto seria fazer uma reanálise das amostras para uma melhor avaliação.
Referências Bibliográficas
FOGLER, H.S. Elementos de engenharia das reações químicas. Tradução Evaristo C. Biscaia. Revisão técnica Frederico W. Tavares. 4 ed. Rio de Janeiro: LTC, 2009.
MAFRA, A. C. O. Produção de ácido glucônico e xarope de frutose a partir de sacarose catalisada por enzima em reator airlift. 2013. 122 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade de São Carlos, São Carlos, 2013. Disponível em: <https://repositorio.ufscar.br/bitstream/handle/ufscar/4114/5040.pdf?sequence=1&isAllowed=y>. Acesso em: 01 set. 2019.
SOUSA, D. R. T. de. Produção de Glicose Oxidase (E.C. 1.1.3.4) por fungos isolados da Floresta Amazônica. 2017. 115 f. Tese (Doutorado em Biodiversidade e Biotecnologia) – Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia BIONORTE, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2017. Disponível em: <https://tede.ufam.edu.br/bitstream/tede/5935/5/Tese%20-%20Diego%20Rayan%20T.%20Sousa.pdf>. Acesso em: 07 set. 2019.
VIEIRA, D. C. Imobilização da Enzima β–galactosidase de Kluyveromycesfragilis em agarose e quitosana utilizando diferentes protocolos de ativação, 96f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2009.
ACOSTA, Simone Massulini. Medição de Temperatura. Disponível em: <file:///C:/Users/LABH4/Downloads/11%20-%20Temperatura.pdf>. Acesso em: 10 set. 2019.
COELHO, M.a.z.. ESTABILIDADE DE ENZIMAS. Disponível em: <http://www.eq.ufrj.br/biose/nukleo/aulas/Enzimol%20Grad/EQB483_aula7.pdf>. Acesso em: 10 set. 2019.
TENUTA, Livia Maria Andaló; TABCHOURY, Cínthia P. M.; CURY, Jaime A.. Conceitos de pH, sistemas tampão e solubilidade. Disponível em: <http://srvd.grupoa.com.br/uploads/imagensExtra/legado/C/CURY_Jaime_A/ABENO_3_Bioquimica_Oral/Lib/Amostra.pdf>. Acesso em: 10 set. 2019.
MORAIS, Júlio. UE– Departamento de Química e Instituto de Ciências Agrárias Mediterrânicas. Disponível em: <http://www.videos.uevora.pt/quimica_para_todos/valor_ph.pdf>. Acesso em: 10 set. 2019.