Western-Blot

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20/03/2012 
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Western Blot (Immunoblot) 
Dr. Carlos Prudencio 
MV, MSc, DSc Genética 
Pós-doutorado Biotecnologia 
Pós-doc FMVZ/USP 
Técnicas sorológicas e de biologia molecular no diagnóstico de agentes infecciosos 
INTRODUÇÃO 
• Conceito: técnica analítica 
• Reagentes comerciais 
• Areas de bnol, bioquímica e imunologia 
• Relacionado à tecnicas de ELISA e IF 
• Western blot, Southern blot, Northern blot 
VANTAGENS 
• Alta sensibilidade e especificidade; 
• Reconhecimento de antígenos individuais em 
um extrato; 
• Realização de perfil de reconhecimento de 
antígenos 
• Cinética de expressão de proteínas celulares 
• Determinação de proteínas imunodominantes; 
DESVANTAGENS 
• Custo médio a alto; 
• procedimento longo e propenso a erros em 
diversos pontos; 
• dependendo do sistema de revelação, pode-se 
ter problemas de segurança. 
 
ETAPAS PARA EXECUÇÃO DA TÉCNICA 
1. Amostras 
2. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida 
3. Transferência (Blotting) 
4. Marcação 
5. Detecção 
6. Imagens 
7. Análises de Imagens 
1 - PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 
Sonicação ou 
força mecânica 
Quantificação 
Aula do Prof. João 
Be gentle! Stay 
cool! 
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EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS 
• Detergentes 
• Lise por congelamento e descongelamento 
• Shock osmótico 
• Ultrasonicação 
• Métodos mecânicos 
• Digestão enzimática 
• Tampões de lise e kits de preparação de amostras 
• Proteção de amostras 
• Limpeza de amostras (Sample clean up) 
• Quantificação 
2 - ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) 
TAMANHO FORMA E/OU CARGA. 
 
Mr >5000 ATÉ<200 000. 
• ETAPA 2 
ELETROFORESE 
• ETAPA 2 
GEIS DE POLIACRILAMIDA 
BISACRILAMIDA 
CROSS LINK 
ACRILAMIDA 
(UNIDADE 
MONOMÉRICA) 
CH2= CH 
 | 
 C = O 
 
 | 
 NH2 
 
CH2= CH 
 | 
 C = O 
 
 | 
 NH 
 | 
 CH2 
 | 
 NH 
 | 
 C=O 
 | 
 CH2=CH 
 
Acrilamida 
Metileno 
bisacrila
mida 
...- CH2 - CH 
 | 
 C = O 
 | 
 NH2 
- CH2 - 
- CH2 - 
- CH2- CH 
 | 
 C = O 
 | 
 NH 
 | 
 CH2 
 | 
 NH 
 | 
 C=O 
 | 
 CH2-CH 
 CH -... 
 | 
 C = O 
 | 
 NH2 
 ...-CH - 
 | 
 C = O 
 | 
 NH2 
 CH -... 
 | 
 C = O 
 | 
 NH2 
[ monômeros] determina 
tamanho dos poros 
(30 % acrilamida (29 acrilamida: 1 bisacrilamida)) 
TAMANHO DO PORO 
TAMANHO DO PORO 
• T- concentração total de acrilamida 
T= (a+b) x 100 = (30+0,8) X 100 = 30% 
 V 100mL 
• C - porcentagem de “crosslinker” 
C = b x 100 = 0.8 X 100 = 2,6% 
 a + b 30.8 
Solução estoque de Acrilamida e Bisacrilamida 
30% T; 2,6% C 
(30% acrilamida; 0,8% N,N´-metilenobisacrilamida, 100ML) 
(30% acrilamida; 1% N,N´-metilenobisacrilamida, 100ML) 
(49% acrilamida; 0,5% N,N´-metilenobisacrilamida, 100ML) 
POLIACRILAMIDA (30% acrilamida; 0,8% N,N´-metilenobisacrilamida, 1 00ML) 
POLI 
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Eletroforese 
• Desnaturante 
– Separação por peso molecular 
• Não redutora 
• Redutora 
– Pontes S-S 
• Não desnaturante (Nativa) 
– Separação por carga, peso e 
forma 
SDS - 
DTT- 
bM 
SDS 
DTT 
BMERCAPTANOL 
+ 
+ 
+ 
- 
- PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 
Preparo tampão da amostra 
Amostra 
ACRILAMIDA PREPARACAO DO GEL 
Sistema descontinuo TAMPÕES 
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PROCESSO 
FIXAR AMPERAGEM 
NÃO FIXAR VOLTAGEM 
3 - TRANSFERÊNCIA (BLOTTING) 
Transferência em Tanque ELETRO-TRANSFERÊNCIA: Semi-dry- SEMI SECO 
Transferência Membranas 
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Controle de transferência 4 - IMUNOMARCAÇÃO 
Passos: Bloqueiro >>>>Anticorpo Primário >>>>Anticorpo secundário 
A) Bloqueio: Proteínas 
EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS 
Bloqueio: Detergentes como agentes de bloqueio 
EVITAR REAÇÕES INESPECÍFICAS 
AUMENTAR ESTRINGÊNCIA 
BLOQUEIO E LAVAGENS 
Anticorpos Primários 
SOROLOGIA: AMOSTRAS A SEREM TESTADAS 
Anticorpos Secundários 
• Anti - Anticorpos 
• Tipos de anticorpos 
– Monoclonais 
– Policlonais 
Antígeno 
Enzimas Conjugadas 
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Enzimas 
• Alkaline phosphatase (AP) 
• Horseradish peroxidase (HRP). 
• Fluorophores 
• Biotinylated secondary antibodies: 
• Gold-conjugated antibodies: 
• Radioisotopes: 
 
AP e HRP = Amplificação/Sensibilidade 
Amplificação: Biotina/Estreptavidina 
AUMENTA SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE 
Etapas de incubação/lavagens 
5 - DETECÇÃO MECANISMO QUÍMICO DE DETECÇÃO 
LUMINOL DAB /HRP 
NBT/BCIP/AP 
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Mechanism of detection chemistries Colorimetric AP Systems 
Colorimetric HRP systems Colorimetric detection systems 
6 - IMAGENS 
Digital imaging 
Chemiluminescence detection using film 
Autoradiography 
 
ImageQuant LAS 
4000. Sistema de 
Imagem 
Multifuncional 
Typhoon FLA 9500 
7 - ANÁLISES DE IMAGENS 
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DETERMINAC ̧ÃO DE UMA PROTEI ́NA DE INTERESSE 
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SDS-PAGE
-Determinação do PM de uma proteína de interesse
Visualização: AgNO3, azul de Comassie
-Acompanhar purificação de proteínas
-Acompanhar expressão de proteínas (Western blot)
-Isolar proteínas para análise por MS
AUGUSTO 2011
SDS-PAGE- desnaturante e redutor
Não distingue um monômero de um dímero de cadeias de 
PM igual ou próximo unidos por pontes -S-S-
AUGUSTO 2011
SDS-PAGE-EXPERIMENTAL
-Receber o gel preparado e aplicar as amostras
Boa resolução = bandas estreitas
Gel de aplicação empilhamento
diferente (mais poroso e < pH) 
-Às amostras dialisadas e secas são adicionados 20 uL de tampão 
de amostra (tampão+ glicerol + SDS + Azul de bromofenol (corante 
de acompanhamento) + beta-mercaptoetanol). Incuba-se 5 min em 
água fervente e se aplica ao gel.
4 %
10-20 %
( p p )
do que gel de separação.
Permite que proteínas migrem
livremente formando uma
pequena “pilha” 
AUGUSTO 2011
Mobilidade seria
Glicinato- < P-SDS-< Cl-
pI~6,0 
SDS-PAGE-EXPERIMENTAL
_
Espécies ajustam [ ] 
p/ mesma mobilidade
Cl- > P-SDS- > glicinato-
HCOO- HCOO-
NH3
+ NH2
4 %
Gel de empilhamento (4%)-
bandas estreitas de PSDS- antes de 
entrarem no gel de separação
-
Gel separação pH> 
Gilicinato- e Cl- migram 
livremente pelos poros
+
Cl > P SDS > glicinato
Muito baixa-concentração
fica como banda estreita
na interface entre os
outros anions 10-15%
4%
AUGUSTO 2011
3/10/2011
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SDS-PAGE
-Determinação do PM de uma proteína de interesse
Visualização: AgNO3, azul de Comassie
-Acompanhar purificação de proteínas
-Acompanhar expressão de proteínas (Western blot)
-Isolar proteínas para análise por MS
AUGUSTO 2011
SDS-PAGE- desnaturante e redutor
Não distingue um monômero de um dímero de cadeias de 
PM igual ou próximo unidos por pontes -S-S-
AUGUSTO 2011
SDS-PAGE-EXPERIMENTAL
-Receber o gel preparado e aplicar as amostras
Boa resolução = bandas estreitas
Gel de aplicação empilhamento
diferente (mais poroso e < pH) 
-Às amostras dialisadas e secas são adicionados 20 uL de tampão 
de amostra (tampão+ glicerol + SDS + Azul de bromofenol (corantede acompanhamento) + beta-mercaptoetanol). Incuba-se 5 min em 
água fervente e se aplica ao gel.
4 %
10-20 %
( p p )
do que gel de separação.
Permite que proteínas migrem
livremente formando uma
pequena “pilha” 
AUGUSTO 2011
Mobilidade seria
Glicinato- < P-SDS-< Cl-
pI~6,0 
SDS-PAGE-EXPERIMENTAL
_
Espécies ajustam [ ] 
p/ mesma mobilidade
Cl- > P-SDS- > glicinato-
HCOO- HCOO-
NH3
+ NH2
4 %
Gel de empilhamento (4%)-
bandas estreitas de PSDS- antes de 
entrarem no gel de separação
-
Gel separação pH> 
Gilicinato- e Cl- migram 
livremente pelos poros
+
Cl > P SDS > glicinato
Muito baixa-concentração
fica como banda estreita
na interface entre os
outros anions 10-15%
4%
AUGUSTO 2011
-Acompanhar purificação de proteínas 
-Acompanhar expressão de proteínas (Western blot) 
-Isolar proteínas para análise por MS 
ANÁLISES DE IMAGENS 
Normalização com controle constitutivo 
COLORIMETRIC DETECTION 
densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry. 
Chemiluminescent detection 
LUNINOL 
 SENSIBILIDADE 
 ALTO CUSTO 
 REAPROVEITÁVEL 
Anticorpos Fluorescentes: Multiplex 
 
 
 Multiplos Ags 
Mesmoo MW 
Pts de alta e baixa abundancia 
is less sensitive than chemiluminescence. 
HIV 
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A western blot is also used as the definitive test for Bovine spongiform 
encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow disease'). Some forms of Lyme disease testing employ western blotting. 
Borrelia burgdorferi 
CDC 
Lyme disease reactive Western blot 
Description of lanes: 
Lane 1 - molecular weight marker 
Lane 2 - positive patient sample 
Lane 3 - positive patient sample 
Lane 4 - monoclonal antibodies for 39 
and 41kD bands 
Lane 5 - monoclonal antibodies for 41kD 
band 
Lane 6 - monoclonal antibodies for 39 
and 41kD bands 
Lane 7 - monoclonal antibodies for 31 
and 34kD bands 
Lane 8 - positive control pool 
Western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis 
B infection. 
Cirrhosis of the liver as a result of 
Hepatitis B infection 
Western blot - Hepatitis B Virus pre S2 Antigen antibody 
[S26] 
In veterinary medicine, western blot is sometimes used to confirm 
FIV+ status in cats. 
Feline immunodeficiency virus 
CRPRUDENCIO@USP.BR 
• MUITO OBRIGADO!!