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CENTRO UNIVERSITÁRIO DE BRASÍLIA – UniCEUB FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE BIOMEDICINA AULAS PRÁTICAS HEMATOLOGIA PROFESSORA: TATIANA BORGES FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PREPARO DO PACIENTE O laboratório clínico tem como função auxiliar o médico no prognóstico e diagnóstico de condições fisiológicas ou de processos patológicos, bem como na avaliação da gravidade do caso ou da resposta ao tratamento. Ele se constitui de vários ramos de atividade, estando individualizados, dependendo do tamanho e porte do mesmo. Os setores mais comuns no laboratório são a hematologia, bioquímica, parasitologia, microbiologia, imunologia e uroanálises. A rotina laboratorial possui várias etapas integradas entre si, cruciais para o bom desempenho de sua função clínica. Essas etapas vão desde a entrada do paciente na recepção, a coleta da amostra, passando pelas fases analíticas indo até a entrega do resultado ao paciente e esse ao médico. Como existe uma interação entre médico – paciente – laboratório, é evidente que existe a necessidade de se manter um bom relacionamento entre essa ponte, no intuito de obter o melhor resultado. Em termos técnicos o laboratório se divide em 03 fases: pré-analítica, analítica e pós-analítica. A fase pré- analítica é uma das fases mais críticas, pois é a partir dela que começa todo o processamento da amostra e uma vez que ocorra erro neste momento, esse mesmo se estenderá para outras fases de análises, chegando ao paciente um resultado errado ou mal realizado. Assim, de nada adianta um laboratório estar apropriadamente equipado, ser dirigido por excelentes profissionais e contar com um pessoal técnico de primeira qualidade, se a fase pré-analítica tiver sido malfeita. Nessa fase se encontram a preparação do paciente, a coleta e o processamento da amostra. ATENÇÃO ESPECIAL O pessoal do laboratório deve dispensar a maior atenção para com os clientes. Os exames em geral causam desconforto, sempre causam apreensão e freqüentemente são caros, para os clientes particulares. É muito importante que o pedido do médico seja bem entendido, para evitar repetições de colheita de materiais. Aconselha-se que todas as repetições de colheita sejam feitas com o conhecimento do responsável pelo laboratório, que por sua vez deverá estabelecer medidas que evite, ao máximo, essa prática desagradável para o cliente e altamente nociva ao bom nome do laboratório. É imperioso que o paciente seja bem tratado, desde a recepção até o local de coleta. Que ele seja sempre informado sobre o procedimento que será utilizado para coleta, como ele deverá proceder ou se comportar ao coletar. Que as suas dúvidas sejam, na medida do possível, esclarecidas e para que ele se sinta seguro ao realizar seus exames. INSTRUÇÕES PRELIMINARES Tratando-se de colheitas especiais, como as que têm que ser feitas após jejum, após alguma dieta, que necessitam de materiais de 24 horas, etc., deve-se instruir cuidadosamente os pacientes, oralmente, fornecendo- lhes em seguida as instruções, por escrito, para que leiam posteriormente e as sigam com fidelidade; em hospitais essas instruções devem ser enviadas a cada Serviço ou Enfermaria e sua aplicação deve ser coordenada pela enfermagem. PEDIDOS ESPECIAIS Eventualmente, determinados médicos solicitam exames coletivamente, com expressões como “perfil hepático”, “perfil imunológico”, “provas de atividade reumática”, “provas da coagulação”, etc. E apenas um contato direto com eles, pode determinar os exames realmente solicitados. Outras vezes, solicitam “reações sorológicas para Lues”, ou simplesmente “RSS”, o que, na realidade, pode se limitar à prova do VDRL que, se positiva, é confirmada por uma prova mais específica. Ao atender um pedido de exame de líquido cefalorraquidiano, 2 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE devemos fazer todos os exames necessários, de acordo com os achados que forem sendo obtidos, independentemente de maiores especificações do pedido médico. Trata-se de um material de difícil obtenção. Outras vezes, depende do laboratório incluir sistematicamente um ou mais exames dentro de um de um determinado pedido, como no caso do exame cropológico funcional (especialmente para clientes particulares), quando inclui um exame parasitológico de fezes. Outras vezes, devido à possibilidade do encontro de dois agentes etiológicos diferentes e tratando-se de doenças sexualmente transmissíveis, completamos por nossa conta o pedido médico. INDICAÇÃO DA FONTE DE MATERIAL E DAS CONDIÇÕES DE COLHEITAS Os laudos de resultado dos exames devem sempre indicar a fonte do arterial (sangue, soro, material de lesão de perna, etc.) e as condições de colheita: em jejum, após uso de medicamento, colhido no laboratório, trazido pelo cliente, etc., assim como data e hora da colheita. CUIDADOS ESPECIAIS EM CERTOS TIPOS DE EXAMES Determinados tipos de exame, devido à sua natureza, devem merecer cuidados especiais. Por exemplo, a, coleta de sangue arterial para dosagem de gazes deve ser prontamente analisada ou deve ficar no gelo com uma tampa obliterando a saída da agulha, até a realização do exame. IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE A identificação do paciente, nas amostras, é estritamente necessária, sendo que a mesma deve ser feita antes do procedimento técnico. O laboratório deve ter em mãos o nome completo do paciente, número de registro, endereço e telefone, identidade, data de nascimento, a localização do paciente: se externo ou interno no hospital (enfermaria, leito, quarto), quem solicitou o exame. Isso evita troca de paciente, assegura ser o paciente dono da amostra, facilita o contato com o paciente em casos de repetição ou entrega de resultados, disponibiliza o contato com o médico solicitante, insere o paciente no seu grupo etário para lançamento de resultados no que diz respeito aos valores de referência. COLETA DE AMOSTRAS DE SANGUE PREPARO PRÉVIO Antes da coleta, todo o material necessário deve ser reunido e organizado, a condição do paciente conferida e a área da coleta preparada. No box de coleta deve ficar somente o flebotomista e o paciente, a não ser nos casos em que é necessária a ajuda de outro profissional. De maneira geral, as normas para uma boa colheita de sangue são: a) o paciente deve estar psiquicamente preparado; 3 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE b) o local da colheita deve ser apropriado para se conseguir a amostra de sangue suficiente para as determinações; c) se o sangue for colhido com agulha, é fundamental que esta permaneça dentro do vaso puncionado. Para isso, temos de garantir a imobilização do local da colheita. Em caso de crianças pequenas, temos de nos valer de auxiliares que façam a necessária contenção do paciente. Se essas pessoas forem leigas, devem receber primeiramente as devidas instruções e estar preparadas psiquicamente para aceitar o desconforto que a manobra causa à criança; d) o sangue deve fluir facilmente; e) se usado garroteamento, este não deve ultrapassar de um minuto; f) após a colheita, retirar a agulha antes de transferir o sangue, a não ser no caso de hemoculturas, onde o sangue deve ser injetado assepticamente nos respectivos frascos, através da rolha perfurável; g) usar tubo seco, sem anticoagulante quando se quer obter soro; h) usar tubo com anticoagulante apropriado quando se quiser obter plasma; i) depois de terminadaa colheita, fazer homeostasia compressiva. ASSEPSIA Cuidados de assepsia são necessários a fim de evitar a contaminação do paciente, do operador e do sangue colhido. Deste modo, ao se proceder à coleta, o local da punção deve ser limpo com álcool a 70% e de preferência glicerinado. O álcool a 70% é mais eficaz que o álcool a 96% e a glicerina impede que a pele resseque e o esparramento do sangue. Não só o local da punção deve ser devidamente limpo, mas todo o local e o procedimento a ser utilizado devem estar em perfeitas condições de assepsia e higiene. HEMÓLISE Há grandes diferenças na composição química dos líquidos intracelulares, em comparação com os líquidos extracelulares. Essas diferenças são maiores ou menores, de acordo com as funções que as células exercem. As hemácias, que são células especializadas, apresentam uma concentração de determinados elementos muito diferente da encontrada no plasma. Além dos elementos presentes tanto nas hemácias como no plasma, as hemácias contêm em seu interior o pigmento hemoglobina, que pode vir a alterar o resultado de determinados exames. A ruptura de uma pequena quantidade de hemácias é praticamente inevitável e não causa hemólise visível. Os métodos comumente usados na determinação da hemoglobina não são suficientemente sensíveis para detectar pequenas hemólises. As amostras de plasma ou de soro, hemolisadas, apresentam-se mais coradas, em função da hemoglobina presente. Os níveis abaixo permitem uma avaliação quantitativa do problema: 50 mg de hemoglobina/ 100 ml limite de visibilidade da hemólise 200 mg de hemoglobina/ 100 ml começa o aspecto “levemente hemolisado” acima de 400 mg de hemoglobina/ 100 ml hemólise passa de “moderada” a forte 4 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Há substâncias que se encontram muito concentradas nos eritrócitos e bem mais diluídas no plasma e outras, em contraposição, cujo teor é bem maior no plasma do que nas hemácias. Dependendo da substância que se está determinando e, por vezes, do método de análise utilizado, a hemólise pode causar um aumento ou uma diminuição na taxa dessas substâncias no plasma ou no soro. Os valores obtidos, nessas condições, são falsos e não compatíveis com o quadro clínico do paciente. Há dosagens que praticamente não se alteram com uma ligeira hemólise, como a determinação do nitrogênio não-protéico. Outras determinações, como exemplificamos abaixo, não se alteram apesar da taxa de hemólise de 1 g de hemoglobina/ 100 ml (soro ou plasma fortemente hemolisados): DETERMINAÇÃO MÉTODO Uréia Diacetilmonoxima Conteúdo de Co2 Fenolftaleína Capacidade ligadora de ferro Qualquer Colesterol Cloreto férrico Creatininna Picrato alcalino Ácido úrico Fosfotungstato Fosfatase alcalina 4-nitrofenilfosfato Fosfatase ácida Fenilfosfato Na grande maioria das determinações, contudo, a hemólise causa sérias repercussões nas taxas dos elementos que estão dosados. Nos raros casos em que a concentração plasmática é maior do que a existente nas hemácias, como acontece com o sódio, que apresenta taxas 110 vezes maiores no plasma, a hemólise causa uma diluição seletiva daquele elemento no plasma ou no soro. Enquanto que o ácido úrico, como vimos anteriormente, dosado pelo método do fosfotungstato não se altera mesmo com forte hemólise, com outros métodos aumenta 2 a 3% em soro levemente hemolisado e 105 em soro moderadamente hemolisado. Uma hemólise franca altera de 100 a 200% a taxa de creatinina por outro método que não seja o do picrato alcalino. Na dosagem de aminoácidos plasmáticos não pode ser aceito material hemolisado, pois há liberação de aminoácido do interior das hemácias, falseando os resultados. Pode-se notar, a seguir, a repercussão da hemólise em algumas determinações bioquímicas, comparadas com as taxas obtidas em amostras sem hemólise visível. As determinações foram feitas em amostras dos mesmos pacientes, tomadas na ocasião. DETERMINAÇÃO MÉTODO % DE AUMENTO NO PLASMA POR g DE HEMOGLOBINA Fosfatase ácida Colorimétrico 530 Desidrogenase hidroxibutírica Ultravioleta 510 Desidrogenase láctica Ultravioleta 450 Bilirrubina Diazotização 220 Creatina-fosfoquinase Ultravioleta 100 Potássio Fotometria de chama 70 Ferro Tripiridiltriazina 20 Magnésio Absorção atômica 10 5 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Albumina Verde de bromocresil 10 Proteína total Biureto 10 O problema se complica ainda mais, em pediatria, onde as dosagens sangüíneas, em recém-nascidos, são dificultadas por taxas elevadas de bilirrubina. Uma hemólise de até 200 mg/ 100 ml pode não ser detectada em presença de 20 mg/100 ml de bilirrubina. Além da interferência causada pela contaminação do plasma ou do soro por elementos das hemácias, há certas determinações em que a cor da hemoglobina interfere na cor desenvolvida pela reação. Isso acontece na determinação das bilirrubinas, de lipídios, da uréia, etc. Há determinações em que se introduz um sistema hemolítico e se vai quantificar a hemólise final, como nas reações de fixação de complemento. Ë fundamental que o soro do paciente não tenha hemólise visível. No setor de hematologia, amostras hemolisadas são sempre rejeitadas, pois afetam o hemograma como um todo, principalmente se a lise se estender a outros elementos figurados do sangue, assim como outras dosagens e testes: DETERMINAÇÃO REPERCURSÃO Contagem total das Hemácias Diminui Dosagem de hemoglobina Aumenta Dosagem do hematócrito Diminui VCM Diminui HCM Aumenta CHCM Diminui Contagem total dos leucócitos Se a lise for franca – diminui Contagem diferencial Se a lise for franca - diminui Classificação sangüínea Pode alterar dependendo da extensão da lise VHS Acelera Testes de coagulação Alteram Finalmente, é fundamental que se evite ao máximo, a ocorrência de hemólise. Recomendam-se, então, os seguintes passos, para evitar a lise das células: • Definir cuidadosamente o local de colheita; • Fazer assepsia, enxugar a pele com gaze ou algodão estéreis ou simplesmente deixar evaporar totalmente o desinfetante, antes de introduzir a agulha; • Não friccionar ou comprimir a pele muito vigorosamente na coleta de amostras capilares; • Usar material de coleta seco, estéril, e descartável; • Usar garrote o menor tempo possível; • Retirar o sangue rapidamente, sem mover a agulha; • Não puxar o êmbolo da seringa com muita força, pois criará uma pressão negativa na parede da seringa e dentro da agulha, causando hemólise; • Retirar a agulha e transferir o sangue para os tubos indicados, com ou sem anticoagulante; 6 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE • Tampar e inverter várias vezes os tubos com anticoagulante e deixar em repouso os tubos sem anticoagulante, para que o sangue coagule; • Não manipular os tubos vigorosamente. • Não manter o sangue em calor intenso. ICTERÍCIA A icterícia (presença de grande quantidade de bilirrubina no sangue) interfere em várias dosagens bioquímicas, porém no setor de hematologia, essa interferência ocorre na dosagem de hemoglobina, que pode se encontrar aumentada, o que pode ser evitado, simplesmente pelo o uso de branco de reação. PREPARO DE SANGUE PARA EXAMES Considerando o sangue como uma suspensão celular em um meio líquido, a separação das suas diversas frações pode ser necessária para a realização de determinados exames. Como exemplo pode-se afirmar basicamente que a morfologia celular é estudada empreparações de sangue total, que a dosagem das substâncias em solução é feita no soro sangüíneo e que a determinação dos fatores da coagulação é feita no plasma. Desta forma, muitas vezes o sangue total é submetido a preparo previamente com o objetivo de obter: plasma, soro e sangue desfibrinado que serão usados conforme especificações particularizadas para cada teste a ser realizado. 1- Sangue total É obtido colocando a amostra de sangue recentemente colhida em frasco contendo coagulante. Contém os elementos celulares (hemácias, leucócitos, plaquetas) e os elementos em solução (proteínas, imunoglobulinas, lipídios, etc.) em suspensão no plasma. Os exames devem ser realizados até uma hora após a colheita, misturando previamente o material para homogeneização e retirada de alíquota representativa de sangue. 2 - Soro Soro é a porção líquida amarelada do sangue que resta após a coagulação e remoção do coágulo. Não contém elementos celulares nem fatores da coagulação. Apresenta em solução sais minerais, vitaminas, glicídeos, protídeos, lipídeos, enzimas, hormônios, produtos anabólicos e catabólicos, substâncias também, encontradas no plasma. 3 - Plasma Plasma é a porção fluída do sangue não coagulado. Contém os fatores da coagulação, exceto aquele removido pelo anticoagulante. O fator ausente, quando acrescentado em quantidade suficiente, produz coagulação. 7 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 4 - Sangue desfibrinado Sangue desfibrinado é o sangue total menos os fatores da coagulação. O líquido sobrenadante corresponde ao soro, desde que o fibrinogênio foi removido na formação de fibrina. 5 - Derivados Pode-se, ainda, obter do sangue a parte celular que tem grande utilidade nos bancos de sangue, como por exemplo, a papa de hemácias, a papa de plaquetas; as suspensões de hemácias podem ser usadas nas reações sorológicas como sistema indicador de aglutinação ou hemólise; pode-se usar os leucócitos para pesquisa, como por exemplo, o uso de monócitos e neutrófilos para testes de fagocitose. COLHEITA DE SANGUE POR SERINGA E À VÁCUO Quando se usa seringa para coleta de sangue, esta, por sua vez, deve ser esterilizada, de plástico e descartável. Hoje, com o advento, da SIDA, não se admite mais a utilização de seringas de vidro reutilizáveis. A Agulha usada também é descartável e estéril e o comprimento mais utilizado é o 25 mm com calibre de 0,8 mm para adultos e 0,7 mm para crianças. O manuseio de seringas é extremamente fácil, porém, necessita sempre do conhecimento e experiência por parte do flebotomista para manuseá-las. Além disso, seu uso torna-se uma opção barata para o laboratório. No entanto, sua utilização tem caído em desuso, pois é um método que não coleta grandes quantidades de amostra, em que a agulha fica por um tempo maior no local da punção e necessita de cuidado e treino na transferência do sangue para os respectivos tubos de exames. Por outro lado, a colheita de sangue a vácuo é hoje amplamente usada para obter amostras de sangue, pois proporciona facilidade e rapidez na coleta e influi positivamente na qualidade e na preservação das amostras. Evita desperdício, troca de amostra (pois já vem com etiqueta para identificação do paciente), diminui a manipulação da amostra, dilui corretamente a amostra, diminui risco de contaminação de quem está colhendo, pode coletar maior quantidade de sangue. O sistema a vácuo utiliza tubos de vidro neutros, reforçados, previamente limpos e siliconizados, contendo ou não anticoagulantes. Os tubos são fechados com rolha de borracha siliconizada, perfurável e contêm vácuo na quantidade suficiente para aspirar o volume necessário de sangue. As agulhas, estéreis e também siliconizadas, possuem bisel bem afiado, com ponta nas duas extremidades. Existem agulhas de vários calibres, bem como agulhas para tomadas múltiplas de sangue. 8 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE ESCOLHAL DOS LOCAIS DE PUNÇÃO A escolha do local de punção é feita de acordo com os seguintes critérios: 1. Fluxo sangüíneo colateral (suprimento alternativo de sangue). 2. Acessibilidade do vaso e seu tamanho. 3. Risco de complicações (devem ser evitadas áreas que evidenciam traumatismo de repetidas punções, pelo risco de causar infecções). 4. Edema (devem ser evitados locais com quantidade anormalmente grande de fluidos nos espaços intercelulares do corpo). 5. O local de coleta deve ser examinado para a ocorrência de infecção, hematoma, rash cutâneo ou outra anormalidade que possa contra-indicar o local da punção. AMOSTRA CAPILAR A colheita de sangue capilar é utilizada em hematologia, em pesquisa de hemoparasitos e na colheita de amostras para execução de microtécnicas. O sangue capilar é obtido através da pele. Anatomicamente, a punção causa sangramento dos capilares, das arteríolas que fornecem sangue aos capilares da região e das vênulas, que drenam o sangue desses capilares. A pressão sangüínea das arteríolas e da porção arteriolar dos capilares é muito maior que a pressão venosa e assim o sangramento é principalmente arterial. Fisiologicamente, a pele tem poucas necessidades energéticas e o sangue venoso da pele se assemelha mais a sangue arterial do que o sangue venoso dos músculos. Os principais problemas referentes à colheita de sangue capilar estão na quantidade de sangue necessário para as provas solicitadas, na hemólise e na identificação das amostras. A punção da pele é geralmente feita na superfície póstero-lateral do calcanhar, em crianças de até a idade de 1 ano e, depois dessa idade, na polpa do 30 ou 4º dedo da mão ou do grande artelho. Em adultos utiliza-se a face lateral externa da polpa do 3º ou 4º dedo da mão esquerda, onde a pele é mais macia. Podem ser usados outros locais de colheita, tanto para crianças como para adultos, como, por exemplo, o lobo da orelha. Alguns pediatras contra-indicam a colheita de sangue capilar do calcanhar de recém-nascidos, pelo risco de osteomielite e preferem o grande artelho. Punção neonatal – o calcanhar. Punção somente nas áreas sombreadas 9 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Nunca devemos colher sangue capilar de um local edematoso (inchado). O edema contamina a amostra, diluindo o soro ou plasma, adicionando ainda líquidos que podem não estar normalmente presentes. Não se deve massagear previamente o local, especialmente para exames hematológicos, pois o número das células pode aumentar em até 5%. Quando não se obtém um bom fluxo de sangue, a tendência é de se espremer o local, para se poupar o paciente de uma punção. Esse péssimo hábito traumatiza as células, causando hemólise e elevando em até 25% a contagem dos glóbulos. Para a obtenção de maior volume de sangue, especialmente necessário no caso de determinações bioquímicas, o local da punção é previamente aquecido, para que se obtenha uma dilatação das arteríolas e dos capilares. Não se deve colher amostra para contagem hematológica da mesma punção feita para a determinação de tempo de sangramento ou de coagulação, pois a presença de qualquer coagulação, mesmo na intimidade dos tecidos, altera os resultados das contagens. Na obtenção de sangue capilar para a pesquisa de hemoparasitos, não há influência na massagem prévia ou posterior à punção, bem como no aparecimento de hemólise. Os tubos capilares usados são geralmente finos, devendo ser usados vários para a colheita de cada exame. Essa prática é recomendada para permitir a realização dos vários exames solicitados,para evitar a perda do material no caso da quebra de algum capilar, ou mesmo para evitar o uso de um capilar com sangue eventualmente hemolisado. Podem ser também usados capilares grossos, onde plasma ou soro é retirado com pipeta de Pasteur. Em geral são usados capilares adquiridos no comércio, com ou sem anticoagulantes, de diâmetro interno e comprimento padronizados. Locais de punção capilar AMOSTRA ARTERIAL O sangue arterial é usado para determinações de oxigênio, tensão de dióxido de carbono e determinações de pH. Estas determinações de gases sangüíneos são críticas na avaliação dos problemas de oxigenação encontrados em doenças como pneumonia, pneumonite e embolismo pulmonar. Os pacientes em oxigenação terapêutica prolongada ou respiração mecânica são monitorados para evitar extremos em oxigenação que podem produzir tanto anóxia como acidose respiratória ou oxigenação tóxica. Os pacientes com doença cardiovasculares e pacientes submetidos a grandes cirurgias, especialmente cirurgias cardíacas ou pulmonares são especialmente monitoradas em relação a hipóxia. A ocasião da coleta da amostra deve ser planejada com a equipe responsável pelo tratamento porque a condição do paciente preferentemente deve estar estável quando for realizado teste para gases de sangue, a fim de que seja obtido um real quadro da sua situação. Deve-se perguntar e conferir os dados da ficha clínica. É recomendável deixar o paciente em condição estabilizada por 15 a 20 minutos antes da coleta. As punções arteriais são tecnicamente mais diferentes que as venosas. O aumento da pressão nas artérias torna mais difícil parar o sangramento e o aparecimento do hematoma. O espasmo arterial é uma constrição reflexa que restringe o fluxo sangüíneo com possíveis efeitos sérios na circulação. Sintomas de mal- 10 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE estar temporário podem ser expressos em termos como dor, palpitações, dor à pressão, sensação dolorosa e câimbras. Por vezes é impraticável ou impossível obter sangue arterial de um paciente para análise dos gases sangüíneos. Nestas circunstâncias, outra fonte de sangue pode ser utilizada, mas é sempre bom lembrar que os resultados mais exatos são obtidos com o sangue arterial. Apesar do sangue venoso ser mais fácil de obter-se, ele usualmente reflete o equilíbrio de uma parte extremidade, não do corpo como um todo, não sendo recomendado para análise total, porque pO2 e sO2 venosas não proporcionam boa informação diagnóstica sobre captação de oxigênio. Se possível o paciente deve ser informado a respeito do procedimento e que pode ser doloroso se for necessárias uma punção. O paciente bem informado geralmente está menos ansioso e mais cooperativo. A hiperventilação pela ansiedade compromete a medida do pH e dos gases do sangue. Dependendo da organização do hospital e das necessidades clínicas do paciente há três métodos para coleta de amostra de sangue total arterial: • Punção arterial realizada com seringa de auto-enchimento munida de agulha. • Amostras de cateter arterial, tomadas por seringa de aspiração ou de auto-enchimento diretamente do cateter. • Amostras capilares tomadas com um tubo capilar de uma gota de sangue arterializado Há vantagens e desvantagens em cada um destes métodos: Veja o resumo no quadro abaixo: Vantagens Desvantagens Punção Arterial • Menor risco de erros do que cateter arterial e capilar, se realizada corretamente. • Pode ser realizada em situações de emergência • Sem necessidade de cateter • Necessita menor volume de sangue do que coleta de cateter • Dolorosa para o paciente.A hiperventilação pode alterar os valores dos gases do sangue • Pode ser difícil localizar as artérias. Risco de mistura de sangue arterial com venoso • Risco de complicações para o paciente. Nem sempre é recomendável realizar punção arterial • Problema na segurança do usuário. Risco de acidentes com picada da agulha • Necessita pessoal treinado/autorizado 11 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Cateter Arterial • Sem risco de mistura de sangue venoso com arterial • Fácil e rápida obtenção da amostra devido à presença do cateter • Indolor para o paciente • Eliminação do risco associado a punções múltiplas • Risco de infecção pelo cateter invasivo • Risco de coagulação determinando trombose ou êmbolo • Risco de anemia porque é retirado muito sangue (geralmente 5 a 6 ml por amostra incluindo perdas) • Risco de diminuição ou bloqueio do fluxo sangüíneo local determinando necrose • Risco de contaminação com bolhas de ar se for utilizada seringa de aspiração • Risco de contaminação com ar pelas conexões do cateter, etc. • Risco de erros de diluição se o cateter for drenado insuficientemente Amostra Capilar • Menos dolorosa • Pouco risco de complicações • Pequeno volume da amostra • Possível realizar na maioria dos casos • Risco de valores imprecisos de oxigênio • Risco de erros determinados pela hemólise • Dificuldade técnica na realização • Sangue insuficiente para nova análise ou outros testes É necessário que a coleta seja feita por profissional qualificado. Há sempre o risco de que uma punção arterial possa determinar complicações que bloqueiem a artéria. Desse modo, é importante conferir se existe fluxo sangüíneo colateral à área suprida pela artéria da qual se planeja puncionar, a fim de que o tecido vizinho possa ainda ser suprido com sangue no caso da artéria ser bloqueada por complicações. Além disso, deve ser tomado grande cuidado para não lesar acidentalmente o periósteo durante as punções, porque isso determina complicações. Há diversas artérias que estão disponíveis para punção: • A artéria Radial é geralmente o local preferido em adultos devido a sua localização superficial. A artéria Ulnar proporciona excelente fluxo colateral. No entanto, alguns pacientes não apresentam artéria Ulnar bem permeável de modo que a perfusão deve ser confirmada pela realização do “Teste de Allen”. Neste teste, é aplicada uma pressão no pulso para bloquear as artérias Ulnar e radial. A mão do paciente é fechada fortemente para forçar o sangue originado da mão. Quando a mão ficar pálida, a pressão sobre a artéria Ulnar é liberada e observa-se a região palmar e os dedos. Se a mão ficar avermelhada dentro de segundos, isto indica que está presente perfusão total através da artéria Ulnar confirmando que é seguro puncionar a artéria Radial. 12 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE • A artéria Braquial geralmente não é utilizada. Ela tem péssimo fluxo colateral, está próxima a periósteo, veias e nervos, e pode ser difícil de ser comprimida. A artéria braquial é mais difícil de puncionar, pois, ela “dança” porque os músculos e tendões não sustentam a artéria. Além disso, devido a sua posição profunda, existe maior risco de lesão das estruturas vizinhas e hemorragia após punção. • A artéria Femoral é grande e fácil para se puncionar, porém, sua posição faz com que seja pouco prática e difícil para antiassepsia da área, aumentando assim o risco de infecção. O suprimento de sangue para perna pode estar comprometido se a arterial Femoral for bloqueada porque o fluxo sangüíneo colateral é limitado. Além disso, é difícil e despende tempo comprimir a artéria femoral. As punções femurais também devem ser evitadas em pacientes idosos porque a arteriosclerose é mais prevalente na parte inferior do corpo dos idosos e em pacientes que se submetem à cirurgia vascular. Crianças demenos de quatro anos de idade preferentemente não devem ser puncionadas nas artérias femorais devido ao risco de infecção e de lesão das estruturas adjacentes. • A artéria Dorsal do pé é a última alternativa, porém, só raramente é utilizada para punção arterial. 13 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE AMOSTRA VENOSA O sangue venoso é usado para a maioria dos exames de laboratório e fornece quantidade apreciável de amostra. A colheita é feita com seringas de plásticos, descartáveis e estéreis ou utilizando o sistema "a vácuo". O sangue venoso é colhido geralmente da veia cubital, na dobra do antebraço, em adultos e em crianças maiores, ou então na veia jugular, em crianças pequenas. Porém outros locais podem ser puncionados, quando falha a punção nestes locais de escolha. Em pacientes obesos pode ser mais fácil o acesso às veias do dorso da mão. Essas veias são por vezes mais calibrosas do que as veias da dobra do cotovelo, porém são extremamente móveis em relação aos tecidos circunjacentes, o que dificulta a penetração da agulha em seu interior. Além disso, a perfuração da pele do dorso da mão é bem mais dolorosa do que a prega do cotovelo. Após a punção, nestas veias, a hemostasia deve ser bem mais demorada, visto que, freqüentemente há extravasamento de sangue e formação de hematomas. Para se conseguir sangue da veia jugular externa, é necessário imobilizar bem o paciente (principalmente crianças), enfaixando-o com um lençol, colocando-o em posição inclinada, com a cabeça ao nível inferior do tronco. Roda-se a cabeça da criança para o lado oposto da punção, o que permite visualizar a veia. Provoca-se o choro da criança, para que aumente a estase venosa. Se adulto, o paciente deverá ficar sentado e fazer esforço respiratório, assoprando com a boca e nariz fechados. A agulha deve penetrar diretamente sobre a veia, que nessa região é bem superficial. Após a punção deve-se manter o paciente sentado e fazer uma compressão demorada. A veia jugular interna só é puncionada quando não for possível a colheita de sangue nas veias. Após imobilização do paciente (criança pequena) e colocando-o na posição descrita para a colheita de sangue da veia jugular externa, toma-se como ponto de referência o músculo esternoclidomastóideo. A agulha deve penetrar no ponto que coincide com a metade da distância entre a origem e inserção do músculo, ao nível de sua borda posterior. A direção da agulha, após a penetração da pele, deve ser com a ponta voltada para a fúrcula esternal, mantendo-se quase paralela à pele e aprofundamento um pouco mais de 0,5 cm. Se não fluir sangue, puxar a agulha, lentamente, até a obtenção do material. A posição da criança deverá ser mantida até o final da coleta. Após a colheita, fazer compressão local por alguns minutos, com a criança livre de contenção. A veia femoral é uma opção atualmente contra-indicada, sendo sua punção utilizada apenas em casos excepcionais, onde todas as outras possibilidades falharam. O paciente deve ficar em decúbito dorsal horizontal (deitado de costas), com a perna do mesmo lado da punção semifletida, devendo o joelho ficar ao nível da cama. Quando o paciente for uma criança, devemos imobilizá-la nessa posição com auxílio de um auxiliar (não convém ser a mãe ou o pai da criança). A colheita no seio longitudinal é feita por médico, quando a criança ainda apresenta a fontanela bregmática aberta. A punção é feita ao nível do ângulo posterior da fontanela. A agulha penetra num ângulo de 14 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 30º a 90º sendo introduzida apenas uns 3 milímetros, com cuidado de não atingir o espaço subaracnóideo. Após colheita, a compressão deve ser delicada, mas eficiente, até parada do sangramento. ANTICOAGULANTES INFLUÊNCIA DA COAGULAÇÃO Para se entender a necessidade de uma colheita de sangue rápida e com agulha bem afiada, é necessário estudar a coagulação do sangue, verificando o que acontecem desde a entrada da agulha no vaso sangüíneo ou da penetração da lanceta através da pele, até a formação do coágulo. Assim, vejamos o que é hemostasia e coagulação e como se processam ambos. Hemostasia é o processo pelo qual o sangue permanece líquido no sistema vascular, apesar das lesões que venha a sofrer. Fazem parte da hemostasia, os vasos, as plaquetas, os fatores de coagulação, o sistema anticoagulante e um sistema lítico. Coagulação é a conversão do sangue no estado líquido em um coágulo firme. É a fase da hemostasia que envolve a transformação de uma proteína existente no plasma, o fibrinogênio, em fibrina. Essa fibrina vai formar fibras, que se emaranham, envolvem as hemácias, os leucócito, e as plaquetas. A hemostasia é regulada por três tipos de mecanismos: - Os extravasculares incluem a constituição e a elasticidade dos tecidos na periferia dos vasos. - Os vasculares relacionam-se à elasticidade e tônus da parede vascular. -Os intravasculares são principalmente aqueles associados com substâncias envolvidas no processo de coagulação do sangue. Após a lesão de um vaso sangüíneo, o processo hemostático logo intervém para reparar o ferimento e deter a hemorragia, segundo as etapas, a seguir: 1ª Etapa - Resposta neural 2ª etapa - Formação da rolha hemostática primária de plaquetas 3ª Etapa - Conversão das rolhas primárias em rolhas estáveis permanentes reforçadas por uma rede de fibrina como suporte 4ª Etapa - Lise da fibrina Vamos, então entender melhor cada etapa destas. 1ª ETAPA - RESPOSTA NEURAL Inicialmente ocorre uma vasoconstricção reflexa que diminui o sangramento; 2ª ETAPA - FORMAÇÃO DA ROLHA HEMOSTÁTICA PRIMÁRIA DE PLAQUETAS 15 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE São massas de plaquetas que se acumulam no local onde houve lesão à parede do vaso como resultado da aderência das plaquetas, primeiro ao colágeno no tecido endotelial exposto (adesão) e depois entre si (coesão ou agregação). O colágeno e os primeiros traços de trombina, que se formam no local da lesão, estimulam as respostas plaquetárias, através da liberação de fosfato de adenosina (ADP), serotonina e tromboxane A2, que estimulam à coesão. As rolhas primárias são instáveis e facilmente dissolvidas. 3ª ETAPA - CONVERSÃO DAS ROLHAS PRIMÁRIAS EM ROLHAS ESTÁVEIS PERMANENTES REFORÇADAS POR UMA REDE DE FIBRINA COMO SUPORTE À medida que aumenta a concentração de trombina do local da lesão, as plaquetas frouxamente aderidas nas rolhas primárias são consolidadas em rolhas estáveis. Uma contração em direção central da massa de plaquetas faz com que fiquem compactas, parecendo perder suas bordas distintas. Forma-se fibrina, primeiro na superfície das plaquetas agregadas e depois como uma rede que se espalha para fora, que reforça as rolhas e contribui para a massa do selo hemostático. Estes eventos necessitam da produção de quantidades efetivas de trombina nas reações de coagulação do sangue. Para isso, são necessárias substâncias denominadas de “Fatores da Coagulação”. As reações nas quais estes fatores tomam parte são de natureza enzimática, pois muitos desses fatores são proenzimas, sintetizadas independentemente. Encontram-se no sangue inativadas, devendo ser ativadas para poderem agir como enzimas e se tornarem biologicamente ativas durante o processo de coagulação. A ativação de cada fator faz-se em seqüência de fases em que cada enzima formada reage com seu substrato específico, convertendo-o em enzima ou fator ativo. Em virtude dessa seqüência de transformações proenzima-enzima, comparávela uma cascata, esta teoria dói denominada “Teoria da Cascata” (Mac.Farlane, 1964). Por instrução do Comitê Internacional para Nomenclaturas dos Fatores de Coagulação, foram eles denominados pelos algarismos romanos de I a XIII, com exclusão do VI (acelerina) que não é mais considerada como um fator coagulatório. No entanto existem sinônimos consagrados pelo uso, relacionados conforme quadro abaixo: FATORES SINÔNIMOS I Fibrinogênio II Protrombina III Tromboplastina IV Íons Cálcio V Fator lábil ou proacelerina VII Fator estável ou proconvertina VIII Fator anti-hemofílico A (globulina anti-hemofílica) IX Fator anti-hemofílico B (Fator de Christmas ou componente tromboplástico do l )X Fator Stuart ou Stuart-Power XI Fator anti-hemofílico C (Antecedente tromboplástico do plasma) XII Fator Hageman (Fator de contato) XIII Fator estabilizador da fibrina 16 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE A coagulação sangüínea se processa de dois modos diferentes, constituídos pelo sistema intrínsico e o extrínsico. No sistema extrínsico, o mecanismo da coagulação é ativado por substâncias procedentes dos tecidos (tromboplastina tecidual ou fator III), ausentes normalmente no sangue. O sistema intrínsico é ativado, in vivo, por lesão vascular ou por contato com colágeno, ou mesmo fosfolipídeos liberados pelas plaquetas. In vitro, á ativado por contato com superfícies diferentes do endotélio vascular, como vidro, o caolim e outras substâncias. 4ª ETAPA - LISE DA FIBRINA À medida que o trombo de fibrina cresce, são desencadeadas reações para dissolver a fibrina e restringir o trombo à área lesada da parede vascular. Nestas reações fibrinolíticas, a proenzima plasmática, o plasminogênio, liga-se à fibrina e depois é ativada a plasmina por um ativador liberado pelas células endoteliais. USO DE ANTICOAGULANTES Existem substâncias que tem a propriedade de impedir a formação do coágulo sanguíneo. Estas substâncias interferem na cadeia de reações dos fatores da coagulação, impedindo a sua progressão ou alternativamente, inibem a produção hepática de fatores essenciais, reduzindo a sua concentração no sangue circulante. As substâncias que, quando adicionadas ao sangue, impedem a sua coagulação são conhecidas como anticoagulante Em condições normais há equilíbrio entre as substâncias pró-coagulantes e as substâncias anticoagulantes do sistema de coagulação, que mantém o sangue na forma líquida. Em determinadas condições o 17 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE equilíbrio fisiológico pode se romper; nessas circunstâncias formam-se coágulos no interior dos vasos sanguíneos, podendo causar, ao final, tromboses e embolias. Algumas substâncias podem impedir a coagulação do sangue após a sua retirada do interior dos vasos sanguíneos, embora não tenham essa propriedade quando administradas aos indivíduos. Essas substâncias são chamadas de anticoagulantes “in vitro”. Esses anticoagulantes são utilizados pelos bancos de sangue, para impedir a coagulação do sangue coletado nas bolsas plásticas, para as transfusões; ou pelos laboratórios, quando é necessário obter sangue total ou plasma. São compostos químicos conhecidos como agentes quelantes, ou seja, agentes que retiram o cálcio do sangue. Os agentes quelantes mais comuns são o EDTA (edatanil cálcio-dissódico), fora de uso na atualidade, o ACD (mistura de ácido cítrico, citrato de sódio e dextrose) e o CPD (citrato, fosfato e dextrose). As substâncias ou misturas quelantes, reagem com o cálcio ionizado do sangue formando sais fixos de cálcio. Este mecanismo impede a ação do cálcio (Fator IV) na conversão da protrombina em trombina, nas reações da via comum da coagulação; a cascata da coagulação não se completa. Esta é, praticamente, a única aplicação dos anticoagulantes “in vitro”. As substâncias que quando administradas aos indivíduos impedem a formação de coágulos no interior do sistema circulatório, são os anticoagulantes “in vivo”. Estes anticoagulantes são os mais importantes na prevenção e no tratamento das tromboses e embolias. São a heparina e os compostos cumarínicos. EDTA O EDTA (ácido etileno-diamino-tetra-acético) é encontrado sob a forma de ácido livre, sais di, tri ou tetrassódico ou sal dipotássico, sendo este último, o mais recomendado, por ser mais solúvel. Como visto antes, age como quelante de cálcio, que ao reagir com este forma um sal insolúvel, bloqueando a formação de trombina e, portanto, o resto da coagulação. Os sais dissódicos e dipotássicos do EDTA apresentam propriedades conservadoras das células sanguíneas. Impedem a aglutinação das plaquetas no sangue, permitindo estimativa grosseira de seu número no esfregaço corado, feito logo após a colheita do sangue. Não serve para estudos da coagulação, pois aumenta o tempo de protrombina. Pode ser usado em muitas determinações bioquímicas, porém, prejudica a dosagem de várias enzimas, como, creatino-fosfoquinase, fosfatase alcalina, leucino-transpeptidase, inibindo-as, ou aumentando a piruvato-quinase. É utilizado na concentração de 1 a 2 mg/ml de sangue. Além de 2 mg/ml, especialmente se a amostra ficar fora da geladeira, há um enrugamento e uma degeneração de hemácias e leucócitos, uma grande diminuição do hematócrito e aumento da contagem de plaquetas. O EDTA é considerado atualmente o anticoagulante de escolha na hematologia. OXALATOS São utilizados os oxalatos de potássio, de sódio, de amônio ou de lítio, sendo mais comumente empregado o oxalato de potássio. Freqüentemente são empregadas misturas de dois sais. Eles agem na remoção de cálcio pela precipitação. São, ainda, utilizados, como agentes descalcificantes de ação reversível; os oxalatos de sódio e de potássio são muito usados nos estudos de coagulação. É utilizado na quantidade de 1 a 2 mg/ml de sangue. Se o sangue colhido for abaixo do previsto, a concentração relativa do oxalato aumenta acima de 3mg/ml sendo inevitável o aparecimento de hemólise. Entre as limitações do uso de oxalatos estão a inibição da fosfatase ácida, da amilase e das desidrogenases (lactato, hidroxibutirato e isocitrato). Os oxalatos alteram as concentrações dos componentes do plasma devido à saída de água das hemácias. Essa saída aumenta com a concentração de anticoagulante. Diminuem, rapidamente, em 5 a 10%, o valor do hematócrito e de certos componentes do plasma. Esfregaços para estudos hematológicos, feitos com sangue oxalatado, não são satisfatórios, uma vez que os neutrófilos apresentam distorções, como vacuolização citoplasmática e nuclear. O núcleo torna-se endentado, irregular, em forma de roseta, o que dificulta ou impede a classificação da célula. Sendo tóxicos, não são utilizáveis nas transfusões de sangue. 18 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Os diferentes oxalatos se comportam de maneira diferente. O de lítio é o mais indicado para dosagem de ácido úrico pelo método do fosfotungstato. A mistura de Heller Paul (3 partes de oxalato de amônio e 2 partes de oxalato de potássio), na proporção de 2 mg da mistura por ml de sangue, é utilizável para a demonstração do hematócrito e na hemossedimentação, desde que o período entre a colheita e a realização do exame seja inferior a 3 horas. Enquanto que o sal de amônio tende a aumentar o volume das hemácias, o de potássio tende a diminuí-lo. Oxalatos, no entanto, não servem para a colheita de amostras de sangue para a determinação do nitrogênio não-protéico ou do nitrogênio uréico pelo método da urease, porque têm um conteúdo em amônia.CITRATOS Os citratos são muito usados na colheita de amostra para várias provas de coagulação, principalmente as que incluem plaquetas e também para a determinação da velocidade de hemossedimentação. São utilizados na concentração de 5 mg/ml de sangue. Deve-se fazer uso de soluções preparadas recentemente ou estéreis, pois, são muito suscetíveis a contaminação por fungos, com baixa de sua atividade. No mecanismo da coagulação, os citratos são pouco usados nas determinações bioquímicas. Inibem a fosfatase alcalina e a amilase. Em bancos de sangue é muito usada a mistura ACD (ácido cítrico, citrato e dextrose). No laboratório, seu uso é limitado, sendo utilizável apenas para o estudo da coagulação. HEPARINA A heparina foi descoberta acidentalmente, em 1916, por um estudante de Medicina, Jay McLean que, na época, investigava extratos de tecidos do coração e do fígado. Foi encontrado um extrato de tecido hepático, capaz de retardar a coagulação do plasma. A substância responsável por aquele efeito, em virtude de ter sido encontrada no fígado, foi batizada como heparina. A heparina é um mucopolissacarídeo sulfatado, com grande quantidade de cargas elétricas negativas. A heparina para uso clínico é extraída do pulmão de bovinos ou da mucosa intestinal de porcinos. A heparina não é uma substância pura, única, e sim uma mistura de diversas substâncias afins com pesos moleculares que variam de 3.000 a 40.000 Dalton. A grande maioria das moléculas, contudo, se situa na faixa ente os 10.000 e 20.000 Dalton. A atividade anticoagulante da heparina se deve às moléculas de maior peso molecular; as moléculas menores não têm efeito anticoagulante. A heparina administrada a um indivíduo, interfere nas etapas finais da cascata da coagulação, que consistem na conversão da protrombina (fator II) em trombina que, por sua vez, promove a conversão do fibrinogênio (fator I) em fibrina, originando o coágulo. A heparina impede a transformação da protrombina em trombina; dessa forma a conversão do fibrinogênio em fibrina, não ocorre. Impede também a aglutinação de plaquetas. A heparina não é absorvida por via oral; sua administração preferencial é venosa. O efeito anticoagulante é muito rápido; surge em cerca de 1 minuto. Os níveis plasmáticos da heparina se reduzem, consideravelmente, nas primeiras duas horas após a administração. A velocidade de desaparecimento da heparina no sangue é estimada em aproximadamente 50% por hora. O padrão mais usado para quantificar a heparina é o da farmacopéia internacional (Unidades Internacionais). Na prática, considera-se que 1 miligrama da solução de heparina corresponde à atividade de 100 U.I. O efeito anticoagulante da heparina é monitorizado através de testes de coagulação, como o tempo de coagulação (Lee White), o tempo de coagulação ativado (TCA) ou o tempo parcial de tromboplastina (PTT). A anticoagulação eficaz corresponde ao tempo de coagulação 2 a 3 vezes o valor normal. O teste de coagulação mais usado é o tempo de coagulação ativado (TCA), que consiste em acelerar o tempo de coagulação do sangue, pela mistura com óxido de silício (celite). O valor normal do TCA varia de 80 a 120 segundos. O efeito colateral mais freqüente do uso da heparina é o sangramento, que pode ocorrer em 1 a 37% dos casos. No laboratório, geralmente, é utilizada na concentração de 01 gota de heparina na concentração de 5.000 U.I.ml para cada 5 ml de sangue. Porém, mesmo em concentrações bem maiores que as recomendadas, a 19 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE heparina não altera o volume das hemácias, sendo muito útil quando se quer evitar hemólise. É o melhor anticoagulante para a prova de fragilidade de hemácias. No restante, além de ser mais cara é inferior ao EDTA. A heparina possui algumas limitações: inibe a fosfatase ácida, a desidrogenase hidroxibutírica e a muramidase. Como as preparações comerciais estão freqüentemente contaminadas por fosfatos, não serve para a dosagem de fosfatos. Promovendo a agregação de leucócitos, ela não serve para a contagem dos mesmos. Não pode ser utilizada para preparação de lâminas para hematologia, pois as colorações ficam azuladas. Quando usada em cultura de linfócitos, é necessário que seja usada uma heparina especial livre de toxidade e esterilizada por filtração. A heparina não pode ser esterilizada por autoclavação, pois se inativa. Quando seca, mesmo à temperatura ambiente, o resíduo tende a ficar insolúvel, causando coagulação do sangue colhido. ANTÍDOTO DA HEPARINA A protamina é o antídoto específico para a neutralização do efeito anticoagulante da heparina; é a única substância em uso com aquela finalidade. A protamina é um complexo protéico com cargas elétricas fortemente positivas, de baixo peso molecular, encontrada no esperma ou testículos de peixes, mais especificamente do salmão. A protamina é preparada sob a forma de sulfato, que combina ionicamente com a heparina para formar um complexo estável desprovido de atividade anticoagulante. A protamina é apresentada em ampolas de 5ml contendo 50mg de protamina (10mg para cada 1 ml). A quantidade de protamina necessária para a neutralização da heparina varia de 75 a 120% da dose de heparina em circulação (média 100%). A protamina é usada apenas quando se deseja a reversão imediata dos efeitos da heparina. Nesses casos a protamina deve ser administrada bastante diluída e lentamente, por via endovenosa. A administração rápida da protamina pode causar hipotensão arterial severa. DERIVADOS CUMARÍNICOS As substâncias derivadas dos cumarínicos, como o dicumarol ou warfarin, deprimem os níveis plasmáticos da protrombina e dos fatores VII, IX e X. Os cumarínicos competem com a vitamina K no metabolismo hepático formador daqueles fatores da coagulação, principalmente a protrombina. Em conseqüência a produção dos fatores ativos (com a vitamina K na molécula) fica reduzida. O efeito anticoagulante dos derivados cumarínicos se deve à redução da concentração da protrombina no sangue circulante. Os cumarínicos são administrados por via oral. O seu efeito anticoagulante surge lentamente, sendo máximo em 72 horas. A suspensão da administração do medicamento cessa os seus efeitos em 2 a 4 dias. O retorno da atividade normal do sistema de coagulação pode ser acelerado pela administração da vitamina K, que é o antídoto específico dos derivados cumarínicos. A forma comercial em uso é o Marevan, apresentado em comprimidos de 5mg. A dose anticoagulante eficaz é variável entre os indivíduos; em média surge com o uso de 2,5 a 5 mg. diários do produto comercial. Os anticoagulantes cumarínicos são usados por pacientes que necessitam de proteção antitrombótica duradoura, como os portadores de válvulas cardíacas mecânicas, por exemplo. O efeito dos cumarínicos é controlado pela determinação do tempo ou da atividade de protrombina (TAP). Esta, habitualmente é mantida em cerca de 30 a 40% do normal, para um efeito anticoagulante máximo. Para o controle do trombo-embolismo pulmonar e prevenção de recorrências, habitualmente inicia-se a heparina, logo ao ser firmado o diagnóstico e se mantém a anticoagulação, em longo prazo, com os derivados cumarínicos. 20 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE ANTIAGREGANTES PLAQUETÁRIOS A adesão e agregação plaquetárias são as etapas iniciais na formação do trombo plaquetário, nos mecanismos da hemostasia. Nas condições que se acompanham de alteração da parede interna dos vasos, como na aterosclerose, por exemplo, procura-se prevenir a formação de trombos pelo uso de substâncias que inibem a agregação das plaquetas. Estas substâncias não interferemcom os mecanismos da coagulação, não se constituindo, portanto, em anticoagulantes. São mais adequadamente classificadas como anti-agregantes plaquetários. A substância mais usada como anti-agregante é a aspirina; seu efeito anti-agregante independe das suas propriedades analgésicas e antipiréticas. A aspirina tem sido amplamente utilizada na prevenção de trombose coronariana, principalmente em indivíduos portadores de aterosclerose. Seu grande inconveniente é a agressão à mucosa gástrica. CONFECÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO. MICROSCOPIA ESFREGAÇOS Para o estudo hematológico diferencial das células sanguíneas é necessário utilizar métodos que possibilitem sua visualização, seja através de microscopia ou através de contadores eletrônicos. Na microscopia, utilizamos o esfregaço como instrumento para avaliação hematológica. A confiabilidade das informações obtidas depende principalmente em esfregaços bem feitos. O esfregaço satisfatório deve ser fino e homogêneo, de margens livres. A espessura do esfregaço está na dependência: 1. Da rapidez do deslizamento da lâmina. Quanto mais lento, tanto mais fino é o esfregaço; 2. Da variação do ângulo entre as duas lâminas. Quanto menor o ângulo mais fino é o esfregaço; 3. Da pressão sobre a lâmina. Quanto maior a pressão, tanto mais fino é o esfregaço; 4. Da extensão do esfregaço. Quanto maior o esfregaço, tanto mais fino ele é; 5. Do tamanho da gota de sangue. Quanto menor a gota, tanto mais fino é o esfregaço. COLORAÇÃO Quando se observam ao microscópio preparações de material biológico fresco, pouco se distingue da estrutura interna das células. As diferentes estruturas celulares apresentam pouco contraste óptico, isto é, têm mais ou menos grau de transparência á luz, de modo que a aparência do conteúdo celular é homogênea. Para superar esse problema os citologistas desenvolvem técnicas de coloração, que consistem em mergulhar a célula em uma substância denominada corante, capaz de tingir diferencialmente uma ou mais partes celulares. Além disso, a maioria das estruturas celulares só pode ser vista ao microscópio comum se a célula for previamente tratada por corantes. Cada corante reage apenas com determinadas estruturas da célula, fornecendo um contraste que facilita sua observação. Para observarmos urna célula viva, usamos certos corantes que não destroem sua estrutura, os chamados corantes vitais. 21 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Para observarmos materiais biológicos por longo tempo e várias vezes, devemos usar substâncias que mantenham e conservam a célula, alterando o mínimo possível sua estrutura. Tais substâncias são chamadas fixadores e permitem a conservação das células para futuras observações (álcool e formol, por exemplo). Dentre as técnicas mais usadas para coloração estão a de Romanowsky e seus derivados (May-Grünwald, Giemsa, Leishman, Wright e o panótico). Hoje, na rotina laboratorial se faz freqüentemente o uso da coloração panótica, por ser um método barato, por já estar pronto para uso e por ser simples de ser realizado. Conforme já assinalado, os elementos celulares do sangue têm afinidades eletivas para as cores de anilina ácida, básica e neutra. O núcleo das células toma as cores básicas, como o azul de metileno, enquanto que os corantes ácidos, como a eosina agem sobre os elementos citoplasmáticos. Os corantes neutros ou policrômicos, que são a mistura de ácidos e básicos, coram além dos constituintes acidófilos e basófilos, também outros componentes de reação neutrofílicas. Pertencem a esse grupo os corantes de Romanowsky. MICROSCOPIA Acredita-se que o microscópio tenha sido inventado em 1951 por Hans Janssen e seu fiIho Zacharias, dois holandeses fabricantes de óculos. Tudo indica, porém, que o primeiro a fazer observações microscópicas de materiais biológicos foi o holandês Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Os microscópios de Leeuwenhoek eram dotados de uma única lente, pequena e quase esférica. Nesses aparelhos ele observou detalhadamente diversos tipos de material biológico, como embriões de plantas, os glóbulos vermelhos do sangue e os espermatozóides presentes no sêmen dos animais. Foi também Leeuwenhoek quem descobriu a existência dos “micróbios” , como eram antigamente chamados os seres microscópicos, hoje conhecidos como microorganismos. Se dois pontos estiverem separados por uma distância igual ou superior a 0,1 mm, o olho humano será capaz de perceber dois pontos distintos. A uma distância menor, veremos apenas um único ponto. Isso significa que o olho humano tem um poder de resolução de 0,1 mm. O microscópio óptico comum é um instrumento formado por um sistema de lentes que permite um poder de resolução de 0,2 µm, cerca de quinhentas vezes maior do que o olho humano. Assim, com o recurso do microscópio podemos aumentar a imagem de um objeto 1.000 ou 1.500 vezes, sem que ela perca a nitidez. Na década de 40, a Citologia tomou um impulso muito grande com o aperfeiçoamento de utilização do microscópio eletrônico, inventado em 1931. Nesse instrumento, o material é atravessado por um feixe de elétrons, em vez de luz, e a imagem pode ser observada numa tela fluorescente (como urna tela de TV) ou numa fotografia. Com essa técnica, é possível alcançar um poder de resolução mil vezes maior do que o do microscópio óptico, ou seja, aproximadamente 500.000 vezes o do olho humano. As estruturas podem então ser aumentadas de 100.000 a 1 milhão de vezes sem perder a nitidez. Com a utilização desse aparelho e de outras técnicas sofisticadas, podemos obter informações mais detalhadas acerca da estrutura e da composição química da célula, além de seus processos metabólicos. Recentemente foi desenvolvido o microscópio de varredura, no qual o feixe de elétrons, em vez de atravessar o objeto, varre-o como se fosse urna pessoa sentindo, com os dedos, o relevo de urna superfície. Desse modo, conseguimos uma imagem formada por elétrons refletidos e não por elétrons que atravessam o material. Finalmente, em 1981, surgiu o microscópio de tunelamento eletrônico, capaz de aumentar as estruturas até 100 milhões e fornecer imagens de átomos e moléculas. A qualidade de um microscópio não depende apenas da ampliação, mas também do poder de resolução, que é a capacidade de distinguir pontos situados muito próximos no objeto observado. Quanto maior esta capacidade, melhor a definição da imagem. O poder de resolução de um microscópio óptico tem limite. Se dois pontos estiverem a menos de 0,25 micrometro (um 1xl0-3 mm) um do outro, eles serão vistos como um único ponto. Essa distância é o limite de resolução. 22 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Tamanho relativo das Células que podem ser vistos na microscopia FIGURA DO MICROSCÓPIO E SEUS COMPONENTES 1. Ocular (São formadas por um sistema de lentes que ampliam a imagem recebida através das objetivas e projetam sobre a retina.). 23 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 2. Objetivas e Revólver (Projeta uma imagem aumentada do objeto, em direção à ocular. Chama-se objetiva a seco quando são empregadas, usando-se ar entre a objetiva e o objeto examinador e, chama-se objetivas de imersão quando se coloca um óleo transparente.). 3. Platina 4. Charriot 5. Macrométrico 6. Micrométrico 7. Diafragma no condensador (Regula a quantidade de luz que entra no condensador) 8. Condensador (É o conjunto de lentes situado abaixo da platina, concentra e fornece a luz necessária à iluminação do objeto em estudo. Projetaum cone de luz sobre o objeto, e é tão importante quando as outras lentes do microscópio.). 9. Botão do condensador 10. Dois parafusos centralizadores do condensador. 11. Fonte de luz. 12. Controle de iluminação. 13. Diafragma de campo (alavanca no lado esquerdo do microscópio). 14. Dois parafusos de ajuste da lâmpada (esquerdo e direito). 15. Focalizadora da lâmpada (alavanca no lado direito do microscópio - não visível na fotografia). SÉRIE VERMELHA ERITROPOIESE A eritropoiese é o processo natural de produção de eritrócitos que ocorre na medula óssea. Especificamente ocorre a partir dos Proeritroblastos, que são grandes células com nucléolos e citoplasma discretamente disformes. A partir desta célula originam-se por reprodução celular o Eritroblasto basófilo, que após 24/48 horas se transforma por maturação em Eritroblasto policromático. Esta célula vive em média 24 horas e se diferencia em Eritroblasto ortocromático que 12 horas depois, perde o seu núcleo e dá origem ao reticulócito. O reticulócito é um eritrócito grande e imaturo, com RNA ribossômico em variáveis quantidades em seu citoplasma. No adulto normal, o número dos reticulócitos oscila entre 0,5 a 1,5%. Na criança, nos primeiros dias de vida, pode atingir 10%. Encontra-se também aumentado na gravidez. O número de reticulócitos na circulação periférica constitui índice do grau de regeneração dos eritrócitos na medula óssea. Seu aumento indica hiperatividade da medula e a diminuição a hipoatividade. O reticulócito tem um período de vida médio de 3 dias, após o que se transforma em eritrócito e é liberado da medula óssea para o sangue circulante. ERITROBLASTOS E RETICULÓCITOS PRÓ-ERITROBLASTO – Este precursor das hemácias mais precocemente reconhecível é uma célula grande, com citoplasma azul e um núcleo que ocupa a maior parte da célula. O núcleo apresenta uma cromatina punctata e contém de um a muitos nucléolos pequenos e azuis. ERITROBLASTO BASOFÍLICO – A célula perdeu seus nucléolos e se vê uma aglutinação inicial de cromatina do núcleo. O citoplasma ainda é de azul profundo, por causa de seu elevado conteúdo de RNA. 24 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE ERITROBLASTO POLICROMÁTICO – A célula e seu núcleo são menores. São vistos grandes agrupamentos de cromatina nuclear. A cor do citoplasma varia de púrpura acinzentado a rosa purpúrico, refletindo o conteúdo decrescente de RNA e o aumento da hemoglobina. ERITROBLASTO ORTOCROMÁTICO – A célula é ainda menor, e o núcleo se transformou em uma bola maciça e preta. O citoplasma é definitivamente róseo RETICULÓCITO – A Célula, agora quase madura, já expeliu o núcleo. No entanto, ainda contém RNA residual em seu citoplasma, que pode ser precipitado sob a forma de uma rede de reticulina por certos corantes supravitais. É isto que lhe dá o nome de reticulócito. A coloração para a rede de reticulina é usada para distinguir o reticulócito da hemácia completamente madura. Proeritroblastos Eritroblasto Basofílico Eritroblasto Policromático 25 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Eritroblasto Ortocromático Reticulócitos ERITRÓCITO MADURO O eritrócito (ou hemácia ou glóbulo vermelho) ao atingir sua maturação na medula óssea, passa ao sangue periférico ou circulante, e vive, 120 dias em média. Sua principal função é o transporte de oxigênio ligado à hemoglobina. A hemoglobina é uma proteína localizada dentro do eritrócito. Em um eritrócito há cerca de 300 milhões de moléculas de hemoglobinas que ocupam 95% da célula eritrocitária. Não existem organelas intracelulares tais como mitocôndrias, lisossomos e aparelho de Golgi. É altamente dependente de glicose como fonte de energia, sua membrana contém transportadores de glicose de elevada afinidade. A glicólise produzindo lactato é o sítio de produção de ATP. Como não existem mitocôndrias nos eritrócitos, não ocorre produção de ATP por fosforilação oxidativa. A hemácia não precisa de insulina para o ciclo da glicose. Os eritrócitos no sangue circulante são anucleados e imóveis. Apresentam-se como discos circulares e bicôncavos com um halo central claro que se coram em róseo em um esfregaço normal e possuem cerca de 6 a 9 µm e VCM situado entre 80 a 100 fl. A biconcavidade aumenta a área de superfície, facilitando assim, as trocas de oxigênio e de dióxido de carbono transportados pelos eritrócitos. Para facilitar o transporte de dióxido de carbono, os eritrócitos contêm a enzima anidrase carbônica. A membrana do eritrócito constitui de uma bicamada composta de lipídeos em cerca de 50%, e de proteínas em 50%. Espectrina, anquirina e outras proteínas periféricas da membrana auxiliam a determinar a forma e a flexibilidade do eritrócito. Os outros componentes do eritrócito são: proteínas do estroma e membrana celular, lipídeos, fosfolipídio (lecitina, cefalina e esfingomielina), colesterol livre, ésteres de colesterol, gordura neutra, vitaminas funcionado como coenzima, glicose para energia, enzimas (colinesterase, fosfatase, anidrase carbônica, peptidadases e 26 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE outras relacionadas com a glicólise), minerais (eletrólitos) tais como enxofre, fósforo, cloro (principal ânion intracelular), magnésio, sódio e potássio. Hemácias Normais ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS a. POLICROMASIA: São reticulócitos recém-formados liberados para a circulação sem o amadurecimento prévio de 1 a 2 dias na medula, estando assim, associados a uma produção aumentada de eritrócitos estimulada pela eritropoetina e como contêm RNA precipitável se coram no esfregaço diferentemente das hemácias normais. Estando em grande número sugere fortemente hemólise e em pequena quantidade em leucemias, anemias refratárias, carcinoma invasor da medula, etc. 27 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE b. HIPOCROMIA: Resultante de uma concentração de hemoglobina reduzida em ferroprivas, etc. c. ANISOCITOSE: Variação de tamanho das hemácias, geralmente em anemias normocíticas. 28 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE d. MICROCITOSE: Representa uma evidência morfológica de uma capacidade diminuída dos precursores das hemácias de produção de hemoglobina, resultado de deficiência de ferro, de doença crônica ou de uma síndrome talassêmica. e. MACROCITOSE: Resultam da omissão de divisões durante a maturação dos eritrócitos e são encontrados em distúrbios da eritropoiese com maturação nuclear anormal e também quando a produção de hemácias é estimulada pela eritropoetina. A macrocitose pode ser visualizada em anemias megaloblásticas, mielofibrose com metaplasia mielóide extramedular, doenças hepáticas, pacientes tratados com agentes quimioterápicos citotóxicos, em algumas anemias aplasticas, etc. 29 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE f. MEGALOBLASTOS: Caracterizado por um macrócito oval bem preenchido por hemoglobina com VCM no intervalo de 110 a 125 fl, decorrente de alterações no metabolismo da cobalamina ou ácido fólico, causando a anemia megaloblástica. Em alguns pacientes, porém, o vcm pode estar em torno de 100 fl, devido à associação da anemia megaloblásticacom deficiência de ferro. g. POIQUILOCITOSE: É um quadro de maturação alterada, onde aparece variação das formas das hemácias. Esse quadro geralmente ocorre em leucemias, mielofibrose com metaplasia mielóide extramedular, síndromes mielodisplásicas com anemia refratária e carcinoma que invade a medula. 30 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE h. CRENÓCITOS: São artefatos produzidos por substâncias alcalinas nas lâminas que afetam principalmente eritrócitos de RN; raramente são diagnosticados na uremia, nas hepatopatias, no uso de heparina venosa e no hipotiroidismo. i. ACANTÓCITOS: Hemácias pequenas com projeções irregulares. É resultado de um aumento da proporção de colesterol para fosfolípides na membrana da hemácia, fazendo com que a mesma fique com uma área de superfície excessiva e perca a fluidez da membrana, assim ela fica achatada e adquire um contorno como uma concha e ao passar pelo baço perdem a superfície ficando distorcidas e espiculadas. Célula peculiar da abetalipoproteinemia hereditária, presente também em outras dislipidemias, na cirrose hepática, na hepatite do recém-nascido, na anemia hemolítica, após esplenectomia e após administração de heparina. 31 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE j. DACRIÓCITOS: Hemácias em forma de lágrima. Ocorrem provavelmente por retardo da saída da medula ssea. Presente na metaplasia mielóide, na anemia megaloblástica, nas talassemias e na esplenomegalia. ó k. HEMÁCIAS EM ALVO: Células em forma de alvo. Ocorre um excesso de membrana, fazendo com que a hemoglobina se distribua em um anel periférico, com uma zona densa central. Encontradas nas talassemias, na emoglobina C, icterícia obstrutiva e na doença hepática severa. h 32 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE l. ESQUIZÓCITOS: Fragmentos de hemácias de tamanhos diferentes e com formas bizarras. Apresentam-se no esfregaço com a forma de meia-lua, triangulares ou de esférulas. Observados em muitos casos de próteses valvulares e vasculares, microangiopatias, síndrome hemolítica-urêmica, nos casos de queimaduras graves e na coagulação intravascular disseminada. m. QUERATÓCITOS: São hemácias fragmentadas por colisão em áreas de fluxo violento (válvulas cardíacas, próteses arteriais), fibrina intravascular (CIVD), lesão térmica (queimaduras) ou química (drogas oxidantes). Apresentam-se no esfregaço como células mordidas ou em forma de capacete, presentes nas anemias hemolíticas por hemoglobina instável, defeito enzimático, remédios (sulfas, acetominofen). n. ESFERÓCITOS: Eritrócitos redondos, pois perderam partes de sua membrana celular. No esfregaço eles aparecem menores em diâmetro do que em relação às hemácias normais e mais densos, sem área de palidez central normal. É um achado em anemias hemolíticas e na esferocitose hereditária (defeito na proteína estrutural de membrana, a espectrina). 33 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE o. DREPANÓCITOS: Hemácias em forma de foice, característica da anemia falciforme, doença de porte genético, relacionada com a presença de uma hemoglobina, estruturalmente, anormal, a HbS. A morfologia alterada ocorre devido à polimerização e solidificação intracelular das moléculas de hemoglobina. p. ELIPTÓCITOS: Hemácias elípticas e ovaladas, que ocorrem na ovolacitose hereditária (eliptocitose) e podem também ser encontradas em anemias carênciais e mais raramente nas talassemias e outras anemias. A forma elíptica reflete a incapacidade das hemácias deformadas por tensões cortantes na microcirculação em retornar a uma forma normal bicôncava em vasos maiores, defeito relacionado com a espectrina. 34 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE q. ESTOMATÓCITOS: Geralmente são artefatos; raramente, tem significado clínico, mas podem ser encontrados no uso de asparaginase, doenças hepáticas, recém-nascido, hereditária, Rhnull. r. ANÉIS DE CABOT: Figura em forma de anel observada nas anemias megaloblásticas, podendo, em alguns casos, torcer-se, assumindo um aspecto de oito. Pode também ser observada em outras situações de eritropoiese anormal. É um filamento fino de cor vermelho-violeta, concêntrico em relação à membrana celular, que resulta de restos mitóticos de mitoses anômalas. 35 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE s. CORPÚSCULOS DE HOWELL-JOLLY: Corpúsculo de inclusão pequeno, basofílico, resultante de restos nucleares de mitoses anômalas. São observados em pacientes esplenectomizados, nas anemias hemolíticas e megaloblásticas. t. CORPOS DE HEINZ: Precipitados de hemoglobina desnaturada que podem ser encontrados aderidos à membrana das hemácias, em pacientes com anemia hemolíticas por algumas droga, na deficiência da glicose-6- fosfato desidrogenase. Sua visualização é possível quando corados com azul de cresil brilhante. 36 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CORPÚSCULOS DE PAPPENHEIMER: Estão Associados a ribossomas remanescentes e apresentam-se como pontos enegrecidos, agrupado ou localizados em anemias hemolíticas e sideroblásticas. u. PONTILHADO BASOFÍLICO: Granulações variáveis em número e tamanho, de cor azulada e são agregados de ribossomas remanescentes. Podem ser encontrados na intoxicação por metais, especialmente o chumbo, nas talassemias e em outras alterações da hemoglobina, nas mielodisplasias e em outras formas de anemia severa. 37 FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE v. FORMAÇÃO DE ROULEOUX: É uma aglutinação das hemácias que formam verdadeiras pilhas, podendo ser observadas em lâmina corada sendo decorrentes da concentração elevada de fibrinogênio ou de globulinas, especialmente nas gamopatias monoclonais. Levam ao aumento da velocidade da hemossedimentação. SÉRIE BRANCA – MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES LEUCOCITÁRIAS Os leucócitos do sangue (glóbulos brancos) normalmente consistem em granulócitos, linfócitos e monócitos. Eles são reconhecidos, em um esfregaço sangüíneo periférico corado pelo Wright ou panótico pelas seguintes características tintoriais. Os granulócitos têm núcleo segmentado com cromatina densa e apertada. O citoplasma contém grânulos que são finos, de um amarelo róseo no granulócito neutrofílico (neutrófilo), grandes e cor laranja brilhante no granulócito eosinofílico (eosinófilo) e grandes de cor preta purpúrica no granulócito basofílico (basófilo). A maior parte dos linfócitos é células pequenas quiescentes com um núcleo redondo que contém uma cromatina parcialmente condensada que parece manchada e quantidades limitadas de citoplasma que se cora em azul claro. Alguns linfócitos maiores têm núcleo de forma irregular ou denteada e quantidade aumentada de citoplasma contendo áreas que se coram em azul mais profundo. Estes são os linfócitos estimulados circulantes, geralmente linfócitos ativados. Um linfócito grande visto com menor freqüência
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