coloração de gram

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RELATÓRIO N° 02 – COLORAÇÃO DE GRAM
NOME: DÉBORA ANDRADE DE ARAÚJO
SABRINA STEFANNE VIANA RAMOS
FORTALEZA – CEARÁ
AGOSTO – 2019
INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é importante na caracterização e classificação inicial das bactérias. Esse método permite que as bactérias sejam visualizadas no microscópio óptico, uma vez que sem a coloração é impossível observá-las ou identificar sua estrutura. 
O método de coloração de Gram recebeu esse nome em homenagem ao patologista dinamarquês Hans Christian Joachim Gram que realizou a descoberta em 1884 e até hoje continua sendo a mais utilizada nos laboratórios de análises clínicas e microbiologia. Através da coloração é possível identificar e diferenciar os dois principais grupos de bactérias pelas suas cores, as que ficavam violetas foram denominadas Gram-positivas e as de coloração rosa, Gram-negativas.
A coloração Gram irá ajudar na identificação de uma infecção bacteriana, determinando qual é o tipo de bactéria. A diferença das bactérias Gram-negativas e Gram-positivas permite ao médico determinar um tratamento eficaz ao paciente, aplicando a terapia adequada em cada caso.
Mesmo que nem todas as bactérias possam ser diferenciadas através da coloração de Gram, a metodologia tem grande aplicação no diagnóstico clínico e pesquisa biológica.
O objetivo desse trabalho é identificar e diferenciar bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. 
MATERIAL E MÉTODO
Material necessário: Culturas bacterianas/ leveduras; Corante violeta de cristal;
Corante fucsina; Lugol; Etanol; Bico de chama (lamparina); Lâminas de vidro;
Alça de inoculação e Microscópio óptico.
Método:
1- Esfregar a cultura bacteriana na lâmina de vidro e em seguida, a fixação da cultura usando a chama da lamparina.
2- Cobrir o esfregaço da cultura em estudo com o corante violeta de cristal (CV). Deixar atuar por 1 minuto. OBS: Após esta etapa todas as células ficam coradas com o CV, o corante primário.
3- Escorrer o CV e lavar a lâmina com água destilada. Secar com papel de filtro ou lenço de papel macio, sem esfregar.
4- Cobrir a preparação com o Lugol e deixar atuar durante 1 minuto.
5- Escorrer a solução de Lugol, lavar com água destilada e secar com papel. OBS: O iodo da solução de Lugol forma um complexo insolúvel com o corante primário. O complexo cristal de violeta-iodo (CV – I) formado apresenta uma cor mais intensa (violeta escuro) do que o CV livre e é mais difícil de remover das células.
6- Diferenciar pelo álcool a 95°GL, deixando cair gota a gota o álcool sobre a lâmina preparada até que não saia mais corante.
7- Lavar com água destilada, escorrer e secar com o papel. 
8- Tornar a corar a lâmina preparada com a solução de Fuscina (conta-corante), durante 5 minutos.
9- Escorrer o corante, lavar com água destilada e secar com o papel.
10- Examinar a lâmina + amostra no Microscópio óptico.
Os resultados após a Coloração de Gram permitem classificar as bactérias em dois grupos: Bactérias Gram-Positivas ou Gram-Negativas.
Quando as estruturas celulares são cobertas pelo corante violeta de cristal, todas as células ficam com a cor roxa ou violeta. Com a adição de Lugol, ocorre à formação do complexo iodo-CV, que tem como propriedade fixar o corante primário nas estruturas coradas.
Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando ocorre a lavagem, com álcool etílico, enquanto outras perdem sua coloração mais devagar ou a perdem completamente. O corante fuscina (róseo) colore novamente as estruturas que foram descoradas.
RESULTADO E DISCUSSÃO
As características estruturais da parede bacteriana estão na base da técnica de Gram que funciona da seguinte forma.
O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactéria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-iodo, insolúvel em água, que vai corar o protoplasmae a parede celular. A camada de peptidoglicano é maior em bactérias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e são coradas pelo vermelho de safranina.
A lavagem com álcool 99,5º GL dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permeável a este, arrasta-o para fora da célula. As bactérias capazes de preservar a coloração roxa do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactérias que, após a lavagem com álcool-acetona, são incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluída que se fixa apenas nas bactérias gram-negativas. 
Resumindo, as bactérias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento celular ou acção de lisozimas).
Gram-Positiva:
	membrana citoplasmática:
	fosfolipídeos
	proteínas
	parede celular:
	peptidoglicano - polímero poroso e insolúvel, em grande quantidade nestas bactérias (50% ou mais do peso seco da célula), tornando a parede bem espessa
	ácido teicóico - polímero de glicerol e ribitol fosfato; carregados negativamente pode ajudar no trasporte de íons + para dentro e fora da célula; e no armazenamento de fósforo. Se encontram ligados ao peptidoglicano ou à membrana citoplasmática
	polissacarídeos - ligados ao peptidoglicano
Gram-Negativa:
	membrana citoplasmática:
	fosfolipídeos
	proteínas
	parede celular - localizada no espaço periplasmático, ou seja, entre as membranas citoplasmática e externa.
	peptidoglicano - representa 10% do peso seco da célula
	lipoproteínas
	membrana externa - presente apenas nestas bactérias, serve para distingui-las.
	lipopolissacarídeos - típicos destas bactérias, ocorrem somente na membembrana externa; formados de lípideos, cerne de polissacarídeo e antígenos O. Podem atuar como um veneno (LPS ou endotoxina)
	trímeros de porina
Tabela 1: Resultados da coloração de Gram de alguns microrganismos. 
	Cultura Analisada
	Gram +
	Gram -
	Formato Célula
	LN- 17
	X
	
	coccus
	LN-21
	X
	
	coccus
	LN-25
	X
	
	coccus
	LN-29
	X
	
	coccus
	Escherichia coli 
	
	X
	coccus
	Leveduras
	X
	
	ovoide
As culturas: LN-17, LN-21, LN-25, LN-29 e as leveduras apresentaram uma coloração arroxeada, que é referente ao Gram+, que apresentam em sua estrutura da membrana celular maior quantidade de carboidratos e polipeptídeoglicano.
As leveduras são fungos unicelulares que não formam um grupo específico, como os cogumelos, ou seja, não formam um grupo taxonômico. As leveduras são formas simples de crescimento de fungos ascomicetos (em sua maioria), basidiomicetos e os antigos zigomicetos. Alguns fungos são dimórficos, ou seja, apresentam a forma leveduróide (unicelular) e a forma filamentosa (micélio), esta última forma apresenta-se com um conjunto menor de hifas se comparada a um cogumelo e é referida por pseudomicélio. As alterações das formas ocorrem de acordo com mudanças ambientais e existem aquelas que se apresentam apenas em forma leveduróide, como o ascomiceto bem conhecido, Saccharomyces cerevisae, conhecida vulgarmente como levedura de padeiro ou da cerveja. Isto deve-se ao seu papel milenar na produção de pão e bebidas alcoólicas, devido à sua capacidade de realizar fermentação alcoólica, sintetizando etanol e dióxido de carbono, através do consumo de açúcares. 
O etanol é o álcool presente nas bebidas alcoólicas fermentadas, e o dióxido de carbono é o responsável pela gaseificação da cerveja e pela expansão da massa do pão. A produção de dióxido de carbono que faz levedar a massa do pão foi a razão do nome destes organismos, dado que a etimologia da palavra levedura tem origem no termo
latino levare, que significa crescer ou fazer crescer.
Figura da cultura LN-17 em coloração de Gram, foto tirada no dia da visita ao laboratório.
Figura de uma levedura em coloração de Gram
A cultua Escherichia coli, apresentou uma cor rosa escura, que é referente ao Gram-, uma bactéria patogênica, em que sua estrutura da membrana celular pode ser composta de lipídeo, lipossacarídeo e lipoproteína.
Essa bactéria apresenta a forma de bastonete, e é anaeróbia facultativa. Seu habitat primário é o trato gastrintestinal de humanos e outros animais endotérmicos (“de sangue quente”). É considerada um indicador de qualidade de água e alimentos através da análise de coliformes fecais: nome dado a um grupo de bactérias que habita o intestino dos referidos animais. 
Figura da bactéria Escherichia coli em coloração de Gram. 
CONCLUSÃO
Com a compreensão do estudo aplicado sobre a coloração de Gram pode-se inferir da sua importância e necessidade nas línicas e hospitais para um diagnóstico preciso de uma doença ou infecção. 
Além disso, pode-se compreender melhor na prática como é a aplicação desse procedimento nas bactérias e fungos, facilitando, dessa forma, um melhor entendimento do assunto.
Outro ponto a ser ressaltado foi o conteúdo ser passado de forma coesa e coerente, facilitando o entendimento e a aplicação dos métodos e conseguindo ter clareza nas amostras e conseguindo identificá-las e classificá-las corretamente.
REFERÊNCIAS
BIOLOGIA, E-ESCOLA. Universidade Técnica de Lisboa, Portugal.
MAYBERRY WR; QUILLEN JH; CATLIN, K. Ggram stain tutorial Microbelibrary.
UFMGG. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Microbiologia. Coloração de Gram. 
Evert, R.F. & Eichhirn, S.E. 2014. Raven/ Biologia Vegetal. 8ª edição, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 856p.
Terçaroli, G.R., Paleari, L.M. & Bagagli, E.2010. O incrível mundo dos fungos. São Paulo, Ed. Unesp, 125p.
Bononi, V.L. (org.) 1998. Zigomicetos, Basidiomicetos e Deuteromicetos. São Paulo: Instituto de Botânica, Secretaria de Estado do Meio Ambiente, 181p.
TORTORA, Gerard. J.; DERRICKSON, Bryan. Princípios de Anatomia e fisiologia. 14. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016.