Manual de Práticas Bacteriológicas - 2014 1

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MANUAL DE PRÁTICAS 
 
BACTERIOLÓGICAS 
 
 
 
KÊSIA XISTO DA FONSECA RIBEIRO DE SENA 
ALDA DE ANDRADE CHIAPPETA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UFPE 
2014.1 
 
 
 
 
RECIFE 
 
TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO, LÍQUIDO E SEMI-SÓLIDO 
 
 Cuidados iniciais 
 
O isolamento, cultivo e identificação de microrganismos requerem técnicas adequadas de 
inoculação destes microrganismos em meios de cultura que possibilitem o seu rápido crescimento, livre de 
contaminações. Estas são as chamadas “técnicas assépticas”. Para sua execução, certas precauções 
especiais devem ser observadas pelo manipulador, a fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os 
riscos de infecção ou de intoxicação no laboratório. Assim, o estabelecimento de uma zona de esterilidade 
é garantida pela regulação da chama do bico de gás (Bico de Bunsen). É somente nesta zona, estéril, que os 
tubos ou recipientes com meios de cultura, estéreis ou com material a ser inoculado, deverão ser abertos 
ou manipulados. Qualquer outro material deverá ser mantido nesta área, para que seja preservada a sua 
esterilidade. As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de gás. 
Alças ou agulhas, de platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente antes e depois 
de qualquer transferência. Elas devem ser flambadas ao rubro imediatamente, em todo o seu 
comprimento, a partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, , mantendo-as em posição vertical à chama 
do bico de Bunsen. Nunca iniciar a flambagem pela extremidade livre da alça ou agulha. Deixar esfriar nas 
proximidades da chama. 
Habituar-se a passar, ligeiramente, dentro da chama do bico de gás, também, imediatamente antes 
e depois da transferência, pipetas graduadas estéreis, pipetas Pasteur, ou alças de Drigalsky. Nunca abrir 
ou deixar abertos verticalmente os tubos ou frascos com culturas. Incliná-los, sempre, a aproximadamente 
300C. No caso do tubo com agar inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal. Flambar, também a 
boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios, imediatamente antes e depois da transferência. 
Cuidar de nunca depositar a tampa ou tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a bancada ou mesa 
de trabalho. Descartar pipetas usadas em recipientes contendo soluções detergentes ou desinfetantes. 
Tratar de dispor o material de trabalho em posição adequada à fácil manipulação, sem riscos de acidentes 
ou trocas. Manter os tubos, alças e agulhas sempre na posição vertical, em suportes e estantes 
apropriadas. Identificar adequadamente o material de trabalho. 
 
 
SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO 
 
Por esgotamento 
 
Bactérias e fungos crescem na superfície de meios de cultivo sólidos, produzindo colônias 
compostas de centenas de células derivadas de uma única célula implantada na superfície do meio (cultura 
pura). Colônias de diferentes espécies freqüentemente apresentam aspectos característicos que fornecem 
um indicativo da provável identidade. As colônias de Staphylococcus aureus apresentam-se amarelo 
dourado, no meio agar nutritivo e as de bactérias não fermentadoras formam colônias incolores ou 
transparentes nos meio MacConkey e E M B. Os detalhes de cromogênese ou pigmentação fornecem 
indícios valiosos na identificação das bactérias. A técnica de esgotamento do inóculo pode ser realizada 
com facilidade e com o mínimo de equipamento, constituindo técnica de rotina para o isolamento de 
bactérias em culturas puras. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Com o uso de uma alça de platina em O pegar uma porção do material em análise. 
2. Levar a alça à superfície do meio de cultura apropriado e semear em zig zag em toda superfície do meio 
até esgotamento. 
3. Após o período de incubação observar as colônias isoladas. (Preencher tabela 1) 
 
 
Com alça de Drigalsky 
 
Com a alça de Drigalsky o semeio poderá ser uniforme (por toda a placa) ou em colônias isoladas. 
 
Semeio uniforme 
 
1. Fazer uma suspensão bacteriana em soro fisiológico com concentração padronizada. 
2. Colocar 100 l da suspensão bacteriana em placa de Petri contendo meio apropriado. 
3. Semear uniformemente os 100 l com a alça de Drigalsky por toda a superfície do meio. 
4. Incubar a placa por tempo e temperatura adequados. 
 
Em colônias isoladas 
 
1. Diluir a suspensão bacteriana do item 1 (acima) até 10-4 ou 10-5 diluições. 
2. Prosseguir conforme itens 2, 3 e 4 do protocolo anterior. 
 
Obs.: caso não se consiga colônias isoladas diluir o material até a obtenção das mesmas. 
 
Com “swabs” 
 
 Usado com freqüência na bacteriologia no semeio de espécimes clínicas para a realização do 
antibiograma. 
 
PROTOCOLO: 
 
l Fazer uma suspensão bacteriana em soro fisiológico com concentração padronizada. 
2 Embeber o “swab” na suspensão bacteriana e semear na superfície do meio apropriado. 
3. Incubar a placa por tempo e temperatura adequados. 
 
Em estrias 
 
Usado na realização de testes de dosagens. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Fazer uma suspensão bacteriana em soro fisiológico com concentração padronizada. 
2. Molhar a alça em L na suspensão bacteriana e passar levemente na superfície do meio. 
3. Incubar conforme as exigências do microrganismo. 
 
Em tubo agar inclinado 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Tomar com uma alça de platina em  (anel) uma amostra do material a ser analisado. 
2. Semear a superfície do meio agar inclinado em zig zag. 
3. Incubar conforme as exigências do microrganismo. 
 
SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO 
 
Os meios líquidos são utilizados como meio de enriquecimento ou quando é grande o volume de 
material clínico a ser semeado. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Com a alça de platina em O tocar no material a ser analisado ou na espécie bacteriana. 
2. Inocular o material no meio líquido. 
3. Incubar conforme as exigências do microrganismo. 
4. Observar a quantidade do crescimento e a distribuição do crescimento no meio de cultura. 
 
SEMEADURA EM MEIO SEMI-SÓLIDO (EM TUBOS) 
 
Por disseminação 
 
O meio tioglicolato reduz o O2 do meio e pode ser utilizado para o cultivo de microrganismos que 
apresentam diferentes exigências em relação ao O2. Desta maneira, os aeróbios crescerão somente na 
superfície do meio, os microaerófilos próximo a superfície, os anaeróbios somente na base e os facultativos 
em toda a extensão. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Semear a cultura por disseminação em tubo de ensaio contendo o meio tioglicolato. 
2. Incubar conforme as exigências do microrganismo. 
3. Observar o crescimento ao longo do tubo. Preencher Tabela 2. 
 
Em picada 
 
Utilizado para verificar a motilidade bacteriana. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Com a agulha de platina fazer o inóculo penetrar 0,5 a 1,0 cm no centro do meio de cultura em tubos. 
2. Incubar conforme as exigências do microrganismo. 
3. Observar o crescimento. Preencher Tabela 3. 
 
MÉTODOS DE COLORAÇÃO 
 
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
Pelo método de coloração de Gram as bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos de 
acordo com a constituição da parede: Gram-positivas e Gram- negativas (Figura 1). 
As bactérias Gram-positivas, geralmente cocos coram-se em violeta, e as Gram-negativas, 
geralmente bastonetes coram-se em vermelho embora com algumas exceções nos dois casos (Tabela 4). 
 
Tabela 4. Exceções de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas 
Exigências de oxigênio Bacilos Gram-positivo Cocos Gram-negativo 
 
Aeróbios ou anaeróbios 
facultativos 
Bacillus Acinetobacter 
Corynebacterium Branhamella 
Listeria Neisseria 
Lactobacillus 
Erysipelothrix 
 
Anaeróbios 
Clostridium Veillonella 
Actinomyces 
Eubacterium 
BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS 
 
 A parede celular das Gram-positivas apresenta uma camada espessa que representa 40 a 90% do 
seu peso formado por peptidoglicano. Muitas bactérias Gram-positivas(Staphylococcus e Streptococcus) 
contêm na parede os ácidos teicóicos. Quando os ácidos teicóicos estão ligados aos lípideos (fosfolípideos) 
da membrana plasmática são chamados de ácidos lipoteicóicos. Os ácidos lipoteicóicos podem atravessar a 
parede celular e ser detectado como antígenos na superfície da célula bacteriana. Alguns Streptococcus 
podem conter em sua parede polissacarídeos ligados ao peptidoglicano chamados carboidrato C. Os 
Streptococcus do grupo A também contém na parede proteínas associadas à sua virulência. 
 
BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS 
 
A parede celular das bactérias Gram-negativas é formada de uma quantidade pequena de 
peptidoglicano não excedendo a 10% do seu peso seco e de uma membrana externa constituída de uma 
dupla camada lipídica. Uma camada interna composta basicamente de fosfolipídeos, e uma externa 
contendo lipopolissacarídeos e proteínas. 
Os lipopolissacarídeos (LPS) também conhecidos como endotoxinas estão posicionados na 
membrana externa de modo que a porção polissacarídica fica exposta na superfície da célula bacteriana e 
constitui o antígeno somático ou antígeno O, de bactérias Gram-negativas. A porção lipídica, lipídeo A, é 
responsável pelo efeito tóxico do LPS. 
As lipoproteínas estão covalentemente ligadas ao peptidoglicano contribuindo para a fixação da 
membrana externa ao peptidoglicano. 
As porinas são proteínas que formam canais de passagem através da membrana externa e 
funcionam como sítio de união específica para bacteriófagos, Vitamina B12 e outros nutrientes (Figura 1). 
 
Figura 1 – parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. 
 
PEPTIDOGLICANO 
 
O peptidoglicano (mucopeptídeo ou mureína) é um heteropolímero formado por dois tipos de 
açúcares e alguns aminoácidos. Os açúcares são N-acetil-glicosamina e ácido N-acetil-murâmico. Os 
aminoácidos mais frequentes são: L e D-alanina, ácido D-glutâmico, ácido meso-diaminopimélico e L-lisina 
(Figura 2). 
 
 
Figura 2 – Estrutura do peptideoglicano 
 
Material: culturas desenvolvidas, soro fisiológico, pipetas, lâminas, alça de platina, kit para coloração de 
Gram (Cristal violeta + lugol + safranina ou fucsina + álcool). 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Fixar o esfregaço bacteriano pelo calor 
2. Cobrir o esfregaço com cristal violeta 1 minuto 
3. Escorrer e colocar lugol l minuto 
4. Escorrer e lavar com álcool (tempo delicado) 
5. Escorrer e cobrir o esfregaço com fucsina l minuto 
6. Lavar em água corrente, secar e observar (tabela 5). 
 
COLORAÇÃO DE ZIEHL NEELSEN 
 
 Os bacilos da tuberculose e da lepra (Micobactérias), quando tratados pela fucsina fenicada a 
quente, resistem ao descoramento subsequente por uma solução de ácido e assim, permanecem coradas 
em vermelho; outras não resistem ao descoramento e tomam a coloração de fundo. 
 A existência de lipídeos fortemente ligados na parede celular das micobactérias está relacionada a 
ácido-resistência evidenciada pela coloração de Ziehl. 
 
PROTOCOLO: 
 
1 - Corar a lâmina com fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo a lâmina (mais ou menos 3 vezes) até a 
emissão de vapores durante 5 minutos (esperar 10 minutos). 
2 - Escorrer o corante e diferenciar com álcool clorídrico a 1% (álcool a 95%, 100 ml, ácido clorídrico 1,19,1 
ml) - tempo delicado. 
3 - Lavar em água corrente. 
4 - Corar o fundo rapidamente com solução diluída de azul de metileno (azul fenicado de Kühne ou azul 
alcalino de Loeffer, 1 parte; água destilada, 10 partes) 30 segundos. 
5 - Lavar e secar. 
Bacilos ácidos resistentes, vermelhos, outros germes e núcleos celulares, azuis. 
 
 
 
 
 
CARACTERÍSTICAS DOS MEIOS DE CULTURA DE ROTINA 
NA BACTERIOLOGIA CLÍNICA 
 
Os meios de cultura são habitat artificiais que devem oferecer condições as mais próximas possíveis 
de um habitat natural para o crescimento e manutenção de microrganismos atendendo as suas 
necessidades particulares de crescimento. De maneira geral sempre possuem uma fonte de carbono, uma 
fonte de nitrogênio, indicadores de pH, e demais nutrientes que possibilitam o crescimento e / ou inibição 
de determinadas bactérias. 
 
MEIOS INDICADORES (DIFERENCIAIS) 
 
São aqueles que permitem o crescimento de várias espécies, ao mesmo tempo em que proporcionam um 
ambiente que facilita a diferenciação entre os diferentes microrganismos. Exemplo: Agar sangue. 
 
MEIOS SELETIVOS 
 
São aqueles que podem interferir no crescimento de certos microrganismos, ou evitá-los, ao mesmo 
tempo em que permitem o crescimento de outros. Entre as substâncias que podem ser usadas como 
agentes seletivos temos os corantes como o cristal violeta a eosina, o azul de metileno e o verde brilhante 
(estes inibem microrganismos Gram - positivos), as altas concentrações de Cloreto de sódio e os sais 
biliares. Exemplo: ágar TCBS. 
 
MEIOS SELETIVOS E INDICADORES 
 
São os que possuem as propriedades que os tornam ao mesmo tempo seletivos e diferenciais. 
Exemplo: Agar eosina azul de metileno (E M B), agar MacConkey, agar manitol salgado, agar bile esculina. 
 
AGAR MUELLER-HINTON 
 
É um dos meios base para a preparação do agar sangue e o meio utilizado no teste de sensibilidade 
a antimicrobianos 
 
ÁGAR SANGUE 
 
Neste meio pode-se observar a atividade hemolítica de algumas bactérias. A verificação da 
capacidade hemolítica é extremamente importante na escolha dos testes complementares e diferenciais 
do gênero Streptococcus. Como é altamente nutritivo, favorece o crescimento da maioria dos 
microrganismos causadores de infecções incluindo os patógenos exigentes. Além da base para preparo do 
agar sangue (Blood Ágar), outros meios são utilizados na preparação desse meio como o agar Mueller-
Hinton ou agar Columbia entre outros. 
 
Na preparação do meio agar sangue deve-se observar os seguintes cuidados: 
 
1. Após a autoclavação do meio base resfria-lo até aproximadamente 45-500C. 
2. Adicionar aproximadamente 5% de sangue de carneiro (preferencialmente) desfibrinado e estéril. 
3. Homogeneizar bem o frasco e distribuir o meio em placas de Petri de modo a formar uma camada de 
4mm de espessura. 
 
OBS:  - hemólise = hemólise parcial (forma-se ao redor da colônia um halo esverdeado) 
  - hemólise = hemólise total (forma-se ao redor da colônia um halo transparente) 
  - hemólise = ausência de hemólise 
AGAR MacCONKEY 
 
Meio amplamente empregado para isolar e identificar enterobactérias e outros bacilos Gram 
negativos entéricos a partir de fezes, urina, alimentos, águas residuais etc. As enterobactérias 
fermentadoras de lactose baixam o pH do meio o que é detectado pelo indicador vermelho neutro. Os 
típicos fermentadores de lactose formam colônias vermelhas a rosadas que podem ser rodeadas de um 
precipitado opaco de sais biliares. Os fermentadores fracos da lactose podem formar colônias ligeiramente 
rosadas. As não fermentadoras formam colônias transparentes, incolores ou âmbar (Figura 3). Outros 
Gram negativos não Enterobacteriacea, como Pseudomonas e Aeromonas também crescem neste meio. As 
bactérias Gram positivas são inibidas pelos sais biliares e pelo cristal violeta. A lactose é o único carboidrato 
presente no meio. 
 
ASPECTOS DAS COLÔNIAS EM ÁGAR MacCONKEY 
 
MICRORGANISMO CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS 
Escherichia coli Vermelhas ou rosadas, não mucóides. Podem se rodeadas de um 
precipitado opaco de sais biliares. 
Klebsiella sp 
Enterobacter sp 
Grandes, rosadas a creme, mucóides 
Serratia sp Vermelha ou rosadas. Não mucóides 
Proteus sp Incolores e transparentes 
Salmonella sp Incolores e transparentes 
Shigella sp Incolores e transparentes 
Gram positivos inibidos 
 
A B 
 
Figura 3 A -Colônias fermentadoras de Lactose (Escherichia coli) ; B – Colônias lactose negativa(Salmonella spp) 
 
 
 
ÁGAR EOSINA AZUL DE METILENO (E M B) 
 
Meio utilizado para o isolamento e diferenciação de enterobactérias a partir de fezes, água e 
outros materiais. A combinação da eosina e azul de metileno funciona como indicador promovendo um 
reconhecimento entre as colônias de organismos fermentadores da lactose e os que não fermentam a 
lactose, e também como inibidor de microrganismos Gram-positivos. A sacarose foi incluída no meio para 
detectar os coliformes que fermentam este carboidrato mais rápido do que a lactose. As colônias lactose 
positivas ou são escuras podendo apresentar um brilho metálico de tonalidade esverdeado (típicos 
fermentadores) ou possuem centros escuro com bordas acinzentadas ou são acinzentadas. Os 
microrganismos lactose ou sacarose negativos são incolores. 
 
 
 
ASPECTOS DAS COLÔNIAS EM ÁGAR EOSINA AZUL DE METILENO (E M B) 
 
MICRORGANIMOS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS 
Escherichi coli Colônia de 2 a 3mm de diametro escura com brilho 
verde metálico 
Klebsiella sp 
Enterobacter aerogenes 
Colônias Grandes (4 a 6mm de diâmetro) mucóides 
com bordas claras e centro escuro 
Proteus sp Colônias incolores 
Salmonella sp 
Shigella sp 
Colônias incolores 
Gram positivos inibidos 
 
AGAR MANITOL SALGADO 
 
É um meio seletivo para o isolamento e identificação presuntiva de Staphylococcus aureus, a partir 
de amostras clínicas, alimentos e outros materiais. A elevada Concentração de sal (7,5%) inibe o 
crescimento de outras bactérias, deixando crescer apenas o gênero Staphylococcus. Ocorre degradação do 
manitol com formação de ácido e o vermelho de fenol funciona como indicador de pH. Uma viragem do 
vermelho original para amarelo indica degradação do manitol com formação de ácido. 
 
ASPECTOS DAS COLÔNIAS EM AGAR MANITOL SALGADO 
 
MICRORGANISMOS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS MANITOL 
Staphylococcus aureus Amarela + 
Staphylococcus epidermidis 
Bacillus subtilis 
Brancas _ 
Enterococcus faecalis 
Escherichia coli 
Inibidas _ 
Proteus mirabilis 
Proteus vulgaris 
Parcialmente inibidas _ 
 
AGAR BILE ESCULINA 
 
É um meio usado para verificar a capacidade de certas bactérias em particular os Enterococcus 
(grupo D de Lancefild) crescerem em presença de bile (tolerância a bile) e de hidrolisarem a esculina. Os 
Enterococcus hidrolisam a esculina convertendo-a em glicose e esculetina; essa em presença dos íons 
férricos presentes no meio (citrato férrico), forma um complexo marrom escuro ou negro que resulta em 
um enegrecimento difuso do meio. 
 
ASPECTOS DAS COLÔNIAS EM AGAR BILE ESCULINA 
 
MICRORGANISMOS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS 
Enterococcus faecalis 
Enterococcus faecium 
Colônias puntiformes marrons, meio marrom 
escuro 
Bacillus subtilis Colônias rizóides de coloração creme 
amarronzada, meio marrom escuro 
 
AGAR SALMONELLA SHIGELLA ( AGAR SS) 
 
É um meio seletivo utilizado para inibir o crescimento de Escherichia coli e outros coliformes, porém 
permite o crescimento de Salmonella e Shigella de fezes (principalmente), água, alimentos e outros 
materiais. A alta concentração de sais biliares e citrato de sódio inibem todas as bactérias Gram-positivas 
e muitos microrganismos Gram-negativos, incluindo os coliformes. A lactose é o único hidrato de carbono e 
o vermelho neutro é o indicador para a detecção de ácidos. O tiossulfato de sódio funciona como fonte de 
enxofre. Qualquer bactéria que produza H2S desenvolve enegrecimento das colônias, pela reação do gás 
sulfídrico com o citrato férrico (indicador de H2S) do meio. 
 
ASPECTOS DAS COLÔNIAS EM AGAR SALMONELLA SHIGELLA (AGAR SS) 
 
MICRORGANISMOS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS 
Shigella sp. Incolores 
Salmonella sp. 
Proteus sp. 
 
Incolores, com centro negro se produzem H2S 
Escherichia coli Pequenas que vão de rosa a vermelho 
Klebsiella sp. 
Enterobacter sp. 
De maior tamanho que a Escherichia coli, 
mucoides,opacas, de creme a rosa 
 
TIOGLICOLATO 
 
O meio tioglicolato reduz o O2 do meio e pode ser utilizado para o cultivo de microrganismos que 
apresentam diferentes exigências em relação ao O2. Os microrganismos anaeróbios desenvolvem-se no 
fundo do tubo, os microaerófilos, na parte média, os aeróbios na camada superficial, e os facultativos em 
toda a extensão. Tem como redutor de 02 o tioglicolato e a cisteina, como indicador a rezasurina sódica. 
 
AGAR HEKTOEN ( HEKTOEN ENTERIC AGAR ) 
 
É um meio seletivo para isolamento de patógenos intestinais. Aumenta o desenvolvimento de 
Salmonella e Shigela 
ASPECTOS DAS COLÔNIAS NO MEIO HE 
 
MICROORGANISMO CARACTERISTÍCAS DAS COLÔNIAS 
 E. coli Alaranjado a salmão 
Klebsiella Alaranjado a salmão 
Salmonella Azul esverdeado com centro negro 
Shigella Esverdeado 
Proteus Inibindo colônias, as que crescem são 
esverdeadas com centro negro 
 
MEIO CLED (BROLACIN) 
 
- Finalidade: meio não seletivo e diferencial, utilizado na urocultura 
 
- Principais componentes: lactose, L-cisteína, azul de bromotimol 
 
- Resultados : Fermentadores de lactose: colônias amarelas e meio amarelo 
 Não fermentadores de lactose: colônias azuis e meio azulado 
 
 
 
 
 
 
 
ASPECTOS DAS COLÔNIAS NO MEIO CLED 
 
MICRORGANISMOS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS 
 
E. coli 
Colônias de tamanho médio de coloração 
amarelada, podendo apresentar centro 
ligeiramente escuro 
 
Klebsiella 
 
 
Colônias grandes amareladas e mucóides 
 
Proteus 
 
 
Colônias azuis, translúcidas com bordas 
irregulares 
 
Salmonella e Shigella 
 
 
Colônias variando de azuladas a azul escuro 
 
Enterococcus faecalis 
 
 
Colônias puntiformes amareladas com meio 
amarelo 
 
Staphylococcus sp 
 
 
Colônias pequenas, opacas e de cor amarela 
intensa, com meio amarelo 
Pseudomonas sp Coloração fracamente verde azulada, 
superfície fosca e contornos irregulares. 
Odor adocicado. Agar azul esverdeado 
 
 
STAPHYLOCOCCUS 
 
CARACTERÍSTICAS GERAIS: 
 
 Gênero de cocos Gram-positivos da família Micrococcaceae; geralmente dispostos em aglomerados 
irregulares (cachos de uva ou desordenadamente), imóveis, com cerca de 1 m de diâmetro, de modo 
geral sem formação de cápsulas; produzem pigmento variando de branco a amarelo-dourado profundo. 
Alguns são considerados parte da flora normal da pele, sendo também comumente encontrados no ar e 
no meio ambiente. Crescem bem em caldo ou agar-simples, em pH 7, a temperatura de 370C, a maioria, 
anaeróbio facultativo. Devido ao grande número de cepas resistentes, todas as infecções estafilocócicas 
requerem que os isolados sejam submetidos a testes de sensibilidade antimicrobiana. São catalase +. O 
gênero compreende várias espécies, sendo três delas de interesse médico: S. aureus, S. epidermidis, e S. 
saprophyticus. 
 
STAPHYLOCOCCUS AUREUS 
 
 É tipicamente de cor amarelo-dourado, coagulase positiva, caracteriza-se por produzir pústulas, 
abscessos ou furúnculos. Provoca: impetigo, feridas infeccionadas, pielite, artrite, infecção puerperal, 
meningite, septicemia, abscesso cerebral, endocardite, enterite e supuração em quase todos os órgãos. 
Algumas cepas produzem cápsulas. Em placas de agar-sangue desenvolve-se freqüentemente um halo de 
hemólise em torno das colônias. A proteína A está presente em 90% das cepas de S. aureus ligada ao 
peptidoglicano. A proteína A tem a capacidade de se ligar ao fragmento Fc da IgG; esta reação, direta ou 
indiretamente, provoca efeito anti-fagocitário, liberação de histamina, reações de hipersensibilidade e 
lesão plaquetária. Contém o polissacarídio ácido teicóico do tipo A. 
 
S. aureus apresentam as seguintes enzimas extracelulares: 
 
1) COAGULASE - Tem atividade semelhante a protrombina,capaz de transformar o fibrinogênio em fibrina. 
A fibrina dificulta o englobamento dos cocos ao mesmo tempo em que estabelece uma barreira 
tendente a limitar o foco de infecção. Pode se apresentar na forma livre ou fixa, sendo necessários 
métodos diferentes para detectar cada uma delas. A coagulase fixa está unida a parede celular 
bacteriana e não está presente nos filtrados de cultivos enquanto a coagulase livre encontra-se presente 
nos filtrados das culturas. 
2) CATALASE - É uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. Excluindo os 
estreptococos, a maioria das bactérias aeróbia e anaeróbia facultativa possui atividade catalase positiva. 
3) ESTAFILOQUINASE - Ativa o plasminogênio gerando plasmina que dissolve a fibrina. 
4) HIALURONIDASE - Despolimeriza o ácido hialurônico existente nos espaços intercelulares que 
condicionando uma diminuição de viscosidade, propícia a difusão do microrganismo ou de suas toxinas. 
5) DESOXIRIBONUCLEASE (DNAse) - Despolimeriza o DNA do meio. 
 
Toxinas presentes: 
 
1) HEMOLISINAS (,, e ) - A mais comum em amostras de origem humana é a , que é tóxica para 
plaquetas humanas e letal para animais quando inoculada pôr via sistêmica. É demonstrável pela sua 
ação hemolítica sobre hemácias de coelho. 
2) LEUCOCIDINA - Provoca a lise dos grânulos citoplasmáticos dos leucócitos (neutrófilos) e macrofagos 
humanos e de coelho com liberação do seu conteúdo enzimático. 
3) ENTEROTOXINAS - Termoestáveis a 1000C por ½ hora; resistentes a tripsina, responsáveis por casos 
agudos de intoxicação alimentar consecutivas à ingestão de alimentos, em particular produtos de 
confeitaria contaminados com estafilococos toxigênicos. 
 
Epidemiologia, Virulência e Tratamento 
 
 As fossas nasais (30 a 50%), garganta, intestino e pele são locais onde o S. aureus pode ser 
encontrado. A transmissão pode ocorrer por contato direto ou indireto, por bactérias do mesmo indivíduo 
ou de portadores doentes ou não. Ferimentos com penetração de corpos estranhos, lesões traumáticas, 
queimaduras, doenças debilitantes como o câncer, diabetes, cirrose hepática, AIDS, favorecem 
consideravelmente a infecção. Como prevenção devem der adotadas medidas de higiene que possam 
impedir a contaminação dos ferimentos cutâneos e dos operadores dos doentes que apresentem lesões 
supurativas. Os componentes principais que determinam a virulência do S. aureus são a produção de 
toxinas (-toxinas e leucocidinas) e a presença de antígenos superficiais de ação antifagocitária. As Drogas 
de escolha para o tratamento são as penicilinas, as tetraciclinas, cloranfenicol, eritromicina, cefalosporinas 
e os aminoglicosídeos. É conveniente lembrar que algumas cepas de S. aureus são produtoras de -
lactamase, tornando as penicilinas inativas. 
 
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 
 
 
 É habitante normal da pele e das mucosas, coagulase negativa. Ocasionalmente causa infecção, 
inclusive septicemia. Tem sido isolado de infecções associadas a implantação de próteses cardíacas, 
articulares e vasculares, bem como em associação com endocardite, mesmo na ausência de próteses 
vasculares. 
 
 
 
 
STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS 
 
 É coagulase negativa. Tem predileção pelo trato urinário, especialmente em mulheres jovens, nas 
quais causa infecção aguda, podendo também causar infecção urinária no homem, particularmente depois 
dos 50 anos. A patogenicidade da bactéria está relacionada à sua capacidade de aderir às células do 
epitélio urinário. Apresenta o polissacarídeo ácido teicóico do tipo B. 
 
PROVAS MAIS UTILIZADAS EM LABORATÓRIO PARA CARACTERIZAÇÃO DE 
STAPHYLOCOCCUS 
 
1) CATALASE 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Colocar uma colônia da bactéria no centro de uma lâmina 
2. Gotejar sobre a colônia, água oxigenada a 3%. 
3. Observar a imediata formação de bolhas = catalase-positiva (Figura 3). 
 
Figura 3 – Prova de catalase positiva, mostrando efervescência. 
 
 
 
2) COAGULASE FIXA 
 
PROTOCOLO: 
1. Colocar uma gota de água destilada sobre uma lâmina 
2. Misturar na gota uma alçada do microrganismo 
3. colocar uma gota do plasma junto à gota da suspensão bacteriana e misturar bem 
4. Inclinar suavemente a lâmina de um lado para o outro, observando a formação de um precipitado = 
coagulase positiva (Figura 4). 
Figura 4- Prova de Coagulase fixa 
 
 
 
 
 
3) COAGULASE LIVRE 
 
PROTOCOLO: 
1. Colocar 0,5 ml de plasma em um tubo estéril 
2. Adicionar 0,5 ml de cultivo puro crescido em Caldo (cérebro-coração) BHI 
3. Misturar suavemente por rotação 
4. Colocar o tubo em Banho-maria a 370 C 
5. Observar, de 30 em 30 minutos, a formação de um coágulo visível, durante as 
 primeiras 4 horas. 
 
4) DNAse 
 
1. Distribuir o meio ágar-DNAse em placa de Petri 
2. Fazer o semeio da bactéria e incubar pôr tempo adequado 
3. Colocar na placa uma solução de ácido clorídrico 1N, para revelação 
4. Em torno das colônias de S. aureus ocorre um halo de transparência DNAse positiva (Figura 5). 
 
 Figura 5 – Prova de DNAse 
 
 
5) SENSIBILIDADE A NOVOBIOCINA 5 g. 
 
1. Semear a bactéria em placa de Petri 
2. Colocar o disco de Novobiocina 5 µg 
3. Incubar adequadamente 
Observar a ocorrência de halo de inibição ao redor do disco. 
 As amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6 a 15 mm, enquanto as sensíveis apresentam halos 
de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus são resistentes. 
 
 Resistente = S. saprophyticus - halo menor ou igual a 15 mm 
 Sensível = S. epidermidIs - halo maior ou igual a 16 mm 
 
6) AGAR MANITOL 
 
 S. aureus ao contrário de S. epidermidis fermenta manitol com produção de ácido. 
 O meio agar manitol é altamente seletivo para isolamento de estafilococos patógenos (aureus) em 
cultivo misto. As colônias de estafilococos crescem bem no meio, formando um halo amarelo ao seu redor, 
que indica a produção de ácido a partir do manitol. 
1. Semear a bactéria no meio agar manitol. 
2. Incubar adequadamente. 
3. Observar o halo amarelo ao redor das colônias de S. aureus. 
 
STREPTOCOCCUS 
 
CARACTERÍSTICAS GERAIS: 
 
São cocos Gram-positivo, da família Streptococcaceae: dispostos em cadeias ou aos pares: a maioria 
imóveis, com cerca de 0,5 a 0,75m de diâmetro, geralmente acapsulados. Amplamente encontrados em 
animais e no homem, a maioria, constituindo parte da flora normal, mais algumas espécies são 
responsáveis por problemas infecciosos importantes. São aeróbios ou anaeróbios facultativos . São 
fermentadores de glicose. Não crescem bem em agar ou caldo simples, sendo necessária a adição de 
sangue em pH 7,0, temperatura de 370C. São catalase negativa. 
 Os Streptococcus de importância médica podem ser convenientemente agrupados com base na 
hemólise em agar-sangue: - hemólise completa = Beta hemolítico, Hemólise parcial = Alfa hemolítico, 
Não hemólise = Gama hemolítico: pela presença ou ausência de antígeno carboidrato grupo específico, ou 
seja, Grupo de Lancefield, identificado com letras do alfabeto; ou pela classificação do Manual de Bergey, 
em um grupo piogênico, um grupo oral ( grupo viridans = -hemolítico) e um grupo lático. 
Os principais estreptococos de interesse médico são: 
 
Streptococcus -hemolítico: 
Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A) 
Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B) 
 
Streptococcus α-hemolítico: 
 Streptococcus pneumoniae 
 
Streptococcus Orais (Grupo viridans): 
Streptococcus salivarius 
Streptococcus sanguis 
Streptococcus mitis 
Streptococcus mutans (não hemolítico) 
 
Enterococcus: 
 (Grupo D) - pode produzir  ou  hemólise ou não hemólítico. 
 
 
STREPTOCOCCUS PYOGENES (Streptococcus do Grupo A de Lancefield): 
 
S. pyogenes pode ser divididoem tipos sorológicos devido a presença da proteína M e T, podendo 
ser distinguidos 60 e 26 sorotipos de S. pyogenes, respectivamente. São Beta-hemolíticos. Provocam 
infecções das vias aéreas superiores (faringo-amígdalites), pele (piodermites e erisipela). 
As faringo-amigdalites estreptocócicas podem se acompanhar de febre reumática e 
glomerulonefrite e evoluir dando origem a infecções em outros órgãos ou tecidos, tais como sinusites, 
otites e mastoidites. As otites e mastoidites podem evoluir para bacteriemias e meningites. 
A piodermite mais característica é o impetigo, que pode ser seguido de glomerulonefrite, mas não 
de febre reumática. A erisipela é uma infecção estreptococica aguda da pele , que nos idosos, pode 
acompanhar-se de bacteriemia. 
 
Sequelas: 
 
 Como sequela das infecções estreptococicas temos a febre reumática e a glomerulonefrite, ambas 
doenças de natureza imunológica. 
 
Proteína M: 
A proteína M é um antígeno da parede celular. É um importante fator de virulência, devido a 
sua capacidade de interferir com a fagocitose. 
 
Toxinas: 
 
1. Toxina eritrogênica, toxina escarlatínica ou toxina de Rick - produzida por amostras de 
estreptococos isolados de casos de escarlatina (doença infecciosa aguda, caracterizada por 
angina exantema). 
2. Estreptolisina S - é oxigênio-estável, não imunogênica, responsável pelo halo de hemólise ( é uma 
hemolisina) em torno das colônias de S. pyogenes e pela morte de uma parte dos leucócitos que 
fagocitam a bactéria. 
3. Estreptolisina O - É oxigênio-sensível e fortemente antigênica; conduz à formação da 
antiestreptolisina (ASLO ou AEO). A determinação do título do anicorpo contra a estreptolisina O 
é de grande valor diagnóstico na febre reumática onde títulos superiores a 125 unidades são 
indicadores de infecçao estrepcócica recente. 
Sabe-se que a estreptolisina O provoca a lise dos lisossomas dos leucócitos, liberando enzimas 
hidrolíticas, que são destrutivas tanto para os leucócitos quanto, eventualmente, para outras 
células. 
 
Enzimas: 
 
1. Estreptoquinase (Fibrinolisina) - Tem a capacidade de dissolver coágulos, pela transformação do 
plasminogênio em plasmina. Sua ação é bloqueada pelo anticorpo específico formado no decurso 
da infecção (anti-estreptoquinase). 
2. Desoxirribonuclease - Degrada o DNA. São formados anticorpos contra a enzima no decorrer da 
infecção. 
3. Hialuronidase - Dissolve o ácido hialurônico. É o componente presumível do poder invasor dos 
estreptococos (fator de difusão). Sua ação é bloqueada pelo anticorpo no decurso da infecção. 
 
 
Epidemiologia, virulência e tratamento: 
 
Quadro demonstrativo de algumas diferenças epidemiológicas entre faringo-
amigdalites e piodermites estreptococcicas 
 
 Faringo-amigdalite Piodermite 
Transmissão Gotículas 
Respiratórias 
Contato pessoal e vetores 
(moscas) 
Clima associado com 
maior freqüência 
 Frio Quente 
Associação com febre 
reumática 
 Sim Não 
Associação com 
glomerulonefrite 
 Sim Sim 
 
O antibiótico de escolha é a penicilina G; para pacientes alérgicos a penicilina, recomenda-se o 
emprego de eritromicina. 
 
 
 
 
STREPTOCOCCUS AGALACTIAE (Beta-hemolítico do grupo B): 
 
Tem sido encontrado em culturas vaginais de pacientes grávidas assintomáticas e em culturas 
uretrais de seus esposos assintomáticos. Aproximadamente 25 a 35% das mulheres são portadoras vaginais 
desta espécie. Sua importância tem aumentado devido a sua crescente freqüência em infecções do recém-
nascido, como meningites e bacteremias. A bactéria é sensível às penicilinas, cefalosporinas, eritromicina,a 
maioria das amostras é resistente ao cloranfenicol. 
 
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE (Pneumococcos) 
 
É normalmente capsulado (cápsula formada de polissacarídeos); apresenta-se aos pares, com forma 
de chama de vela. As células medem aproximadamente 1,0 um. É - hemolítico. Provoca pneumonia 
aguda, otite média, sinusite, meningite e endocardite. Aproximadamente 90% das pneumonias bacterianas 
são causadas pelos pneumococos. A esplenectomia parece predispor a infecção e a infecção viral pode um 
ser precursor para a pneumonia. 
 
Epidemiologia, virulência e tratamento: 
 
Em torno de 40 a 70% dos indivíduos normais são portadores de pneumococos na garganta. A 
incidência de pneumonia é maior em crianças com menos de 5 anos, adultos com mais de 50 anos, no sexo 
masculino e durante os meses frios. 
Como fatores de virulência temos a cápsula, devido a sua propriedade antifagocitária: a 
pneumolisina (hemolisina) e a adesina, que fixa a bactéria a receptores glicoprotéicos existentes nas 
células epiteliais dos aparelhos respiratório e auditivo. O antibiótico de escolha é a penicilina G. 
 
STREPTOCOCCUS do Grupo Viridans 
 
Ocorrem na boca e no intestino, podendo passar para o sangue e localizar-se em válvulas 
previamente lesadas, dando origem a endocardite bacteriana subaguda ou endocardite lenta. São três as 
espécies que têm sido isoladas de casos de endocardite lenta: S. sanguis, no sangue, S. salivarius e S. mitis. 
O S. mutans está ligado diretamente ao processo cariogênico. Estes estreptococos raramente são 
identificados a nível de espécie e quando isolados, são denominados Streptococcus -hemolítico ou ou 
Streptococcus viridans. 
 
ENTEROCOCCUS 
 
(Grupo D) 
 
São encontrados normalmente no intestino humano, porém entre outras infecções, pode causar 
endocardite e infecção urinária. Podem apresentar resistência múltipla aos antibióticos, inclusive penicilina 
e cefalosporinas. 
Tais microrganismos tornaram-se importantes agentes de doenças humanas, principalmente as 
enfermidades decorrentes de infecção hospitalar, devido à sua resistência a agentes antimicrobianos como 
penicilinas e cefalosporinas de diversas gerações, bem como resistência de alto nível a aminoglicosídeos e a 
vancomicina. 
Considerados, por longo tempo, como uma das categorias de estreptococos apresentadores de 
antígeno D (anteriormente denominado de Streptococcus faecalis), os enterococos são diferenciados das 
espécies não-enterococos (Streptococcus bovis) baseando-se em suas características fisiológicas e de 
susceptibilidade a antimicrobianos. 
A proposta de transferência de alguns estreptococos grupo D para o gênero Enterococcus foi 
baseada na capacidade de crescer em temperaturas de 10°C e 45°C, hidrolisar esculina em presença de 
40% de bílis, desenvolver-se na presença de NaCl a 6,5%, crescer em pH 9,6 e produzir pirrolidonil 
peptidase, associadas aos dados de estudos de hibridização de ácidos nucléicos. 
Apesar de existir 12 espécies de enterococos duas são importantes em casos de endocardite: 
Enterococcus faecalis que contam com 85% e Enterococcus faecium contando com 10% dos casos. 15%, de 
uma forma geral, estão ligado à endocardite em valva nativa, e 15%, também, dos casos em valva 
protética. São isolados mais freqüentes em idosos e mulheres jovens, ocorrendo devido à infecção ou 
manipulação do trato urinário. 
 
 
 
PROTOCOLO DAS PRINCIPAIS PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO DE STREPTOCOCCUS 
 
 CATALASE 
 
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água (Figura 1). 
Excluindo os Estreptococos, a maioria das bactérias aeróbia e anaerobia facultativa possui atividade 
catalase. É usada para diferenciar estreptococos (catalase negativa) de estafilococos (catalase positiva). 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Colocar uma alçada de bactéria no centro de uma lâmina, 
2. Sobre a alçada colocar 1 a 2 gotas de peróxido de hidrogênio a 3%, 
3. Esperar o aparecimento de bolhas: = catalase positiva 
 
HIDRÓLISE DO HIPURATO 
 
A hipuricase é uma enzima produzida pelos Streptococcus do grupo B, que provoca a hidrólise do 
ácido hipúricocom a formação de benzoato de sódio e glicina. Pode-se verificar a hidrólise do hipurato, 
detectando o benzoato de sódio usando cloreto férrico ou detectando a glicina usando a ninhidrina (Figura 6) 
 
 
Figura 6 – Hidrólise do hipurato 
 
PROTOCOLO: 
 
PROVA DO BENZOATO 
 
1. Inocular um tubo de caldo hipurato com o microrganismo. Incubar a 350C durante 20 horas. 
2. Centrifugar o tubo e transferir 0,8 ml do sobrenadante para um tubo estéril 
3. Adicionar ao tubo 0,2 ml do reativo cloreto férrico e misturar bem. 
 Ao se adicionar o cloreto férrico, forma-se um precipitado abundante que se torna límpido após dez 
minutos. Se o precipitado persistir por mais de dez minutos, há formação de benzoato de sódio, indicando 
hidrólise do hipurato - prova positiva. 
 
PROVA DA GLICINA 
 
1. Inocular em um tubo contendo 0,4 ml de reativo hipurato de sódio o Streptococcus e 
misturar bem. 
2. Incubar durante duas horas. 
Acrescentar 0,2 ml do reativo ninhidrina e misturar bem. 
 
O aparecimento de uma cor púrpura logo após a adição do reativo de ninhidrina indica a presença 
de glicina, ou uma reação positiva da hidrólise do hipurato. 
 
Streptococcus eta hemolítico grupo A - 
Streptococcus eta hemolítico grupo B + 
 
 
PROVA DE CAMP 
 
 Identifica Streptococcus  hemolítico do grupo B. A atividade hemolítica da  lisina do 
Staphylococcus sobre os eritrócitos se intensifica por um fator extracelular produzido pelo Streptococcus 
do grupo B (Figura 7). 
 
Figura 7 - Prova de Camp 
 
PROTOCOLO: 
1. Semear em estria o Streptococcus a ser identificado de forma perpendicular a outra estria de uma cepa 
de Staphylococcus aureus produtor de  hemolisina (Figura 7). 
 Formaçâo de um seta = CAMP + . 
 
 
TESTE DA BACITRACINA 
 
As identificações devem ser feitas em ágar sangue sem tensão de CO2 ou os resultados podem ser 
conflitantes. 
 
PROTOCOLO: 
1. Semear meia placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma 
2. Colocar o disco de bacitracina 0,04 U. I. 
3. Incubar por uma noite a 35ºC sem CO2 
4. Observar a zona de inibição. 
Streptococcus pyogenes (grupo A) - halo de inibição maior ou igual a 12mm ( sensível) 
Streptococcus agalactiae ( grupo B) – halo menor ou igual a 11mm ( resistente) 
 
 
PYR TEST (L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide) 
 
O PYR TEST destina-se à identificação de Streptococcus pyogenes (Streptococcus Beta hemolítico 
do Grupo A) e Enterococcus spp. 
A hidrólise do L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide através da enzima L-pyroglutamyl-aminopeptidase, 
presente tanto no Streptococcus pyogenes como no Enterococcus spp, é verificada através da reação do 
PYR Reagente (-dimetilamina cinamaldeido) com a beta-naphtylamide livre, formando um composto final 
de coloração vermelha brilhante. 
 
PROTOCOLO 
 
. Com o auxílio de uma alça previamente flambada, fazer um esfregaço da bactéria recém isolada á ser 
identificada no disco ou fita de PYR umedecido. 
. Aguardar 5 minutos, a temperatura ambiente, e colocar uma gota do PYR Reagente. 
. As reações positivas ocorrem em até 1 minuto. 
 
LEITURA 
 
. PYR positivo: O desenvolvimento de uma cor vermelho-cereja indica resultado positivo para 
Streptococcus pyogenes ou Enterococcus spp. (Figura 8). 
. PYR negativo: Uma coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
HIDRÓLISE DA ESCULINA (Prova da Bile Esculina) 
 
 A prova da Bile Esculina está baseada na capacidade de certas bactérias, especialmente os 
Streptococcus do grupo D hidrolisar esculina em presença de bile produzindo glicose mais esculetina. A 
esculetina em presença de ferro (presente no meio) reage produzindo um escurecimento do meio de 
cultura. 
 A prova pode ser feita em placa semeando a cultura em meio de Bile Esculina e após incubação 
observa-se a zona marron escura ao redor da colônia = prova positiva; ou em tiras de papel Bile Esculina 
onde se observa o escurecimento do papel na zona de reação do microrganismo que hidrolisa a Esculina = 
prova positiva (Figura 9). 
 
Figura 9 – Hidrólise da esculina 
 
Streptococcus grupo D = positivo. 
Outros Streptococcus = negativo. 
 
TOLERÂNCIA A NACL 6,5% 
 
Os Enterococcus ( grupo D) crescem em meio que contenham 6,5% de NaCl, os não Enterococcus 
(grupo D) são inibidos. 
 
Observação: Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, 
seja Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D não enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste 
da tolerância ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos são positivos. 
 
PROVA BILE SOLUBILIDADE 
 
A prova de Bile Solubilidade pode ser realizada em meio líquido (com o microrganismo em estudo 
crescido) ou em placa (com colônias isoladas do microrganismo) sendo comumente realizada em placa . A 
turbidez de uma suspensão da bactéria em meio líquido clareia visivelmente quando adiciona-se o reativo 
desoxicolato de sódio ou taurocolato de sódio e as colônias crescidas na superfície do meio desaparecem 
(Figura 10). 
Figura 10 – Prova de Bile solubilidade. 
PROVA EM PLACA DE AGAR 
 
 PROTOCOLO: 
 
1. Sobre uma colônia bem rescida em placa de agar sangue, colocar uma gota de desoxicolato de sódio a 2% 
2. Inocular a placa a 350C durante 30 minutos 
 A colônia solúvel em bile desaparece deixando em seu lugar uma área parcialmente hemolisada - 
Prova Positiva = S. pneumoniae. 
 As colônias insolúveis em bile ficam intactas = Estreptococos  - hemolíticos. 
 
 
SUCEPTIBILIDADE A OPTOQUINA 
 
 A optoquina inibe seletivamente o desenvolvimento do S pneumoniae a uma concentração de 5 g 
ou menos, formando uma zona de inibição de 14 mm ou mais. Outros Streptococcus  hemolítico 
apresentam zona de inibição com menos de 10 mm ou são resistentes (Figura 11). 
Figura 11 - Suscetibilidade a optoquina 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Semear um quarto de uma placa de ágar sangue com a cepa alfa hemolítica a ser testada; 
5. Aplicar um disco de optoquina; 
6. Incubar a 35oC em tensão aumentada de CO2 - método da vela por 18 a 24 horas 
7. Uma zona de inibição de 14 mm ou mais à volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e identifica 
o Streptococcus pneumoniae. 
 
 
 Streptococcus pneumoniae = S 
 
 Streptococccus grupo viridans = R 
 
 
TABELA DE DIFERENCIAÇÃO PRÁTICA DAS ESPÉCIES DE STAPHYLOCOCCUS 
 
Espécie Prot. de 
superf. 
celular 
Produção 
de 
Hemolisina 
Sensi. a 
Novob 
5g 
HHialuruonidase Dnase Coagulase Catalase 
S. aureus + + * sensível + + + + 
S. 
epidermidis 
 - - sensível d - - + 
S. saprophyt- 
 ticus 
 
 
 - - resistente ND - - + 
* Geralmente dá resultados mas não para todas as cepas. 
 d = 11-895 de cepas são positivas 
 ND = O teste não determina a espécie 
 
 
TABELA DE IDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA DOS STREPTOCOCCUS 
 
 
GRUPOS 
Hemólise Bac. CAMP Hidrólise 
do 
Hipurato 
Susc. 
a 
Optoq. 
Bile 
Sol. 
Hidr. da 
Esc. 
Tol. 
NaCl 
6,5% 
PYR 
Grupo A beta 
 
+       + 
Grupo B beta 
 
 + +      
Grupo D 
Enterococcus 
alfa, beta, 
gama 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
+ 
 
+ 
 
+ 
Grupo viridans alfa, 
gama 
   R     
S. pneumoniae alfa 
 
   S +    
Grupo D 
não 
Enterococcus 
alfa, 
gama 
     +   
 
 
 Hem = Hem 
 Bac = Teste debacitracina 
 CAMP = Teste de CAMP 
 Hid. Hipurato = Hidrólise do Hipurato 
 Optoq. = Teste de optoquina 
 Bile Sol. = Prova de Bile Solubilidade 
 Hid Esculina = Hidrólise das Esculina 
 toler. NaCl 6,5% = Crescimento em 6,5% de Na Cl 
 PYR = Teste de PYR ( Pyrrolidonyl-Beta-Naphthylamida) 
 
 
NEISSERIA 
 
CARACTERÍSTICAS GERAIS: 
 
 São cocos Gram negativos, agrupados dois a dois, em forma de grãos de café. Esta morfologia típica 
só se observa nos exsudatos (no pus da uretrite gonocócica ou no líquor de meningite meningocócica), nas 
quais é característica a localização dos diplococos no interior de polimorfonucleares. Nas culturas, as 
Neisserias tendem rapidamente a autólise e coram-se palidamente, apresentando formas aberrantes de 
cocos minúsculos ou intumescidos (formas gigantes). Idênticas formas são observadas nos exsudatos de 
casos tratados com sulfas ou antibióticos. 
 São exigentes e requerem meios enriquecidos para crescimento (agar sangue, agar chocolate, 
thayer-martin). 
 A maioria das espécies necessitam para seu crescimento uma umidade relativamente elevada e 
uma tensão de CO2 entre 5 e 10%. Produzem catalase e citocromo oxidase. As espécies de maior interesse 
clínico são: N. gonorrhoeae e N. menigitidis. 
 
N. gonorrhoeae 
A N. gonorrhoeae (gonococo) é o agente causal da gonorréia ou blenorragia, sendo o homem o 
único hospedeiro natural. A infecção localiza-se primeiramente na uretra, daí podendo propagar-se a 
outros órgãos do aparelho urinário e genital, pode também se implantar no reto, na conjuntiva ocular e nas 
articulações. As infecções gonocócicas nem sempre são sintomáticas e tanto homens como mulheres 
podem servir como portadores. Não é capsulada. Utiliza glicose. 
 
Coloração de Gram 
 
Figura 12 - N. gonorrhoeae (gonococo) 
 
 
 
 
 
 N. meningitidis 
 
 A N. meningitidis (meningococo) é o agente causador da meningite cérebro-espinhal, que 
caracteríza-se por febre, cefaléia interna, náusea, vômitos, rigidez na nuca e, freqüentemente “rasch” 
petequial. Possuem capsula. Utiliza glicose e maltose. 
 
DIFERENCIAÇÃO PRÁTICA DAS ESPÉCIES DE NEISSERIA 
 
São realizadas provas de utilização de hidrato de carbono. 
 
 
 Espécie glicose maltose sacarose lactose 
 
N. gonorrhoeae + - - - 
N. meningitidis + + - - 
 
 
ENTEROBACTÉRIAS 
 
 
PROVAS MAIS UTILIZADAS 
 
- Fermentação de lactose 
- Redução de Nitratos 
- Atividade de Citocromo-oxidase 
- Atividade de descarboxilase (lisina, ornitina e arginina) 
- Produção de Sulfeto de hidrogênio 
- Produção de Indol 
- Utilização de Citrato 
- Reação de Vermelho de metila 
- Motilidade 
- Atividade de ortonitrofenil galactosidade (ONPG) 
- Produção de Acetil-metil-carbinol (Voges-Proskauer) 
- Produção de urease 
 
 
FERMENTAÇÃO DE LACTOSE 
 
 Por definição, a fermentação é um processo metabólico de oxidação-redução que tem lugar em um 
ambiente anaeróbico; no qual um substrato orgânico serve como aceptor de hidrogênio (elétron) em lugar 
do oxigênio. Nos sistemas de provas bacteriológicas este processo é detectado por observação visual das 
mudanças de cor dos indicadores de pH quando os produtos ácidos são formados. 
 A lactose é um dissacarídeo composto por glicose e galactose ligadas por um átomo de oxigênio 
(ligação galactosídica). A hidrólise desta ligação é feita pela enzima -galactosidase e a transmigração da 
lactose através da parede celular é feita pela enzima -galactosidase-permease. A ausência de uma dessas 
duas enzimas impede a utilização da lactose pela bactéria. A fermentação da lactose prossegue com a 
degradação da glicose através da via EMP (Embden – Meyerhof). 
 
 
 
 
 
 GLISOSE 6-FOSFATO 
 FRUTOSE 6- FOSFATO 
 FRUTOSE 1,6 DIFOSFATO 
 GLICERALDEÍDEO 3-FOSFATO 
 
 
Figura 13 – Fermentação ácida mista através da via de Embden – Meyerhof. 
 
 Os meios mais utilizados para identificação de bacilos fermentadores são o agar-ferro de Klinger 
(KIA) e o agar tríplice-açúcar-ferro (TSI). As fórmulas de KIA e TSI são idênticas, exceto que o TSI contém 
10g por litro de sacarose, além de glicose e lactose. O meio deve ser colocado no tubo de ensaio, de modo 
que a extensão da parte inclinada seja igual a da profunda, com a aproximadamente 3 cm cada uma. esta 
configuração resulta em duas câmaras de reação em um mesmo tubo, sendo a porção inclinada aeróbia e a 
porção inferior ou base, relativamente anaeróbia. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Tocar a colônia de bactéria a ser identificada com uma laça de inoculação em agulha. 
2. Inocular a bactéria atravessando a parte profunda do meio inclinado, até atingir cerca de 3 mm a 5 mm 
do fundo do tubo. 
3. Após remoção da laça da parte profunda do meio, fazer estrias na superfície inclinada com um 
movimento em S. 
4. Incubar os tubos em estufa de 360C durante 18 a 24 horas. 
5. Fazer a leitura, obedecendo os critérios abaixo: 
 
- Ápice vermelho / Base vermelha (alcalino – alcalino)  Ausência de fermentação de carboidratos. 
- Ápice vermelho / Base amarela (alcalino – ácido)  Fermentação de glicose. 
GLICOSE 
ÁCIDO 
PIRÚVICO 
Ácido Propiônico 
Ácido Succínico 
Acetaldeído 
Álcool Etílico 
Ácido 
Fórmico 
Acetil 
CoA 
Ácido 
Acético 
Acetil-Metil 
(Acetoína) Ácido Butírico 
Álcool Butílico 
2,3 Butilano 
(glicol) 
(Butanodiol) 
ÁCIDO LÁTICO 
H2 + CO2 
- Ápice vermelho / Base amarela (negra) (alcalino – ácido – negra)  Fermentação de glicose + produção 
de H2S. 
- Ápice amarelo / Base amarela (ácido – ácido)  fermentação de glicose, lactose e sacarose. 
 
REDUÇÃO DE NITRATOS 
 
 Todas as enterobactérias , exceto certos biotipos de Enterobacter agglomerans e Erwinia, reduzem 
nitratos. Os organismos que reduzem nitratos têm a capacidade de retirar oxigênio dos nitratos para 
formar Nitritos e outros produtos de redução. 
 
 NO3 + 2e
- + 2H NO2 + H2O 
 Nitrato Nitrito 
 
 A presença de Nitratos no meio teste é detectada pela adição de -naftilamina e ácido sulfanílico, 
com a formação de um corante de diazônio vermelho, -sulfabezeno-aro- -naftilamina. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Inocular uma alçada cultura a ser identificada no maio de Nitrato. 
2. Incubar a 350C durante 18 a 24 horas. 
3. Após a incubação, adicionar ao meio 1 ml de reativo A (5g de -naftilamina + 1l de ácido acético [5N], 
30%) e logo após, 1 ml do reativo B (8g de ácido sulfanílico + 1l de ácido acético [5N], 30%). 
4. O aparecimento de uma cor vermelha dentro de 30 segundos após a adição dos reativos indica a 
presença de Nitritos. 
 
ATIVIDADE DE CITOCROMO-OXIDASE 
 
 Todas as enterobactérias são citocromo-oxidase-negativa. O sistema citocromo é encontrado nos 
organismos aeróbios e microaeróbios e anaeróbios facultativos. O teste da oxidase é importante na 
identificação de organismos que não possuem a enzima ou são anaeróbios obrigatórios. 
 Os citocromos participam da última ligação da cadeia respiratória transferindo elétrons (hidrogênio) 
ao oxigênio, com formação de H2O. No teste de citocromo oxidase, são usados reativos corantes 
dicloridrato de -fenilenodiamina,que atuam como aceptores de elétrons substituindo o oxigênio. A -
fenilenodiamina é incolor no estudo reduzido, mas na presença de citocromo oxidase o oxigênio se oxida 
formando azul de indofenol Figura 14). 
 
Figura 14 - Citocromo oxidase. 
 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Adicionar às tiras de oxidase, uma alça da colônia que se quer identificar. 
2. Esperar 10 segundos e observar o aparecimento de uma cor azul escura no local da inoculação 
(Citocromo oxidase positiva). 
 
Obs.: Nãos e deve usar alças de inoculação de aço inoxidável porque os produtos de oxidação formados na 
superfície, ao serem esterelizados na chama, podem produzir reações falso-positivas. 
 
ATIVIDADE DE DESCARBOXILASE (LISINA, ORNITINA E ARGININA) 
 
 A reação de descarboxilação é produzida pelas enzimas descarboxilases, que são capazes de atuar 
na porção carboxila (COOH) dos ácidos, formando aminas de reação alcalina. Cada enzima descarboxilase é 
específica para um aminoácido. Os aminoácidos freqüentemente avaliados na identificação das 
enterobactérias são lisina, ornitina e arginina; a lisina produz a amina específica cadaverina; ormitina 
produz putrescina e arginina, citrulina. Na conservação de arginina em citrulina ocorre uma desidrose. 
 
PROTOCOLO: 
1. Inocular uma colônia do microrganismo em estudo em dois tubos com caldo descarboxilase de Moeller, 
um contendo o aminoácido a ser avaliado e o outro como controle; sem aminoácido. 
2. Colocar uma camada de óleo mineral estéril nos dois tubos, até completar aproximadamente 1 cm da 
superfície do meio. 
3. Inocular a 350C durante 18 a 24 horas. 
Tubo controle = amarelo. 
Tubo contendo aminoácido descaboxilado = púrpura (positivo). 
Tubo contendo aminoácido sem haver reação de descarboxilação = amarelo (negativo). 
 
PRODUÇÃO DE SULFETO DE HIDROGÊNIO 
 
A produção de H2S pode ser detectada em um sistema analítico, se as seguintes condições estiverem 
presentes: 
a) Existir uma fonte de enxofre no meio (peptonas, tisulfato de sódio). 
b) Existir um indicador de H2S no meio (Citrato férrico, sulfato ferroso, ferro peptonado, etc.). 
c) O meio favoreça o crescimento da bactéria e a bactéria possua os sistemas enzimáticos produtores de 
H2S. 
Em todos os sistemas de detecção de H2S, o ponto final é um precipitado negro, insolúvel, de sulfeto de 
metal pesado, formado no meio. 
Pode-se observar este enegrecimento no meios TSI, SIM, KIA, etc. (Figura 15). 
Figura 15 - Produção de sulfeto de hidrogênio 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Inocular no meio TSI ou SIM o microrganismo a ser identificado. 
2. Inocular a 350C durante 18 a 24 horas. 
3. Observar o precipitado negro ao longo do tubo  positivo. 
Ausência do precipitado  negativo. 
 
 
 
 PRODUÇÃO DE INDOL 
 
O indol é um dos produtos do metabolismo do aminoácido triptofano. As bactérias que possuem a 
enzima triptofanase, são capazes de degradar o triptofano com produção de indol, ácido pirúvico e 
amônia (NH3). O indol pode ser detectado em meio apropriado através do desenvolvimento de cor 
vermelha, após a adição de uma solução contendo -Dimetilamino-benzaldeido. Pode-se utilizar os 
meios sulfeto-indol-motilidade (SIM), motilidade-indol-ortina (MIO), indol-nitrato ou tiras impregnadas 
com reativo de KOVAC. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Inocular o microrganismo, em estudo, no meio contendo triptofano. 
2. Incubar a 350C durante 18 a 24 horas. 
3. Após o período de incubação, adicionar 15 gotas do reativo de KOVAC. 
4. O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfície de contato entre o meio de cultura e o 
reativo, segundos após a adição, indica a presença de indol = prova positiva. 
 
 UTILIZAÇÃO DE CITRATO 
 
Algumas bactérias podem obter energia por via diferente da fermentação de carboidratos, utilizando 
citrato como única fonte de carbono. Qualquer meio utilizado para detectar a utilização de citrato pelas 
bactérias em estudo deve ser isento de proteínas e carboidratos como fontes de carbono. A utilização 
de citrato por uma bactéria é detectada em meio de citrato (fórmula de Simmons), através da produção 
de subprodutos alcalinos. o meio contém citrato de sódio como única fonte de carbono, fosfato de 
amônia como única fonte de nitrogênio e o azul de bromotimol como indicador (amarelo em pH abaixo 
de 6,0 e azul em pH acima de 7,6). As bactérias capazes de utilizar o citrato são também capazes de 
extrair nitrogênio do sal de amônio, com produção de amônia, levando à alcalinização do meio, a partir 
da conversão do NH3
+ em hidróxido de amônia (NH4OH). 
 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Semear uma colônia obtida de um isolamento primário em um tudo de ágar citrato. 
2. Inocular o tubo a 350C durante 24 a 48 horas. 
3. O desenvolvimento de uma cor azul escura indica que a bactéria foi capaz de utilizar o citrato 
contido no meio, com formação de produtos alcalinos. 
azul escuro = positivo 
Crescimento visível de colônias ao longo do tubo = positivo (se inoculado por mais de 24 horas 
aparecerá a cor azul) (Figura 16). 
Figura 16 - Utilização de citrato. 
 
 
 REAÇÃO DE VERMELHO DE METILA 
 
 A prova de vermelho metila é uma análise quantitativa de produção de ácido e requer organismos 
positivos que produzam ácidos fortes (láctico, acético, fórmico) a partir da glicose através da via da 
fermentação ácida mista. 
 O vermelho de metila só é considerado positivo após a inoculação prolongada (48 a 72 horas) 
superando o sistema estabilizado de pH do meio; as bactérias que formam ácidos fortes descartáveis 
pelo indicador vermelho de metila somente durante as fases iniciais de incubação não são consideradas 
positivas. O meio freqüentemente utilizado é o caldo vermelho de metila Vorges-Proskauer (VM/VP), 
formulado por Clark Leebs (verificar a figura 1). 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Inocular o microrganismo em estudo no caldo vermelho de metila. 
2. Incubar o caldo a 350C durante 48 a 72 horas. 
3. Após o período de incubação adicionar 5 gotas do reativo vermelho de metila ao caldo. 
4. O desenvolvimento de uma cor vermelha estável na superfície do meio indica uma prova positiva. 
 
PRODUÇÃO DE ACETIL-METILCARBINOL (ACETOÍNA) VOGES-PROSKAUER 
 
 A acetoína é um subproduto da via butileno glicol. Organismos como os membros do grupo 
Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia, produzem acetoína como principal subproduto do metabolismo da 
glicose e formam quantidades menores de ácidos mistos. na presença de oxigênio atmosférico e de 
hidróxido de potássio a 40%, a acetoína é convertida em diacetila e o -naftol atua como catalisador para 
revelar um complexo de cor vermelha (verificar a figura 1). 
 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Inocular em caldo vermelho de metila/Voges Prokskauer o microrganismo em estudo. 
2. Incubar durante 24 horas a 350C. 
3. Após o período de incubação, transferir 1ml de caldo para um tubo estéril e adicionar 0,6 ml de -
naftol a 5% e, 0,2 ml de KOH a 40%. 
4. Agitar o tubo suavemente e deixa-lo repousar durante 10 a 15 minutos. 
5. O aparecimento de uma cor vermelha 15 minutos ou mais após a adição dos reativos indica a presença 
de diacetila, produto de oxidação da acetoína e uma prova positiva. 
 
Obs.: Não fazer a leitura após o período de 1 hora. 
 
ATIVIDADE DE ORTONITROFENIL GALACTOSIDASE 
 
 Esta prova permite a detecção da enzima -galactosidase muito mais rapidamente que a prova de 
fermentação da lactose. Isto é útil na identificação dos organismos fermentadores tardios de lactose que 
são deficientes em -galactosidase-permease. O ortonitrofenil-galactosideo (ONPG) é estruturalmente 
semelhante à lactose, exceto que a glicose foi substituída pelo ortonitrofenil. Através da ação da enzima -
galactosidase, o ONPG hidrosila desdobrando-se em dois resíduos galactosidase e ortonitrofenol. 
 
 
 
 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Transferir uma laçada d bactéria em estudo de meios de cultura contendolactose (KIA,TSI) para um 
tubo contendo 0,5 ml de solução fisiológica, formando uma suspensão abundante. 
2. Adicionar à suspensão uma gota de tolueno e misturar vigorosamente durante alguns segundos 
(liberação de enzima). 
3. Adicionar à suspensão uma gota do reativo ONPG. 
4. Colocar em banho-maria a 370C. 
 
A maior parte das provas são positivas em 1 hora, embora, possa ocorrer a visualização da cor amarela 
com 5 a 10 minutos, porém as reações não devem ser interpretadas como negativas antes de 24 horas de 
incubação. 
 
 PRODUÇÃO DE UREASE 
 
Os microrganismos que possuem a enzima urease têm a capacidade de hidrolisar a uréia com liberação 
de amônia. A amônia reage em solução para formar carbono de amônia, resultando na alcalinização e 
aumento do pH do meio. O caldo de uréia de Stuart e o agar uréia de Christensen são os dois meios mais 
comumente utilizados nos laboratórios clínicos para a detecção de atividade de urease (Figura 17). 
 
Figura 17 - Produção de urease. 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Inocular o caldo com uma laçada do organismo em estudo ou estriar a superfície do agar. 
2. Incubar os dois meios a 350C durante 18 a 24 horas. 
 
As bactérias que hidrolisam a uréia rapidamente podem produzir reações positivas dentro de 1 a 2 
horas; as espécies menos ativas podem requerer 3 ou mais dias. 
 
 CALDO STUART AGAR DE CHRISTENSEN 
 
Cor vermelha em 
todo o meio Positivo Positivo 
 (Espécies de Proteus) 
 
Cor vermelha inicial 
somente no ápice e ND Positivo 
gradualmente em (Espécie de Klebsiella) 
todo o meio 
 
Cor amarela ND Negativo 
 
 
Motilidade 
 As bactérias movem-se por meio de flagelos que variam em número e localização nas diferentes 
espécies. As colorações de flagelos são úteis para esta determinação, porém não são comumente usadas 
em laboratórios clínicos. 
 Os meios para provas de motilidade possuem concentrações de agar 0,4% ou menos (agar semi-sólido). 
 A prova de motilidade é interpretada realizando-se um exame macroscópico do meio para observar 
uma zona de crescimento difusa, que parte da linha de inoculação. Podem ser usados os meios SIM, MIO 
ou o meio teste de motilidade. Entre as enterobactérias, as espécies de Shigella e Klebsiella são imóveis. A 
maior parte das espécies móveis de enterobactérias pode ser detectada a 350C, porém Yersinia 
enterocolítica é móvel a 220C mas não a 350C, isto porque as suas proteínas flagelares se desenvolvem 
mais rapidamente em temperaturas mais baixas. A Pseudomonas aeruginosa, aeróbia obrigatória, produz 
uma película que se estende sobre a superfície em forma de leque, a partir da linha de inoculação, porque 
não cresce nas partes mais profundas do meio, deficiente em oxigênio. 
 
PROTOCOLO 
1. Inocular em “picada” a bactéria em estudo nos meios apropriados. 
2. Incubar a 350C durante 18 a 24 horas. 
3. Observar, após o período de incubação, o desdobramento em forma de leque, a partir da linha de 
inoculação = motilidade positiva. 
 
TABELA DE IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTÉRIAS 
Bactéria G/G LAC H2S URE IND MOB ORN LIS CIT FAL 
E.coli + + - - + +/- +/- + - - 
Shigella - - - - -/+ - -/+ - - - 
 
Salmonella + - + - - + + + + - 
 S. typhi - - + - - + - + - - 
 C.freundii + -/+ + +/- - + -/+ - + - 
 C.diversus + -/+ - +/- + + + - + - 
 
K pneumoniae + + - + - - - + + - 
K. oxytoca + + - + + - - + + - 
Enterobacter + + - - - + + + + - 
E. aerogenes + + - - - + + + + - 
Serratia + + - - - + + +/- + - 
 
P. vulgaris + - + + + + - - +/- + 
P. mirabilis + - + + - + + - -/+ + 
 
P. rettgeri -/+ - - + + + - - + + 
P. Stuartii - - - -/+ + + - - + + 
 
M. morgani + - - + + + + - - + 
 
Edwardsiella + - + - + + + + - - 
 
Y. enterocolit. - - - +/- +/- - + - - - 
COPROCULTURA 
Legenda: 
 
G/G = Glic./Gás URE = Uréia ORN = Ornitina Descarboxilase 
LAC = Lactose IND = Indol LiS = Lisina Descarboxilase 
H2S = Gás Sulfídrico MOB = Mobilidade FAL = Fenilalanina Desaminase 
 
 
PROTOCOLOS DE IDENTIFICAÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 16 – 24 hs / 370C 18 – 24 hs / 370C 
_______________________ ______________________ 
 
 
 
 
 IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA(2)  
 
Agar Inclinado TSI Ureia Mio LIA CIT FAL (18-24 hs /370) 
 
 
 
 Salina 
 
 
 Antibiograma (4) 
 
 
 
 
 
 
 
(1) Meios de enriquecimento seletivo de enterobactérias. 
(2) bateria padrão de provas bioquímicas de identificação. 
(3) Provas sorológicas para confirmação de patógenos entéricos. 
(4) O antibiograma deve ser realizado após confirmação de patógenos por sorologia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Amostra Fecal 
Caldo Tetrationato/Selenito F 
(1) 
 
6-8 horas / 37
0
 C 
Agar EMB Agar SS 
Agar Hektoen Agar SS 
Sorologia 
(3)
 - Salmonella 
 
 - E. coli 
TSI = triple sugar iron Ureia = Ureia de Christensen 
LIA = lisine iron agar MIO = mobilidade 
CIT = citrato de Simmons FAL = fenilalanina 
 
 
 
 
 Fezes 
 
 
 
 
 
 Lactose (+) Lactose (-) 
 
 
 
E. Coli / Coliformes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CITROBACTER: Lactose (-/+), Ureia (+/-), H2S (+/-), Indol (+/-), Lisina (-) 
 
 H2S 
 
 
 (+) (-) Malonato 
 
Citrobacter freundil 
 Fenilalanina 
(+) 
 
Identificação Bioquímica Simplificada dos Principais Gêneros: 
Pesquisa de Leucócitos 
Agar E M B Agar SS 
TSI / Ureia H2S no TSI 
(-) (+) 
 Shigella Salmonella 
Sorologia 
Proteus / Providencia/ MorganellaSalmonella: Lactose (-), Ureia (-), H2S (+), Indol (-), Lisina (+) 
 
 Citrato 
 
 
(+) (-) 
S. enteritidis 
Ornitina (+) S. brotyphi Sorologia 
(-) S.cholerae suis 
(+) C. diversus 
(-) C. amalonaticus 
 
 Fenilalanina 
(+) 
+ 
- 
ENTEROBACTER: Lactose (+), Ureia (+/-), H2S (-), Indol (-), Lisina (+/-) 
 
 Lisina (+) E. cloacae 
(+) (-) Ornitina 
 (-) E. agglomerans 
 
 
E. aerogenes 
 
 
PROTEUS: Lactose (-), Ureia (+), H2S (+), Lisina (-) 
 
 (+) Proteus vulgaris 
 
Indol 
 (-) Proteus mirabilis 
 
 
PROVIDENCIA: Lactose (-), Ureia (+/-), H2S (-), Indol (+), Lisina (-) 
 
 
 Ureia 
 
 (+) (-) 
 
 
 Adonitol Citrato 
 (+) (-) (+) (-) 
 
 
 P. rettgeri P. stuarii P. alcalifasciens P. rustigianii 
 
Alguns esquemas necessitam de complementação com algumas provas que não são 
necessariamente utilizadas na rotina diária de laboratório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBSERVAÇÃO: PODE-SE UTILIZAR TAMBÉM O MEIO CLED EM SUBSTITUIÇÃO DO SANGUE E EM B 
Sangue 
UROCULTURA 
Alça calibrada (0,001 mL) 
EMB 
ANTIBIOGRAMA 
 
 
Provas de Identificação 
 
Protocolo: 
 
1. Homogeneizar a urina; 
2. Com alça de platina calibrada (0,001mL) retirar uma alçada de urina; 
3. Inocular nos meios EMB e sangue (com a mesma alçada de 0,001mL); 
4. Incubar as placas a 37ºC por 24h; 
5. Após 24h, observar o crescimento, contar as colônias (se houver) e calcular (multiplicar pelo fator 
de diluição = 1000) 
 
Gram + : nº de colônias no sangue x 2 x 1000 
Garm – : (nº de colônias no sangue + nº de colônias no EMB) x 1000 
 
6. Se não houver crescimento, incubar por mais 24h 
7. Em caso positivo, realizar as provas de identificação 
 
Resultados: 
 
- Até 10.000 UFC/mL = contaminação 
- 10.000 a 90.000 UFC/mL = suspeita de infecção 
- Mais de 100.000 UFC/mL = indício de infecção (suspeita de contaminação na coleta) 
 
Coleta da urina: 
 
- Coleta de jato médio em tubo ou frasco estéril (deve ser entregue ao paciente um folheto 
explicativo junto com o recipiente de coleta) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sangue 
CULTURA DE OROFARINGE / SECREÇÃO 
Coleta com Swab 
EMB 
Gram 
Caldo BHI / TSB 
(37ºC / 2-6h) 
Sabouraud 
(pesquisa de fungos) 
Identificação 
Antibiograma 
Manitol Salgado 
(pesquisa de S. aureus) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 – 48 horas após o cultivo primário fazer o subcultivo 
 
Período máximo de incubação: 7 dias (se as culturas permanecerem sem crescimento 
o resultado do teste é negativo) 
HEMOCULTURA 
COLETA 
Anticoagulante: Polianetol Sufonato de Sódio 
(SPS) 0,05mL 
1:10 (Sangue:meio de cultura) 
Aerobiose 
(BHI – caldo Columbia) 
Anaerobiose 
(Tioglicolato) 
Agar Chocolate Agar Sangue EMB Thayer-Martin 
Subcultivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 SECREÇÃO URETRAL/VAGINAL (segundo Silva, 2005) 
Gram 
 Giemsa 
Swab 1 Swab 2 
Stuart 
a fresco ou 
tempo real 
A.S. e 
A.H. 
G.C. ou 
A.ch 
S.B. 
Swab 3 
MYCOGEN 
Swab 4 
 
C T 
Chlamydia 
A.S. – Agar sangue de carneiro 5% 
 
A.H. – Agar sangue humano 5% 
 
C.G. – Thayer-Martin 
 
S.B. – Sabouraud 
 
MYCOGEN – Mycoplasma 
 
A. ch – Agar chocolate 
MICROSCOPIA 
DECISÃO 
CULTURA DE SECREÇÃO URETRAL/VAGINAL 
COLETA 
 
Gram 
Thayer-Marttin Caldo BHI/TSB 
Oxidase 
(–) (+) 
Agar Sangue EMB 
Caldo TSB 
Antibiobrama Testes de Identificação 
para Neisseria 
(glicose, maltose, lactose) 
 
Testes de Identificação 
para Gram (+) e (–) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Coagulase 
IDENTIFICAÇÃO DE COCOS 
CATALASE 
Staphylococcus Streptococcus 
Grupo A 
PYR + 
 - hemólise 
Bac – S 
 
( + ) ( – ) 
S. epidermidis (nov – S) 
S. saprophyticus (nov – R) 
 
DNAse – 
Manitol – 
S. aureus 
 
Nov – S 
Manitol + 
Hemolisina + 
DNAse + 
 ou  - hemólise 
Provas Negativas 
Identificação Sorológica 
(Grupos A, B, C, D, E, F, G) 
Grupo B 
S. agalactiae 
CAMP + 
 
Grupo D 
Bile Esculina 
 
NaCl 6,5% 
Enterococcus 
(PYR +) 
Não Enterococcus 
(PYR –) 
( + ) 
( – ) 
Grupo 
Viridans 
Optoquina 
R S 
S. pneumoniae 
CULTURA DE LCR 
COLETA 
 
Gram 
EMB Agar Sangue 
 
Agar Chocolate Enriquecido 
Esquema de Identificação 
Centrifugação 
Antibiograma 
Ziehl-Neelsen 
TESTE DE SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA 
 
ANTIBIOGRAMA 
 
 Os testes de suscetibilidade antimicrobiana medem a capacidade de um antibiótico ou outro agente 
microbiano inibir o crescimento bacteriano “in vitro”. 
 Estes testes devem ser feitos no laboratório clínico por dois motivos principais. 
 
 Para guiar o clínico na seleção do melhor agente antimicrobiano para o paciente. 
 Para acumular informações epidemiológicas sobre a resistência de microrganismos de importância em 
saúde pública dentro da comunidade. 
 
O método de difusão em disco, recomendado pelas agências oficiais, usando como método de 
referência e técnica de rotina em laboratório clínico é o Bauer-Kirby modificado. 
 
 
MÉTODO MODIFICADO DE BAUER & KIRBY 
 
PROTOCOLO: 
 
1. Distribuir o meio Müeller-Hinton em placa, formando uma superfície nivelada, com profundidade de 
aproximadamente 4 mm. 
2. Secar as placas por 10-30 minutos a 350C. As placas não utilizadas podem ser estocadas em sacos 
plásticos no refrigerador por 2 semanas. 
3. Transferir 3 a 5 colônias do microrganismo a ser testado, da placa de isolamento primário, para um 
tubo com 5 ml de solução salina. 
4. Comparar o tubo com o padrão de Turbidez da Escala de McFarland (N: 0,5 de turbuidez), e ajustar a 
densidade da suspensão do teste ao padrão, adicionando mais bactérias ou solução salina. 
5. Fazer a semeadura da suspensão bacteriana com um “swab”, passando-o sobre toda superfície do meio 
de cultura por três vezes, girando a placa num ângulo de 600 após cada aplicação, em seguida passar o 
“swab” ao redor das bordas as superfície do agar. 
6. Deixar o inóculo secar por alguns minutos a temperatura ambiente. 
7. Colocar os discos de antibióticos sobre a superfície do meio semeado assepticamente e uniformemente 
obedecendo a mesma distância. Deve-se colocar um máximo de sete discos por placa; seis podem ser 
distribuídos em espaços iguais aproximadamente 15 mm da borda da placa, e um disco colocado no 
centro. Cada disco deve ser delicadamente pressionado para assegurar contato uniforme com o meio. 
8. Esperar 30 minutos após a colocação dos discos e incubar a 350C por um período de 16 a 18 horas. 
9. Fazer a leitura medindo o diâmetro de cada zona de inibição em mm. 
 
 
O método de Bauer & Kirby e suas modificações reconhecem três categorias de suscetibilidade: 
suscetível, suscetibilidade intermediária, resistente (Tabela 2). 
 
- Suscetível  quando a infecção causada pelo microrganismo está propensa a responder ao tratamento 
com a droga, na dose recomendada. 
- Suscetibilidade intermediária  é aplicável a cepas que são “moderadamente suscetíveis” a um 
antibiótico que pode