Aula 07_TBL

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Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Departamento de Genética e Evolução – DGE
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – CCBS
Universidade Federal de São Carlos – UFSCar
e-mail: lisgava@ufscar.br
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
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Limpeza Desinfecção Esterilização
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
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ESPORULAÇÃO
�A formação do esporo ocorre pela 
invaginação de uma dupla camada de 
membrana celular que se fecha para envolver 
um cromossomo e uma pequena quantidade de 
citoplasma, garantindo a sobrevivência da 
ESPORULAÇÃO
�A formação do esporo ocorre pela 
invaginação de uma dupla camada de 
membrana celular que se fecha para envolver 
um cromossomo e uma pequena quantidade de 
citoplasma, garantindo a sobrevivência da 
espécie. 
�Processos capazes de matar células na forma 
vegetativa não são suficientes contra a célula na 
forma esporulada. 
�O esporo é uma camada que protege a 
bactéria e é responsável pela resistência e ao 
ataque dos agentes físicos e químicos da 
esterilização e desinfecção.
espécie. 
�Processos capazes de matar células na forma 
vegetativa não são suficientes contra a célula na 
forma esporulada. 
�O esporo é uma camada que protege a 
bactéria e é responsável pela resistência e ao 
ataque dos agentes físicos e químicos da 
esterilização e desinfecção.
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Métodos físicos
• Calor (vapor – condições úmidas)/autoclaves 
• Calor seco 
Métodos físicos
• Radiação
• Filtração 
Métodos químicos e 
físicos/químicos
•Glutaraldeído 
•Formaldeído 
•Ácido peracético
•Óxido de Etileno (ETO) 
•Plasma de Peróxido de Hidrogênio 
•Plasma de gases (vapor de ácido peracético e peróxido de hidrogênio; 
oxigênio, hidrogênio e gás argonio) 
•Vapor de Formaldeído
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Calor mata os microrganismos desnaturando suas proteínas.
Perda da estrutura tridimensional das proteínas = inativação;
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Técnicas que utilizam calor para esterilização:
Facilidade de uso, controlabilidade e eficiência.
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A água utilizada para a produção de vapor utilizado na esterilização deve estar 
livre de contaminantes em concentração que possam interferir no processo de 
esterilização, danificar o aparelho ou os produtos a serem esterilizados;
O processo de esterilização pelo vapor sob pressão é o método mais utilizado e o 
que oferece maior segurança ao ambiente (laboratório, hospitais);
esterilização, danificar o aparelho ou os produtos a serem esterilizados;
Os equipamentos utilizados para este método de esterilização são as autoclaves:
Existem vários tipos de autoclaves: autoclaves de paredes simples, paredes 
duplas, gravitacional, alto vácuo, vácuo único e vácuo fracionado.
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As autoclaves podem ainda ser do tipo:
�Horizontal
�Vertical
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Autoclave de paredes simples
Formada por um cilindro metálico resistente, 
vertical ou horizontal, e com uma tampa que 
permite fechar hermeticamente a autoclave. 
Essa tampa apresenta parafusos e uma anilhaEssa tampa apresenta parafusos e uma anilha
que impedem o escape de pressão.
Um ciclo completo de esterilização constitui-se 
basicamente de três etapas: 
Aquecimento, Esterilização e Secagem
Após a realização das três etapas completas a esterilização 
está completa
Autoclave de paredes simples
Os autoclaves não necessitam 
de termômetro para indicar a 
que temperatura se encontra o vapor de água 
no seu interior visto que existe uma relação 
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Em laboratórios de Microbiologia, Biologia Molecular e Bioquímica
é usual esterilizar o material a 121 °C (15 psi) durante 15-20 min
no seu interior visto que existe uma relação 
direta entre a pressão do vapor de água e a 
temperatura desse mesmo vapor.
REMOÇÃO DO AR:
penetração do vapor em toda a câmara e nos materiais→→→→ ar deve ser removido;
ADMISSÃO DO VAPOR:
iniciado pela entrada do vapor, substituindo o ar no interior da câmara;
O TEMPO DE EXPOSIÇÃO :O TEMPO DE EXPOSIÇÃO :
→→→→marcado quando a temperatura/pressão de esterilização é atingida;
EXAUSTÃO DO VAPOR: é realizada por uma válvula ou condensador. A exaustão pode ser
rápida para “artigos de superfície”. Para líquidos a exaustão deve ser o mais lenta
possível para se evitar a ebulição, extravasamento ou rompimento do recipiente;
SECAGEM DOMATERIAL ESTERILIZADO: estufas de secagem.
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1. Não sobrecarregue a autoclave com excesso de 
material.
2. Ajuste o tempo de esterilização de acordo com a 
carga contida na autoclave.
3. É essencial que todo o ar contido na autoclave no 
início do processo seja substituído por vapor 
d’água. Se o ar estiver presente no interior da 
autoclave isso diminuirá a temperatura interna do 
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autoclave isso diminuirá a temperatura interna do 
equipamento. LEMBRE-SE QUE É A 
TEMPERATURA E NÃO A PRESSÃO QUE DESTRÓI 
OS MICRORGANISMOS.
4. Certifique-se que os frascos onde serão 
esterilizados os meios e soluções são de 
borosilicato ou de plástico “autoclavável”, caso 
contrário eles deformarão com o calor.
1. Para a esterilização de frascos contendo soluções ou meios de 
cultura com tampa de rosca, estes devem estar fechados 
somente com “meia rosca”, nunca completamente vedados. 
2. Observe sempre o nível da água no interior da autoclave antes 
de iniciar um novo ciclo de esterilização. Sem água a 
resistência do equipamento que aquece a água irá queimar.
3. Posicione os frascos e materiais diversos a serem esterilizados 
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3. Posicione os frascos e materiais diversos a serem esterilizados 
na autoclave de forma a haver espaço entre eles para permitir 
a circulação do calor úmido no interior da câmara durante o 
ciclo de esterilização.
4. Não esterilize “material contaminado” e “material limpo”, 
como meio de cultura, por exemplo, no mesmo ciclo de 
esterilização.
5. Após a esterilização de soluções e meios de cultura deixe os 
frascos atingirem a temperatura ambiente..
1. Mesmo que você não precise de uma solução ou tampão estéril, é aconselhável 
esterilizar esse material, pois crescimento microbiano pode alterar o pH e com isso 
modificar a função e a natureza do tampão. 
2. Antes de esterilizar em autoclave uma solução ou meio de cultura certifique-se que 
elas não contêm componentes termo sensíveis que podem ser inativados pelo calor. 
Caso isso ocorra o material deverá ser esterilizado por filtração. 
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3. Certifique-se que a autoclave atingiu a pressão ambiente antes de abri-la após o 
ciclo de esterilização.
4. Após aesterilização, aguarde o resfriamento dos frascos no interior da autoclave e 
após isso feche os frascos que estavam em “meia rosca” completamente para evitar 
contaminação.
LÍQUIDOS EM GARRAFAS:
Capacidade (mL) Tempo(minutos)
75 25
250 30
500 40500 40
1000 45
1500 50
2000 55
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INDICADORES QUÍMICOS: 
Fitas de papel impregnadas com uma tinta termocrômica que mudam de cor quando 
expostas à temperatura elevada por certo tempo. 
INDICADORES BIOLÓGICOS: 
A utilização destes indicadores permite a comprovação da eficiência da esterilização, A utilização destes indicadores permite a comprovação da eficiência da esterilização, 
uma vez que o crescimento de microrganismos após a aplicação do processo é 
diretamente testado. Este indicador consiste em uma preparação padronizada de 
esporos bacterianos em suspensões que contém em torno de 106 esporos por unidade 
de papel. Após o processamento dos indicadores, eles devem ser incubados juntamente 
com um outro que não tenha passado pelo processo de esterilização para se verificar se 
as cepas ainda são viáveis.
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�Manter as válvulas de segurança em boas condições de uso;
� Não abrir a porta da autoclave enquanto a pressão da câmara não se igualar à
pressão externa;
� Ao abrir a porta da autoclave proteger o rosto para evitar queimaduras,
explosões ou implosões dos frascos de vidro;
� Utilizar luvas adequadas para a retirada dos artigos da câmara;
� Verificar periodicamente o funcionamento de termostatos, válvulas de
segurança;
� Não forçar a porta para abrir quando emperrar;
� A porta da autoclave deve possuir uma trava de segurança para que esta não
abra enquanto houver pressão no interior da câmara;
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O uso do calor seco
Por não ser penetrante como o calor úmido, requer o uso de temperaturas muito elevadas 
e tempo de exposição muito prolongado, por isso este método de esterilização só deve ser 
utilizado quando o contato com vapor é inadequado.
Equipamentos utilizados neste método: estufa de secagem/esterilização 
ou forno de Pasteur: 
São equipados com um termômetro que mostra a temperatura do interior da câmara; 
um termostato, onde se programa a temperatura desejada; uma lâmpada que mostra a 
situação de aquecimento ou a estabilização da temperatura interna da câmara; algumas 
contêm um ventilador para promover a circulação do ar, garantindo um aquecimento 
rápido e uniforme na câmara.
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Temperatura (oC) Tempo de Exposição
180 30 minutos
170 2 hora
150 2 horas e 30 minutos
140 3 horas
121 6 horas
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Para fins de esterilização industrial as fontes de raios beta e gama são as utilizadas.
A radiação beta pode ser produzida através da desintegração natural de elementos como 
o Iodo 131 ou Cobalto 60, ou ainda artificialmente por meio de máquinas aceleradoras de 
elétrons. É utilizado para a esterilização de materiais plásticos de baixa espessura.
A ação antimicrobiana da radiação ionizante ocorre através da alteração da composição 
molecular das células, modificando o DNA.
elétrons. É utilizado para a esterilização de materiais plásticos de baixa espessura.
A radiação gama é produzida pela desintegração de certos elementos radioativos, o mais 
utilizado é o Cobalto 60. Os raios gama possuem grande penetração nos materiais.
Vantagens:
•Possui alto poder de penetração.
•Atravessa embalagens de papelão, papel ou plástico.
•O material que se esteriliza não sofre danos físicos.
Desvantagens:
•Alto custo.
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Luz ultravioleta (UV) 100 a 400 nm
Nesse tipo de radiação, ao invés de ionizar as moléculas, a luz ultravioleta excita os 
elétrons resultando em uma molécula que reage diferentemente da molécula não 
irradiada. A luz ultravioleta é absorvida por muitos compostos intracelulares e o DNA é o 
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material que sofre maior dano. 
Observe que esse é o mesmo princípio pelo qual há uma correlação bem estabelecida 
entre a incidência de câncer de pele em indivíduos expostos ao sol e, portanto à sua 
radiação ultravioleta.
Fluxo laminar � luz UV (germicida)
Se um líquido é volátil ou termolábil
↓
A solução deve ser filtrada: com um filtro com poros de tamanho controlado que 
varia de 0,1 a 0,2 µm para excluir os microrganismos .
A passagem da solução ou meio de cultura por um filtro pode ser feita com auxílio da 
gravidade, força ou vácuo.
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CA
PES – polietersulfona;
MES – Mistura de ester de celulose;
CA – Acetato de celulose;
Glassfiber – fibra de vidro;
PTFE – politetrafluoretileno; PES Nylon PTFE
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