Aula 09_TBL

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Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Departamento de Genética e Evolução – DGE
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – CCBS
Universidade Federal de São Carlos – UFSCar
e-mail: lisgava@ufscar.br
�Técnica usada para separação de macromoléculas: DNA, RNA e proteínas;
�Baseada na migração diferencial das moléculas sob ação de um campo elétrico em 
uma matriz de gel →→→→ peneira de poros estreitos (obstáculos);
�Separação depende: da carga das moléculas e massa molecular;
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�A migração das moléculas dependerá:
� Força do campo elétrico,
� Carga elétrica das moléculas;
� Tamanho das moléculas;
� Porosidade do meio (moléculas grandes como 
DNA, proteínas);
� Força iônica do tampão de corrida = CARGA 
RELATIVA DAS MOLÉCULAS,
� Viscosidade do meio, 
� Hidrofobicidade das moléculas,
� Temperatura do meio;
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Fc=E/d.q Fr=6π.r.η.v
Força iônica → solução 
tampão permite a 
passagem de corrente 
elétrica pela solução;
↑↑↑↑ Força iônica = ↓↓↓↓ carga 
relativa da molécula = menor 
V de migração →→→→melhor 
definição das bandas
temperatura
Fc=E/d.q
Fc= força do campo elétrico;
E= diferença de potencial;
d = distância dos eletrodos;
q = quantidade de carga
relativa;
Fr= força de arraste ou fricção;
r= raio da molécula;
η = viscosidade do meio;
v = velocidade de migração da
molécula;
Densidade e 
porosidade da matriz
Depende do tamanho das 
moléculas
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v =(E.q)/(d.6 π.r. η)
� Agarose é um hidrocolóide extraído de alga marinha;
� Agarose em temperatura menor que 40 oC “gelifica”: formação de ligações de hidrogênio 
entre moléculas de agarose → matriz sólida porosa;
� Concentração do gel = 0,8 a 3,0% = tamanho dos poros da matriz agarose →→→→ grandes = 
separação de moléculas com massa > 200 kDa: DNA e RNA;
� Corrida mais rápida que a poliacrilamida porém com definição menor;
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Fase estacionária ���� Agarose
Eletroforese horizontal
Permite quantificar a concentração de DNA numa amostra, por exemplo.
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Misturar a agarose com 
50- 100 ml de solução50- 100 ml de solução
tampão;
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Azul de Bromofenol (visualização da corrida)
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Seleção da potência do campo elétrico
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���� poços
���� Azul de bromofenol
Cátodo
(-)
DNA ���� Azul de bromofenol
Anodo
(+)
Gel
DNA
(-)
����
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� 12,000 bp
� 5,000
� 2,000
Padrão: DNA Ladder
-
DNA
migration
� 100
� 200
� 300
� 1,650
� 1,000
� 500
� 850
� 650
� 400
� 2,000
+
migration
Azul de bromofenol �
Azul de bromofenol migra na 
mesma velocidade que 
moléculas de DNA de 300 bp
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Aparatos de segurança)
Máscara: radiação UV causa danos a pele e retina
Luvas: brometo de etídeo é cancerígeno
Errado: Área descoberta sem proteção
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�Criado pela polimerização da acrilamida;
�Separação de proteínas e DNA ;
�Concentração do gel (quantidade de acrilamida) = 3,0 a 30,0% = tamanho �Concentração do gel (quantidade de acrilamida) = 3,0 a 30,0% = tamanho 
dos poros: ↑Concentração de acrilamida = ↓poro = melhor a separação de 
pequenas moléculas;
�Corrida mais lenta que a agarose porém com definição maior;
�Podem ser preparados gradientes de concentração: 3%, 10% e 30%;
�Gel preparado entre duas placas de vidro = O2 inibe a reação;
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acrilamida
N’-metileno-bis-acrilamida
S O 2- →→→→ 2SO -Formação da rede 
Radicais livre ativam monômero
S2O8
2- →→→→ 2SO4
-
TEMEDFormação da rede 
de poliacrilamida
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Eletroforese de Proteínas
� Gel de poliacrilamida����Montado entre duas placas de vidro
- Solução estoque de Acrilamida/Bisacrilamida 30%/2,7%
Acrilamida é tóxico para o Sistema Nervoso Central e Cancerígeno
- Gel de corrida ���� fase de separação das proteínas
- Gel de concentração ���� fase de aplicação das amostras ���� “pente”
Qualidade do Gel depende
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Qualidade do Gel depende
- Qualidade da Acrilamida/Bisacrilamida
(Pureza);
- Água deionizada;
- Armazenamento da solução em vidro Âmbar;
- Deaeração;
- Tempo de armazenamento do gel;
- Temperatura;
- Etc.
Eletroforese de Proteínas
� Em condições não-desnaturantes, a separação depende da carga da proteína
� Dependendo da relação do pI versus pH, a carga proteína pode ser + ou –
- pI ���� pH no qual o somatório das cargas é igual a 0
���� Proteína +migra para o pólo - ���� Proteína - migra para o pólo +
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH
No net 
charge
Increasing 
cationic
Increasing 
anionic
Net positive charge Net negative charge
+ –
Eletroforese de Proteínas
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na presença de SDS
SDS-PAGE – Sodium dodecyl sulfate poliacrylamide gel electrophoresis
� Interação da proteína com SDS deixa a proteína com carga total Negativa
SDS
����Molécula anfipática
���� Desnatura a proteína na formação de complexo 
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���� Desnatura a proteína na formação de complexo 
SDS:Proteína
���� 1,4g SDS/1g de proteína
�carga total negativa será proporcional ao tamanho da 
proteína
� Densidade de carga constante
���� SDS interage mais com a parte hidrofóbica da proteína
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SDS-PAGE
���� Permite separação baseada na filtração molecular da proteína na peneira formada pelo 
polímero entrecruzado de Acrilamida-Bisacrilamida
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SDSSDS--PAGEPAGE
�������� Padrões de Padrões de MM
�������� Porosidade do gel depende da concentração de Porosidade do gel depende da concentração de acrilamidaacrilamida--bisacrilamidabisacrilamida
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Eletroforese
Métodos de detecção/visualização
���� Colorimétricos
���� Coloração com Comassie Brilliant Blue RG-250
- Limite de detecção ���� ~0,1-1,0 μg de proteína
���� Impregnação por Prata (2000 x mais sensível)
- Limite de detecção ���� ~10-100 ng de proteína
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ComassieComassie BrilliantBrilliant BlueBlue Impregnação por PrataImpregnação por Prata
VÍDEO eletroforese de agarose
http://www.youtube.com/watch?v=6vKLT5mQoBM&feature=related
VÍDEO SDS-PAGEVÍDEO SDS-PAGE
http://www.youtube.com/watch?v=8Io0pN5XGqI
http://www.youtube.com/watch?v=toPpdoBYPWo&feature=related
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DIÁLISE DE PROTEÍNAS
�Utilizado para a retirada de sais ou outras impurezas de baixa massa molecular de
uma amostra de proteína, por exemplo;
�Está baseada no fato de que devido ao seu tamanho molecular, as proteínas não
poderão atravessar uma membrana semipermeável de poros definidos;
�Amostra protéica é colocada em uma membrana de diálise com tamanho de poros
definidos que é colocado em um grande volume de tampão de forma a permitir a
passagem dos contaminantes;
�Após várias trocas da solução tampão externa, as condições do interior do saco de
diálise serão as mesmas que as do seu exterior;
�As membranas de diálise apresentam um “cut off” que indica o tamanho da
molécula com menor massa molecular em Daltons;
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DIÁLISEDIÁLISE DEDE PROTEÍNASPROTEÍNAS
�Quando o volume de amostra protéica for PEQUENO, a dessalinização pode ser feita
também se utilizando micro-colunas de centrifugação contendo as membranas
semipermeáveis (filtros) com os poros com “cut off” adequados (comercialmente
disponíveis, exemplo Centricon®).
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3:03 
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DIÁLISEDIÁLISE DEDE PROTEÍNASPROTEÍNAS
�Para a diálise de pequenos volumes de soluções contendo DNA ou mesmo proteínas de
interesse (até 100 µL), a diálise pode ser efetuada em pequenas membranas esféricas de ésteres
mistos de celulose;
�Neste procedimento uma gota (“drop dialysis”) do material a ser dialisado é colocada sobre
uma membrana em um recipiente onde está o tampão para a diálise. Como o volume a seruma membrana em um recipiente onde está o tampão para a diálise. Como o volume a ser
dialisado é pequeno, tempo de cerca de 1 hora de troca já são suficientes para a retirada do sal
das amostras;
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1) Qual a ordem na preparação de um gel de agarose? Quais são os cuidados que o
operador deve tomar na preparação e/ou corrida do gel?
2) Sobre o gel de poliacrilamida:
(a) Para separação de amostras de proteínas com baixa massa molecular qual a melhor
concentração de poliacrilamida?
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3) Para dessalinização de uma amostra de proteína de 25 kDa, qual o cut off da
membrana de diálise mais adequado? Porque?
(a) 5 kDa (b) 12 kDa (c) 30kDa
Se o volume for muito pequeno, quais as alternativas, ao invés de usar uma
membrana de diálise?
concentração de poliacrilamida?
(b) Quais os cuidados durante a preparação de um gel de poliacrilamida (com o
experimento e operador)?