Aula 10_TBL

Prévia do material em texto

Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Departamento de Genética e Evolução – DGE
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – CCBS
Universidade Federal de São Carlos – UFSCar
e-mail: lisgava@ufscar.br
Técnica baseada na medida de absorção ou transmissão da luz medida de absorção ou transmissão da luz por um substância
↓
Baseia-se no princípio de que um material/substância é capaz de absorver e absorver e 
transmitir luztransmitir luz em um determinado comprimento ou faixa de comprimento de ondacomprimento de onda
A espectrofotometriaespectrofotometria é uma das técnicas mais úteis de análise quantitativa análise quantitativa em 
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
A espectrofotometriaespectrofotometria é uma das técnicas mais úteis de análise quantitativa análise quantitativa em 
diversos campos: química, física, bioquímica, engenharia química e de materiais e 
aplicações clínicas
As substâncias absorvem luz devido a presença de grupos cromóforosgrupos cromóforos
� São grupos funcionais que apresentam absorção característica na região do
ultravioleta ou visível ����método de absorçãométodo de absorção;
� Cromóforos obtidos pela reação entre o composto a ser analisado e o reagente 
(cromogênico) ����métodos colorimétricosmétodos colorimétricos.
Por meio da espectrofotometria, componentes desconhecidos de uma 
solução podem ser identificados por seus espectros característicos no 
ultravioleta, visível e infravermelho
Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas absorventes, 
parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. A absorção de luz depende 
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. A absorção de luz depende 
basicamente da concentração das moléculas e da espessura da solução ou caminho óptico.
I0 = feixe de luz incidente
I = feixe de luz transmitido
l = caminho óptico
A intensidade da cor de uma solução é proporcional a concentração de moléculas absorventes de luz. A intensidade da cor de uma solução é proporcional a concentração de moléculas absorventes de luz. 
Quanto Quanto mais concentrada mais concentrada for a solução, for a solução, maiormaior será a será a absorção de luzabsorção de luz..
A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui características 
de onda e de partícula → fóton. 
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
O movimento ondulatório é caracterizado pelo comprimento de onda (λ), o qual 
corresponde à distância linear entre duas cristas, medido em nanômetros (nm), 
que corresponde a 10-9m .
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
Espectro Eletromagnético
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
Espectro Eletromagnético
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Conteúdo energético está intimamente relacionado com o comprimento de onda (λ)
Espectro Eletromagnético
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Conteúdo energético está intimamente relacionado com o comprimento de onda (λ)
Incorporação da energia contida no fóton a estrutura das moléculas absorventes
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
ESTADO FUNDAMENTAL 
(estado energético mais baixo)
ESTADO EXCITADO *
(estado energético mais alto)
A molécula retorna ao estado 
fundamental após ≈ 10-8 seg. 
Geralmente, o retorno libera 
energia na forma de calor
Incorporação da energia contida no fóton a estrutura das moléculas absorventes
Conteúdo energético do fóton = quantidade de energia para que a 
molécula/átomo passe do estado fundamental para o estado excitado
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
molécula/átomo passe do estado fundamental para o estado excitado
↓
↓
Escolher/definir comprimento de onda adequado capaz de excitar a 
molécula/composto estudado
Conteúdo energético está intimamente relacionado com o comprimento de onda (λ)
Relação entre comprimento de onda (λ) e cor da luz
A cor da solução é determinada pela cor da luz transmitida
� Solução branca: transmite luz de todas as cores;
� Solução preta: absorve luz de todas as cores;
�Solução verde: absorve luz vermelha e transmite luz verde (amarelo + azul) ���� cor complementar
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
�Solução verde: absorve luz vermelha e transmite luz verde (amarelo + azul) ���� cor complementar
Relação entre comprimento de onda (λ) e cor da luz
A cor da solução é determinada pela cor da luz transmitida
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas absorventes, 
parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. 
�Transmitância (T): é a relação entre a intensidade de luz transmitida (I) e a luz 
incidente (I0). Usualmente é expressa em porcentagem;
IT =
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
� Absorbância: é a capacidade da substância em absorver radiações em 
freqüência específica;
0I
IT =
I
I
I
ITAbs 0
0
logloglog =−=−=
Transmitância versus Absorbância
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Transmitância versus Absorbância
A
b
s
o
r
b
â
n
c
i
a
T
r
a
n
s
m
i
t
â
n
c
i
a
I
IT =
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Concentração
A
b
s
o
r
b
â
n
c
i
a
Concentração
T
r
a
n
s
m
i
t
â
n
c
i
a
0I
I
IAbs 0log=
A absorbância é usualmente o parâmetro mais adequado, pois na sua escala existe uma relação 
linear entre esta e a concentração da substância absorvente em análise, aspecto que não ocorre 
na transmitância
ANÁLISE DA INTENSIDADE DE ABSORÇÃOANÁLISE DA INTENSIDADE DE ABSORÇÃO
A absorção de luz depende basicamente da:
concentração das moléculas e da espessura da solução ou caminho óptico.
Johann Heinrich Lambert (1728-1777) observou que a intensidade da luz transmitida por um meio 
absorvedor era proporcional a espessura do meio pelo qual a luz passava
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
absorvedor era proporcional a espessura do meio pelo qual a luz passava
August Beer (1825-1863) observou que a intensidade da luz transmitida por um meio absorvedor 
era proporcional a concentração da espécie absorvedora
Abs = log I0/I = Absorbância (UA)
ε = Coeficiente de absortividademolar (mol/L-1.cm-1)
c = ConcentraçãoMolar (mol/L)
l = Passo óptico (cm)
clεAbs
I
I
..log 0 ==
�Altas concentrações do soluto provocam o “bloqueio” da passagem de Luz
�Existe uma faixa ótima para as medidas de Absorbância
T = I/I0 Abs = logI0/I
95 0.022
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
95 0.022
90 0,046
50 0,301
10 1,000
5 1,301
2 1,700
1 2,000
Medidas: > 90% T e < 10% → Erros altos
Ideal → 90% < T > 10%
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
Li
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
A Lei de Lambert-Beer vale para condições restritas:
�A luz utilizada é (aproximadamente) monocromática;
� As soluções analisadas devem estar diluídas;
� Não devem estar presentes na solução mais de uma substância absorvente;
���� Como visto, a principal causa de desvios da lei é a utilização de soluções concentradas.
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
���� Como visto, a principal causa de desvios da lei é a utilização de soluções concentradas.
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
Instrumentação: Fotômetro e Espectrofotômetro
Fotômetros
(Colorímetros)
Espectrofotômetros
Visível
Filtros ópticos (380 – 780 nm)
Ultravioleta e visível
Monocromadores (200 – 1000 nm)
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
Filtros ópticos (380 – 780 nm) Monocromadores (200 – 1000 nm)
Instrumentação: Espectrofotômetro
Ultravioleta e visível
Monocromadores (200 – 1000 nm)
�Instrumento que registra dados de 
absorbância em função do comprimento de 
onda (λ); 
�A característica mais importante do 
espectrofotômetro é a seleção de radiações 
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
espectrofotômetro é a seleção de radiações 
monocromáticas;
�O espectro de absorção é característico 
para cada espécie química, sendo possível a 
identificação de uma espécie química 
através do seu espectro de absorção;
Instrumentação: Espectrofotômetro
Ultravioleta e visível
Monocromadores (200 – 1000 nm)
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Instrumentação: Espectrofotômetro ���� FONTE DE LUZ
•Lâmpadas de Deutério
190 – 370 nm
(tempo de vida: 1.000 h);
•Lâmpadas de Hidrogênio
•Lâmpadas de filamento de Tungstênio
320 – 1100 nm
•Podem ser halógenas → maior 
•Lâmpadas de Hidrogênio
160 – 375 nm
•Podem ser halógenas → maior 
durabilidade (tempo de vida 3.000 h);
�Lâmpadas de Xenônio: 190 – 1100 nm
Lâmpada de Deutério
Lâmpada de Tungstênio
LEDs (diodos emissores de luz)
Instrumentação: Espectrofotômetro ���� SELETOR DE COMPRIMETO DE ONDA
� Isolar faixas estreitas de comprimentos de ondas;
� Diferentes dispositivos → complexidade e largura da faixa de λ
Filtros
Monocromadores
Filtros Filtros → faixas específicas de λ→ faixas específicas de λ
Filtros de absorção;Filtros de absorção;
Filtros de interferência.Filtros de interferência.
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
Filtros de interferência.Filtros de interferência.
* Baixo custo * Baixo custo 
MonocromadoresMonocromadores→ isolam bandas → isolam bandas 
estreitas ao longo do espectro;estreitas ao longo do espectro;
2 tipos: primas e redes (grades) de 2 tipos: primas e redes (grades) de 
difração;difração;
* Mais versáteis;* Mais versáteis;
* Custo mais elevado que os filtros* Custo mais elevado que os filtros
Instrumentação: Espectrofotômetro ���� SELETOR DE COMPRIMETO DE ONDA
MonocromadoresMonocromadores→ isolam bandas estreitas ao longo do espectro;→ isolam bandas estreitas ao longo do espectro;
2 tipos: primas e redes (grades) de difração;2 tipos: primas e redes (grades) de difração;
� Constituição: 
→→→→ fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges
→→→→ fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação
→→→→ fenda de saída
� A radiação policromática vinda da fonte de radiação passa pela fenda de
entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo um desvio;
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
Instrumentação: Espectrofotômetro ���� SELETOR DE COMPRIMETO DE ONDA
MonocromadoresMonocromadores prismáticosprismáticos
entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo um desvio;
� Os vários comprimentos de onda terão diferentes direções após a incidência
no prisma →→→→ ajuste controlado da fenda de saída = comprimento de onda
desejado;
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
� O principal elemento dispersante é a rede de difração. Essa rede consiste em uma placa 
transparente ou refletora com muitas ranhuras paralelas e equidistantes;
� Dispersão resultante desta rede é linear. Os vários comprimentos de onda dispersos são igualmente 
Instrumentação: Espectrofotômetro ���� SELETOR DE COMPRIMETO DE ONDA
MonocromadoresMonocromadores reticularesreticulares
� Dispersão resultante desta rede é linear. Os vários comprimentos de onda dispersos são igualmente 
espaçados, por isso a fenda de saída isolará uma banda de radiação de largura constante;
� A resolução é muito mais elevada que os prismas;
Instrumentação: Espectrofotômetro ���� COMPARTIMENTO DE AMOSTRA
Cubetas
Material Transparência Aplicabilidade
Quartzo 150 – 3000 nm UV, visível
Vidro 375 – 2000 nm visívelVidro 375 – 2000 nm visível
Plástico 380 – 800 nm visível
Instrumentação: Espectrofotômetro ���� DETECTORES DE SINAL
Detectores (ou transdutores) de sinal: devem ter alta sensibilidade
Conversão da radiação em sinal elétrico
Intensidade da corrente é proporcional a intensidade da radiação,;
-Fototubos;
-Fotomultiplicadoras;
-Semicondutores de silício.
Sensibilidade:
Fototubo < semicondutores < fotomultiplicadora
Instrumentação: Espectrofotômetro ���� FEIXE
Espectrofotômetros de FEIXE ÚNICO e DUPLO FEIXE
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
�Pela analise da absorbância é possível determinar qual espécie química 
esta presente na amostra.
� Também é possível detectar contaminações ou processos de 
decomposição de matérias-primas pela comparação dos espectros de 
absorção da matéria e do padrão da mesma.
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
absorção da matéria e do padrão da mesma.
Ex.: detecção de corantes em 
alimentos
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
ge
s
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
Azul de bromotimol
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
Curva padrão de KMnO4
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
Os comprimentos de onda que 
determinada substância absorve são 
característicos da sua estrutura:
T
é
c
n
i
c
a
s
 
B
á
s
i
c
a
s
 
d
e
 
L
a
b
o
r
a
t
ó
r
i
o
 
–
P
r
o
f
a
.
 
D
r
a
.
 
L
i
s
a
n
d
r
a
 
M
a
r
q
u
e
s
 
G
a
v
a
 
B
o
r
g
e
s
característicos da sua estrutura:
DNA e RNA = 260nm 
Proteínas = 280nm
Células bacterianas= 600nm
O nitrito é um parâmetro simples, mas de fundamental importância na verificação da qualidade da 
água para consumo, pois sua presença é um indicativo de contaminação recente, procedente de 
material orgânico vegetal ou animal. O nitrito pode ser encontrado na água como produto da 
decomposição biológica, devido à ação de bactérias ou outros microorganismos sobre o nitrogênio 
amoniacal, ou ser provenientes de ativos inibidores de corrosão em instalações industriais.
O reagente de Griess é composto por uma solução de 
sulfanilamida 1% em ácido fosfórico 5% e uma solução 
aquosa de NED 0,1% [N-(1-naftil) etileno diamino
dihidrocloridríco]Quantificação do NO →→→→medida indireta do nitrito através do 
método colorimétrico baseado na reação de Griess;
�Medida da concentração →→→→ 540 nm;
Rezasurina medida em 595 nm
(azul)
(rosa)
Técnicas Básicas de Laboratório – Profa. Dra. Lisandra Marques Gava Borges