Aulas Laboratoriais de Bioquímica Clínica 2017

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Aulas Laboratoriais 
de Bioquímica 
Clínica 2017/2018
Júlia Leão
Doseamento da Glicose
• Técnica enzimática: glicose-oxidase – da especificidade à técnica.
• Amostras: plasma ou soro.
Método da Glicose-oxidase:
GLICOSE + 𝑂2 ÁCIDO GLUCURÓNICO + 𝐻2𝑂2
2 𝐻2𝑂2 + AMINO-4-ANTIPIRINA + FENOL 4 𝐻2𝑂 + QUINONEIMINA
GLICOSE-OXIDASE
PEROXIDASE
composto corado
A intensidade da coloração medida espectrofotometricamente a 505nm é proporcional à quantidade de glicose presente na amostra.
TÉCNICA
Comprimento de onda,
tamanho da cuvete,
temperatura e branco.
Usar sempre o Semi
Micro e pipetar direto
para os microtubos.
Amostra 1
(A)
Controle
(C)
Padrão
(P)
BrancoAmostra 2
(B)
• Adicionar 10µ𝑳 da amostra (soros A, B, C e P);
• 1000µ𝑳 do Reagente 1.
• Adicionar 1000µ𝑳
do Reagente 1. 
• Vortexar;
• 25min de repouso até atingir a T ambiente;
• Ler absorvância. 
Descartar os microtubos no
lixo vermelho;
No lixo verde descartar os
testes, luvas, papel, pontas.
Espectrofotômetro 
Duplo Feixe, isto significa que uma
cuvete com o branco ficará sempre
dentro do espectrofotômetro.
Primeiro fazer o ’’zero’’
com o reagente branco
previamente preparado.
1 2
Deixar a cuvete mais afastada
dentro do espectrofotômetro com
o reagente branco. Prosseguir
análise na outra cuvete com os
reagentes A, B, C e P.
No espectrofotômetro:
• Clicar na opção FIXED;
• Alterar o comprimento de 
onda para 500nm;
• Fazer o branco;
• Para as amostras clicar em 
RUN.
Cálculos 
Exemplo:
ABS
A 0,312
B 0,300
C 0,300
P 0,319
𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
x [padrão] = [amostra] mg/dL
A=
0,312
0,319
x 100 = 97,80 mg/dL
C=
0,300
0,319
x 100 = 94,04 mg/dL
B=
0,300
0,319
x 100 = 94,04 mg/dL
Valores de Referência:
4,2-6,4 mmol/L
75-115mg/dL
Pesquisa de Glicosúria
• O aparecimento de glicosúria está dependente dos valores de
glicemia ultrapassarem o ‘‘limiar renal’’ para excreção da glicose;
• O limiar renal aumenta com a idade. Idosos diabéticos podem não ter
glicosúria.
• Eventualmente, pode haver glicose sérica elevada e não haver
glicosúria, por isso, não poderia ser um critério na monitorização da
glicosúria.
180mg/dL ou 10mmol/L
Glicosúria renal – glicose sérica normal,
problema na reabsorção da glicose no túbulo
proximal.
1- Submerja completamente as áreas de
reagente das tiras na urina. Remover
imediatamente para evitar a dissolução
dos reagentes.
2- Remover o excesso de urina.
3- Deixar em cima do próprio frasco da
urina mas se possível bater a tira de urina
lateralmente em papel absorvente.
4- Ler os resultados após 1 minuto.
Leucócitos – 2 minutos.
Teste de Gravidez
• Amostra: urina – de preferência a primeira da
manhã, há maior concentração de hCG.
• A hormona hCG é secretada pelas células
trofoblásticas, de origem placentária. O rápido
aumento da hCG no soro e na urina nos dias
seguintes à fertilização faz com que seja um
marcador fiável de gravidez.
• Fundamento do teste: teste imunocromatográfico
em ‘‘sandwich’’ utilizando anticorpos anti-hCG.
Falsos negativos:
• Níveis não detectáveis de hCG, realização do
teste antes de 8 dias após a fecundação.
Falsos positivos:
• Doença trofoblástica e alguns tipos de tumores.
Técnica
• Deixar o teste em local plano;
• Adicionar 3 gotas de urina no local marcado;
• Ler após 3-4 minutos.
• Mergulhar a tira verticalmente na urina até a
marcação por pelo menos 10-15 segundos;
• Colocar a tira em uma superfície plana não
absorvente;
• Ler o resultado após 3-4 minutos.
Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes
Teste de Rastreio
Teste imunológico:
• Usam-se tiras revestidas com anticorpo anti-Hb humana;
• Sem interferências da dieta, mais especificidade;
• Só detecta a fração globina da Hb humana, não havendo o risco de
falsos positivos com alimentos, como a carne.
• Sangue proveniente de hemorragias do trato digestivo alto não é
detectado com esta técnica – usar método da Resina de Guaiaco.
• Detecta apenas sangue vindo do intestino grosso, sendo mais útil
para o rastreio de câncer de cólon e reto.
Doseamento da Ureia 
produto da degradação final do metabolismo das proteínas
• Amostra: soro, plasma ou urina.
• Fundamento: Método de Berthelot.
UREA + 𝑯𝟐O 𝑵𝑯𝟑 + 𝑪𝑶𝟐
UREASE
Os íons de amônio formados vão reagir com
salicilato e o hipoclorito do reagente e vão
formar o 2-2-dicarboxilindofenol.
Valores esperados no soro: 
15-45mg/dL
Obs.: as crianças têm valores de referência próprios.
Os valores de ureia sofrem variações com dietas
ricas em proteínas. Analisar os resultados da ureia
em conjunto com outros dados.
Técnica
Comprimento de onda, tamanho
da cuvete, temperatura e
branco.
Primeira parte, pipetar em
microtubos.
Depois de incubar, adicionar
reagente 2 aos mesmos
microtubos.
1
2
Padrão BrancoAmostra 1
• 10µL do Padrão;
• 1000µL do Reagente 1.
• 10µL da Amostra;
• 1000µL do Reagente 1.
• 1000µL do Reagente 1.
• Vortexar;
• Incubar por pelo menos 5 minutos;
2 Padrão BrancoAmostra 
• Adicionar 200µL Hipoclorito de Sódio – Reagente 2 – em todos os tubos.
• Vortexar;
• Incubar por 10 minutos;
• Ler absorvância.
Cálculos
ABS
A 0,330
B 0,333
C 0,326
P 0,455
Branco 0,000
Exemplo:
𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
x [padrão] = [amostra] mg/dL
A=
0,330
0,455
x 50 = 36,26 mg/dL
C=
0,326
0,455
x 50 = 35,82 mg/dL
B=
0,333
0,455
x 50 = 36,59 mg/dL
Valores esperados no soro: 
15-45mg/dL
Doseamento da Creatinina
• Amostra: soro, plasma ou urina.
• Está aumentada na insuficiência renal.
Creatinina
• É sintetizada no rim e no fígado e armazenada no músculo sob a forma de
creatina fosfato, composto utilizado na contração muscular.
• Parte da creatinina livre no músculo é convertida na forma anidra-
creatinina.
• A quantidade de creatinina formada é em função da massa muscular.
• É eliminada por filtração glomerular. Teste de avaliação da função renal.
Reação de Jaffé
Mede-se em modo cinético dois pontos o complexo vermelho-
alaranjado formado por reação da creatinina com o ácido pírico em
meio alcalino.
O aumento da densidade óptica medida a 492nm é proporcional
a concentração de creatinina.
A reação é inespecífica, por isso o ‘‘lag time’’ de 20-30 segundos
possibilita remoção de algumas interferências.
• Ácido ascórbico;
• Cetonas;
• Acetoacetato;
• Piruvato;
• Cefalosporinas.
Creatinina
• A creatinina depende da capacidade de eliminação dos rins e da 
massa muscular.
Creatinina diminui:
• Hemodiluição;
• Desnutrição;
• Miopatia;
• Distrofia muscular.
Creatinina aumenta:
• Insuficiência renal;
• Leucemia, gota, pré-eclâmpsia;
• Hipertireoidismo;
• Exercício físico violento.
Técnica
Comprimento de onda,
tamanho da cuvete,
temperatura e branco.
Pipetar direto na cuvete.
Para eliminar os interferentes.
Diluição da Urina: 50x
Volume final desejado x 
1
50
= 
volume de urina a ser pipetado
Exemplo:
1000µL x 
1
50
= 20µL de urina
PADRÃO AMOSTRA
• 1000µL do Reagente de Trabalho;
• 100µL da Solução Padrão.
• 1000µL do Reagente de Trabalho;
• 100µL da Amostra.
• Tampar a cuvete com parafilme – só colocar por cima – e inverter para homogeneizar;
• Depois de 30 segundos ler a absorvância (A1) do padrão, da amostra e da urina.
• Exatamente 2 minutos depois ler a absorvância (A2) do padrão, da amostra e da urina novamente.
URINA
• 1000µL do Reagente de Trabalho;
• 100µL da Urina previamente diluída.
Cálculos
Soro ABS
𝑇0 0,833
𝑇2 0,870
Padrão ABS
𝑇0 0,736
𝑇2 0,802
Soro
𝑇2 − 𝑇0 = ΔA amostra
0,843 – 0,798 = 0,037
Padrão
𝑇2 − 𝑇0 = ΔA padrão
0,802 – 0,736 = 0,066
S=0,037
0,066
x 1,9 = 1,06 mg/dL
Urina ABS
𝑇0 0,781
𝑇2 0,833
Urina
𝑇2 − 𝑇0 = ΔA padrão
0,833 – 0,781 = 0,052
U=
0,052
0,066
x 1,9 = 1,49 mg/dL
1,49 x 50 (fator de diluição) = 74,84 mg/dL
Clearance Creatinina = 
𝟕𝟒,𝟖𝟒
𝟏,𝟎𝟔 𝒙 𝟏,𝟎𝟒
= 73,43 mL/min
1500mL urina 1440’
x 1’
X = 1,04mL urina/min
Valores esperados:
Homens: 75-130mL/min
Mulheres: 65-120mL/min
Análise Microscópica do Sedimento Urinário
Urina tipo II
• Amostra da primeira urina da manhã – mais concentrada.
• Desprezar o primeiro jato – saem muitas células epiteliais do trato 
urinário inferior, ou células descamadas.
O sedimento prepara-se por centrifugação de 10mL de urina –
1600-1800 rpm. Decantar 9mL e ressuspender 1mL no final. 
Exame Físico-Químico
Aspecto: 
• Límpida – quando se vê perfeitamente o fundo do 
frasco;
• Turva – uratos, fosfatos, leucócitos, células epiteliais, 
muco, bactérias, cristais.
Cor:
• Amarela;
• Verde – infecção por Pseudomonas, corantes;
• Castanha – pigmentos biliares, contaminada com fezes;
• Preta – melanoma, alcaptonúria, alfa-metildopa;
• Vermelha – hematúria, rifampicina.
Exame Físico-Químico
com tiras reativas
Densidade: normal de 1,014 – 1,025
• Cetoacidose e níveis de proteína > 100mg/dL podem
elevar o resultado.
pH: mais frequente ácido a neutro
• Dietas ricas em proteínas – pH ácido;
• Infecção por Proteus – pH básico;
• pH básico não tem cristais de ácido úrico.
Proteínas: albumina
• Permeabilidade glomerular alterada;
• Albumina de origem renal – glomerulonefrites, síndrome
nefrótico, tuberculose renal, neoplasias renais.
• As tiras reativas não detectam paraproteínas;
• Urina muito alcalina interfere na pesquisa de proteinúria.
Exame Físico-Químico
com tiras reativas
Glicose:
• Diabetes - hiperglicemia, glicose ultrapassa limiar renal.
• Glicosúria renal – normoglicemia, há um problema na
reabsorção da glicose no túbulo proximal;
• Litíase renal, glomerulonefrites, tumores renais, estados
febris, lúpus;
Corpos cetônicos:
• Dietas com muita proteína – glicemia normal;
• Jejum prolongado – glicemia normal, sem HC há
produção de corpos cetônicos;
• Febre;
• Cetoacidose diabética – hiperglicemia.
Leucócitos:
• Infecções urinárias, pielonefrites, glomerulonefrites
agudas, tuberculose renal.
Exame Físico-Químico
com tiras reativas
Urobilinogénio e Bilirrubina:
• Avaliam a função hepática e o metabolismo da
bilirrubina.
Nitritos:
• Indicador de infecção urinária se leucócitos também
forem positivos, se leucócitos forem negativos houve
contaminação na amostra;
• Indicador de bacteriúria.
Sangue:
• Hematúria – eritrócitos na urina não hemolisados.
Cálculo renal. Mais de 5 eritrócitos por campo;
• Hemoglobinúria – eritrócitos na urina hemolisados.
Anemia hemolítica, fármacos.
Análise Microscópica 
do Sedimento Urinário
Contagem do número de elementos por 
campo na objetiva de 40x. Observam-se:
• Eritrócitos;
• Leucócitos;
• Células epiteliais do trato urinário inferior, ou 
células desscamadas – sem significado clínico;
• Células epiteliais do trato urinário superior, 
‘‘small round cells’’ – tem significado clínico;
• Cilindros;
• Cristais.
Cristais
Cristais de Ácido Úrico:
• Urinas ácidas;
• Pedras nos rins, nefropatia.
Cristais Oxalato de 
Cálcio
• Alimentos ricos em ácido oxálico;
• Intoxicação por produtos químicos e 
ácido ascórbico;
• Urina normal ou ácida;
• Pedra nos rins.
Cristais de Fosfato 
Triplo de Amónio 
e Magnésio
• Cálculos renais;
• ‘‘Tampa de caixão’’;
• Urina neutra ou alcalina.
Leveduras
Deve-se apenas informar a presença.
Fosfatase Alcalina 
• Amostra: soro ou plasma heparinizado;
Método colorimétrico:
p-aminofenilfosfato + 𝐻2O fosfato + p-nitrofenol
Fosfatase Alcalina:
• Responsável pela hidrólise de ésteres fosfóricos;
• Remoção de grupo fosfato na presença de Zn e Mg;
• Ligada a membrana;
• Em maior concentração no fígado (ALP1), epitélio do trato biliar e osso
(ALP2);
ALP
Fosfatase Alcalina
Maior atividade hepática:
• Obstrução biliar, colestase intra ou extra-hepática, tumores hepáticos,
hepatites, drogas hepatotóxicas;
Maior atividade óssea:
• Maior atividade osteoblástica, crescimento normal ósseo, consolidação de
fraturas, Doença de Paget, Osteomalácia, Raquitismo, deficiência em
Vitamina D, hiperparatiroidismo, metástases ósseas, osteosarcoma.
Menor atividade da ALP:
• Deficiência em Zn, hipofosfatasia, hipofosfatemia, hipofosfatúria
hereditária, desnutrição, doença Celíaca.
Pipetar direto na cuvete:
• 20µL da amostra;
• 1000µL do reagente de trabalho.
• Tampar com parafilme e inverter 
para homogeneizar a solução;
• Ler absorvância inicial e ligar o 
cronometro;
• Ler absorvância depois de 1, 2 e 
3 minutos
• Fazer o branco contra o ar.
1
2 3
Amostra e Controle
Amostra ABS
𝑇0 0,459
𝑇1 0,488
𝑇2 0,512
𝑇3 0,542
Exemplo:
Controle ABS
𝑇0 0,738
𝑇1 0,761
𝑇2 0,785
𝑇3 0,811
AMOSTRA:
𝑇1 − 𝑇0 = ΔA amostra
0,488 – 0,459 = 0,029
𝑇2 − 𝑇1 = ΔA amostra
0,512 – 0,488 = 0,024
𝑇3 − 𝑇2 = ΔA amostra
0,542 – 0,512 = 0,030
Média ΔA amostra = 0,028
PADRÃO:
𝑇1 − 𝑇0 = ΔA amostra
0,761 – 0,738 = 0,023
𝑇2 − 𝑇1 = ΔA amostra
0,785 – 0,761 = 0,024
𝑇3 − 𝑇2 = ΔA amostra
0,811 – 0,785 = 0,026
Média ΔA amostra = 0,024
U/L = 2760 x ΔA 405nm/min
2760 x 0,028 = 77,28 U/L
U/L = 2760 x ΔA 405nm/min
2760 x 0,024 = 66,24 U/L
Valores de referencia a 30°C: Homem/mulher 
73-207 U/L
Eletroforese de Proteínas