AULA PRÁTICA - DOSAGEM DE LIPÍDIOS

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FACULDADE UNIGRAN CAPITAL
Ana Gabriela Souza Gouvea
Camila Langer Marciano
Murilo Andrade Nantes
Thalia de Sousa da Silva
Dosagem de Lipídios
Campo Grande
2017
1 INTRODUÇÃO
Os lipídios ou gorduras são biomoléculas essenciais para o organismo humano, pois desempenham diversas funções tais como: reserva energética, apesar de ser uma fonte rica em calorias (ESCOTT-STUMP, 2011), não é o principal nutriente que o corpo usa para obter energia; alimento energético, quando a principal fonte de energia, o carboidrato, está se esgotando, o organismo passa a oxidar a gordura armazenada no tecido adiposo para a obtenção de energia; componente estrutural, formando parte da membrana plasmática; proteção mecânica, protege a pele e órgãos internos de choques; originam moléculas mensageiras, tais como hormônios; além de ser um importante isolante térmico e elétrico (CORSINO, 2009).
Diferentemente das outras biomoléculas, os lipídios não são polímeros, sendo, portanto, constituído por subunidades de ácidos graxos mais glicerol. São insolúveis em água e solúveis em solventes não polares. Assim como os carboidratos, os lipídios são ricos em carbono, hidrogênio e oxigênio, sendo esse último em menor proporção (COSTANZO, 2011; PHILIPPI, 2014).
Como principal tipo de lipídio pode-se destacar os ácidos graxos, que podem ser encontrados de forma livre ou como componente de lipídios complexos; os triglicerídeos, que armazenam lipídios no tecido adiposo; fosfolipídios, principal tipo de lipídio encontrado na membrana plasmática; ceras, que protegem as folhas, caules e frutos; e esteróis, integrantes fundamentais das membranas celulares tanto de animais como de vegetais, como por exemplo o colesterol (PHILIPPI, 2014).
Devido à insolubilidade em água dessas biomoléculas, faz-se necessário um sistema transportador para que seja facilitado seu metabolismo, esse sistema transportador chama-se lipoproteínas, que se divide em: quilomícrons, proteínas de densidade muito baixa (VLDL), proteínas de densidade baixa (LDL) e proteínas de alta densidade (HDL). O fígado é o principal órgão que controla a síntese, degradação e armazenamento de lipídios e lipoproteínas (RIBEIRO & SHINTAKU, 2004).
As desordens que ocorrem nas porções lipídicas, também chamadas de dislipidemias, são um fator de risco para o aparecimento de comorbidades, como por exemplo, doenças vasculares. Para avaliação laboratorial dessas desordens são feitos testes de rotina nas seguintes frações: Colesterol Total (CT), Triglicerídeos (TG), Colesterol HDL (HDL-C), Colesterol LDL (LDL-C) e Colesterol Não-HDL (Não-HDL-C). O LDL-C e o Não-HDL-C não são dosados, seus valores são obtidos através de cálculos, sendo, respectivamente, usadas as formulas: CT – (HDL-C + TG/5) e CT – HDL-C. No laboratório as dislipidemias são classificadas em: hipercolesterolemia isolada, elevação somente do LDL-C; hipertrigliceridemia, elevação somente do TGs; hiperlipidemia mista, elevação do LDL-C e TG; e HDL-C baixo, caracterizada pela redução somente do HDL-C ou associada à elevação do LDL-C ou TG (MOTTA, 2009).
O colesterol é o principal esterol presente em alimentos derivados de animais, pode ser encontrado de forma livre ou esterificado. São precursores na síntese da vitamina D, ácidos biliares e hormônios esteroides (COZZOLINO & COMINETTI, 2013). A dosagem do CT pode ser feita no soro ou no plasma heparinizado isento de hemólise, o paciente pode estar ou não de jejum. A dieta, os exercícios físicos, a gravidez, o hipotireoidismo e os medicamentos podem interferir no resultado, gerando uma hipercolesterolemia ou hipocolesterolemia, aumento ou redução nos níveis séricos do CT, respectivamente (MOTTA, 2009). Tal teste tem como valor de referência, segundo o Consenso Brasileiro (2016), para adultos valor desejável de <190 mg/dL e para crianças e adolescentes o valor desejável deve ser <170 mg/dL, sendo que ambos valores se aplicam para o jejum ou não.
Os TGs, formados por 3 moléculas de ácidos graxos e uma molécula de glicerol, são a principal forma de estocagem de ácidos graxos e são sintetizados no intestino e no fígado. Compõem uma fração das lipoproteínas (grande parte dos quilomícrons e VLDL e pequena porção do LDL) (COZZOLINO & COMINETTI, 2013). Assim como o CT, a dosagem dos TGs pode ser feita com o jejum ou não. O aumento do valor sérico dessa fração é denominado hipertrigliceridemia, enquanto sua redução, denomina-se hipotrigliceridemia. A medição deve ser feita no soro ou no plasma heparinizado isento de hemólise (MOTTA, 2009). De acordo com o Consenso Brasileiro (2016), o valor desejável para adultos é de <150 mg/dL com jejum e <175 mg/dL sem jejum, à medida que para crianças de 0 a 9 anos o valor cai para <75 mg/dL com jejum e <85 mg/dL sem jejum e para adolescentes 10 a 19 anos, com jejum o valor desejável é <90 mg/dL e sem jejum <100 mg/dL.
A lipoproteína HDL, considerada fração boa, retira o colesterol dos tecidos, levando-o para o fígado, portanto são as frações protetoras do organismo, pois impedem a formação das placas de gordura nas artérias, como ocorre na aterosclerose (MOTTA, 2009). Sua dosagem deve ser feita no sobrenadante da amostra após sua centrifugação, visto que essa lipoproteína é de alta densidade. Tem como valor desejável para adultos >40 mg/dL e para crianças e adolescentes >45 mg/dL, ambos com ou sem jejum (CONSENSO BRASILEIRO, 2016).
Ao contrario da lipoproteína HDL, a LDL é considerada a fração lipídica ruim, pois é ela quem se acumula nas paredes dos vasos, causando obstrução, sendo considerada a porção lipídica mais aterogênica do sangue. Seu valor deve ser calculo pela formula de Friedewald. Através do resultado obtido, pode-se calcular o risco coronariano e apresentar uma meta terapêutica para o paciente. O mesmo acontece com fração Não-HDL-C, que deve ser calculada pelo CT menos HDL-C e através de seu valor pode-se obter uma estimativa no numero de partículas aterogênicas (MOTTA, 2009). Atualmente, recomenda-se acrescentar o cálculo Não-HDL-C nos laudos laboratoriais (CONSENSO BRASILEIRO, 2016).
A dosagem dos lipídios pode ser feita por meio do aparelho espectrofotômetro. Este funciona pela técnica de fotometria, na qual se baseia na medição da recepção e absorção da luz. A máquina emite uma luz, em um determinado comprimento de onda, que atravessará uma solução colorida armazenada em uma cubeta. Parte dessa luz é absorvida enquanto a outra parte será transmitida, tendo uma menor intensidade, e essa luz transmitida será lida em absorbância (MOTTA, 2009). O método utilizado para a dosagem em tal aparelho é o enzimático colorimétrico, e o comprimento de onda é especifico para cada analíto dosado. (ANALISA, 2013; ANALISA, 2017).
2 OBJETIVO
Dosar as várias frações lipídicas.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais: 
Espectrofotómetro Bioplus -200;
Banho Maria 37°C;
Centrífuga
Micropipetas:
3 para dosagem de colesterol total: 2 de 10μL e 1 de 1000μL;
3 para dosagem de triglicerídeos: 2 de 100μL e 1 de 1000μL;
4 para dosagem de HDL-C: 2 de 10μL, 1 de 1000μL e 1 de 500μL
10 Ponteiras para cada micropipetas correspondente;
16 Tubo de  7 x 12,5 mm;
1 Tubo de Centrífuga;
Pisseta com água deionizada;
3 Estantes para Tubos;
3 Becker de 50ml;
2 Tubo com soro do paciente;
1 Precipitante ( ácido fosfotúngstico e cloreto de magnésio);
3 Kits Reagente:
Dosagem de colesterol total: reagente 1 padrão (200mg/dl) e reagente 2 de cor;
Dosagem de triglicerídeos: reagente 1 padrão (210mg/dl) e reagente 2 de cor;
Dosagem de HDL-C: reagente 1 padrão (52,5 mg/dl) e reagente 2 de cor.
 Métodos:
A. Dosagem de Colesterol Total
1. Lavar as mão e colocar as luvas.
2. Voluntário 1 preparou o Branco: pipetou 1000μl de reagente 2 no tubo.
3. Voluntário 2 preparou o Padrão: pipetou 1000μL de reagente 2 e 10μL de reagente 1 no mesmo tubo.
4. Identificação dos tubos Testes para cada aluno.
5. Preparação dos Testes: cada aluno pipetou 1000μL de reagente 2 e 10μL de sorodo paciente em um mesmo tubo.
6. Homogeneizar cada tubo Teste e o tubo Padrão.
7. Colocou os  tubos em Banho maria à 37°C por 5 minutos.
8. Iniciar procedimentos do Espectrofotômetro Bioplus:
 8.1 Apertar F1 para teste e determinar absorbância de 500 nm.
 8.2 Determinar RET ( tempo de retenção): 30segundos.
 8.3  Apertar F2 para Incluir
 8.4 Determinar volume aspirado: 0,700μL.
 8.5 Apertar F2 para Incluir.
9. Iniciar em F4.
10. Inserir água e apertar START.
11. Inserir o Branco e apertar START: Absorbância 0,172.
12. Confirmar Branco duas vezes em F4.
13. Inserir água para lavagem em F4.
14. Inserir Padrão: Absorbância 0,310.
15. Inserir água para lavagem F4.
16. Cada aluno inseriu seu tubo Teste e fez a lavagem com água:
16.1 Lilo:0,229;
16.2 Ana:0,240;
16.3 Mila:0,280;
16.4 Lia:0,244.
B. Dosagem de triglicerídeos
1. Lavar as mão e colocar as luvas.
2. Voluntário 3 preparou o Branco: pipetou 1000μl de reagente 2 no tubo.
3.Voluntário 4 preparou o Padrão: pipetou 1000μL de reagente 2 e 100μL de reagente 1 no mesmo tubo.
4. Identificação dos tubos Testes para cada aluno.
5. Preparação dos Testes: cada aluno pipetou 1000μL de reagente 2 e 100μL do soro do paciente em um mesmo tubo.
6. Homogeneizar cada tubo Teste e o tubo Padrão.
7. Colocou os tubos em Banho maria à 37°C por 10 minutos.
8. Iniciar procedimentos do Espectrofotômetro Bioplus:
 8.1 Apertar F1 para teste e determinar absorbância de 505 nm.
 8.2 Determinar RET (tempo de retenção): 30segundos.
 8.3 Apertar F2 para Incluir
    8.4 Determinar volume aspirado: 0,700μL.
    8.5 Apertar F2 para Incluir.
9. Iniciar em F4.
10. Inserir água e apertar START.
11. Inserir o Branco e apertar START: Absorbância 0,275.
12. Confirmar Branco duas vezes em F4.
13. Inserir água para lavagem em F4.
14. Inserir Padrão: Absorbância 1,107.
15. Inserir água para lavagem F4.
16. Cada aluno inseriu seu tubo Teste e fez a lavagem com água:
16.1 Lilo:0,599;
16.2 Mila:0,644;
16.3 Lia:0,593.
C. Dosagem de HDL-C
1. Lavar as mãos e colocar a luva
2. Voluntário 5 pipetou 200μL do soro do paciente e 500μL de Precipitante no tubo de centrifugação.
3. Homogeneizar a solução.
4. Colocar o tubo em repouso na estante de tubos por 10 minutos para ocorrer a precipitação.
5. Centrifugar a solução por 10 minutos a 400 rpm.
6.  Voluntário 6 preparou o Branco: pipetou 1000μl de reagente 2 no tubo.
7. Voluntário 7 preparou o Padrão: pipetou 1000μL de reagente 2 e 100μL de reagente 1 no mesmo tubo.
8. Identificação dos tubos Testes para cada aluno.
9. Preparação dos Testes: cada aluno pipetou 1000μL de reagente 2 e 100μL do sobrenadante do soro do paciente em um mesmo tubo.
10. Homogeneizar cada tubo Teste e o tubo Padrão.
11. Colocou os tubos em Banho maria à 37°C por 10 minutos.
12. Iniciar procedimentos do Espectrofotômetro Bioplus:
 12.1 Apertar F1 para teste e determinar absorbância de 505 nm.
    12.2 Determinar RET (tempo de retenção): 30segundos.
    12.3 Apertar F2 para Incluir
    12.4 Determinar volume aspirado: 0,700μL.
    12.5 Apertar F2 para Incluir.
13. Iniciar em F4.
14. Inserir água e apertar START.
15. Inserir o Branco e apertar START: Absorbância 0,183.
16. Confirmar Branco duas vezes em F4.
17. Inserir água para lavagem em F4.
18. Inserir Padrão: Absorbância 0,189.
19. Inserir água para lavagem F4.
20. Cada aluno inseriu seu tubo Teste e fez a lavagem com água:
 20.1 Lilo:0,147;
    20.2 Mila:0,152;
    20.3 Lia:0,139.
RESULTADOS
A. Colesterol Total (CT):
FC= = 645
Teste lilo: 0,229 x 645 = 148 mg/dL;
Teste ana: 0,240 x 645 = 155 mg/dL;
Teste mila: 0,280 x 645 = 181 mg/dL;
Teste lia: 0,244 x 645 = 157 mg/dL.
Média = = 160 mg/dL
B. Triglicerídeos (TG):
FC = = 189
Teste lilo: 0,599 x 189 = 113 mg/dL;
Teste mila: 0,644 x 189 = 112 mg/dL;
Teste lia: 0,593 x 189 = 122 mg/dL.
Média = = 115 mg/dL
C. HDL-C:
FC = = 277
Teste lilo: 0,147 x 277 = 41 mg/dL;
Teste mila: 0,152 x 277 = 42 mg/dL;
Teste lia: 0,139 x 277 = 38 mg/dL.
Média = = 40 mg/dL
D. Não – HDL:
Não HDL = CT - HDL-C
 160 – 40
 120 mg/dL
E. LDL:
LDL = CT - (HDL-C + )
LDL = 160 - (40 + )
LDL = 160 - (40 + 23)
LDL = 160 - 63
LDL = 97 mg/dL
5 DISCUSSÃO
Levando em consideração que o reagente foi o mesmo, o padrão teve a mesma concentração e o equipamento espectrofotômetro apresentou a mesma configuração para todos os exames realizados, percebe-se que a variação de resultados se deve a circunstância em que a amostra foi manipulada. Podendo ocorrer diferenças no volume pipetado, processamento da amostra e reagente (homogeneização correta de ambos no tubo de ensaio e tempo correto no banho maria) e operação adequada do equipamento, como a lavagem de um teste para outro.
Aula I – colesterol total.
A diferenciação de cor da amostra padrão para a amostra do paciente analisado é devido a um método de dosagem do colesterol total resultado de ações enzimáticas, onde há a hidrólise, oxidação e catálise do colesterol resultando em uma variação do vermelho. Essa reação pode ser melhor observada na imagem com a comparação do reagente branco, situado mais à esquerda com a solução padrão contendo uma coloração mais acentuada devido sua concentração, situada centralmente e a amostra do paciente a direita. 
Fonte: NANTES, M. A., 2017.
O valor obtido pela média dos resultados encontrados pelo grupo em mg/dL de colesterol total no soro do paciente foi de 160, sendo então observado um bom estado do paciente em relação ao mesmo segundos os seguintes valores de referência: 
Adultos:
Com ou sem jejum - <190mg/dl.
Crianças e adolescentes:
Com ou sem jejum - <170mg/dl.
Aula II – Triglicerídeos (TG), High Density Lipoprotein (HDL) e Low Density Lipoprotein (LDL). 
Assim como no colesterol total essas frações lipídicas de TG e HDL-C também apresentam a cor vermelha na interação reagente-amostra resultante de ações enzimáticas. O triglicerídeo é hidrolisado, fosforilado, oxidado e catalisado. Já para a análise quantitativa do bom colesterol houve a separação do mesmo das demais frações que não compartilham afinidade pelos detergentes presentes no reagente específico, deixando apenas a porção HDL-C sobrenadante devida a diferença de densidade para sofrer intervenção de oxidação, o que pode ser observado na imagem abaixo. 
Fonte: NANTES, M. A., 2017.
Os triglicerídeos analisados expressaram diante da média do grupo o valor de 115mg/dL. Considerando que a idade do paciente da amostra sorológica analisada é oculta pode-se fazer as seguintes considerações: 
Caso adulto, o paciente possui um valor de excelência segundo os seguintes parâmetros de referência:
Com jejum – <150mg/dL;
Sem jejum – <175mg/dL.
Se na faixa da adolescência ou infância o mesmo apresenta um valor elevado de triglicérides, seguindo os valores de referência: 
Com jejum – <75mg/dL (0 a 9 anos) ou 90mg/dL (10 a 19 anos);
Sem jejum – <85mg/dL (0 a 9 anos) ou 100mg/dL (10 a 19 anos).
A média obtida do colesterol HDL foi de 40mg/dL. Levando em consideração a idade desconhecida do paciente são feitas afirmativas: 
Caso adulto o paciente possui seu valor na média dessa fração, observando seu valor de referência: 
Com ou sem jejum – >40mg/dL.
Caso criança ou adolescente o paciente apresenta uma quantidade inferior a ideal, sendo o parâmetro:
Com ou sem jejum – >45mg/dL.
Diante da realização de cálculos foi encontrada a quantidade do LDL-C no soro analisado, sendo o valor de 97mg/dL. Observando tal resultado percebe-se que o paciente possui um risco coronariano intermediário. 
6 CONCLUSÃO
As diferenças elevadas entre os testes foram obtidas diante da falta de excelência na execução do método, que pode ser adquirida com a prática. Diante do objetivo proposto na aula I o paciente tem índices de colesterol total adequado para seu parâmetro de referência, não indicando hiperlipidemia. Na fase analítica da aula II o paciente apresenta, caso adulto, triglicerídeos dentro do valoradequado, se mais jovem expõe um quadro de hipertrigliceridemia e seu colesterol HDL, ou seja, o bom colesterol se adulto está em condições normais, mas se jovem aparenta um quadro de HDL-C baixo. Para o risco coronariano do LDL-C analisado deve-se tomar uma medida terapêutica para a manutenção de seus níveis abaixo de 100mg/dL. 
7 REFERÊNCIAS
- ANALISA. Kit para determinação do colesterol HDL por metodologia enzimática-colorimétrica. 2013. Disponível em: < http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B483A69ED-64F3-4787-8C06-06698911D598%7D_COLESTEROL_HDL_PP_Cat_413.pdf>. Acessado em: 04 out. 2017.
- ANALISA. Kit para determinação do colesterol total por metodologia enzimática-colorimétrica. 2017. Disponível em: < http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7BD9580E65-798B-4D1A-95F8-4BB5A85ABD10%7D_COLESTEROL_PP_Cat_460%20(2).pdf>. Acessado em: 04 out. 2017.
- ANALISA. Kit para determinação dos triglicérides por metodologia enzimática-colorimétrica. 2013. Disponível em: < http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7BD2087228-3073-419A-993F-54D37283BB17%7D_TRIGLICERIDES_PP_Cat_459.PDF>. Acessado em: 04 out 2017.
- CONSENSO BRASILEIRO. Normatização da determinação laboratorial do perfil lipídico. 2016. Disponível em: <http://csvlab.com.br/Consenso-Jejum-Perfil-Lipidico.pdf>. Acessado em: 04 out. 2017.
- CORSINO, J. Bioquímica. Campo Grande, MS: Ed. UFMS, 2009.
- COSTANZO, L. S. Fisiologia. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011.
- COZZOLINO, S. M. F.; COMINETTI, C. Bases bioquímicas e fisiológicas da nutrição: nas diferentes fases da vida, na saúde e na doença. Barueri, SP: Manole, 2013.
- ESCOTT-STUMP, S. Nutrição relacionada ao diagnóstico e tratamento. 6° ed. Barueri, SP: Manole, 2011.
MAHAN, L. K.; ESCOTT-STUMP, S.; RAYMOND, J. L. Krause: alimentos, nutrição e dietoterapia. 
- MOTTA, V. T. Bioquímica clínica para laboratório: princípios e interpretações. 5°ed. Rio de Janeiro: Medbook, 2009.
- RIBEIRO, K. C.; SHINTAKU, R. C. O. A influência dos lipídios da dieta sobre aterosclerose. ConScientiae Saúde, v. 3, p. 73-83. São Paulo: UNINOVE, 2004.
- PHILIPPI, S. T. Pirâmide dos alimentos: fundamentos básicos ds nutrição. 2°ed. rev. Barueri, SP: Manole, 2014. 
	
	
	Nome do Paciente: Maria Souza
	Idade: 25 anos
	Endereço: Rua Machado de Assis, Bairro Sto. Amaro, 168
	Data de coleta: 02/09/2017
	Médico: João da Silva
	Data de liberação: 05/09/2017
	Convênio: UNIMED
	Código: 1234
	Material: Soro 
Método: Enzimático-Colorimétrico
Equipamento: Bioplus 200
Nome do Exame: Lipidograma
Resultados: Valores de referência:
Colesterol Total: 65 mg/dL Crianças e adolescentes: <170 mg/dL (com ou sem jejum) 
 Adultos (>20 anos): <190 mg/dL (com ou sem jejum) 
__________________________________________________________________________________
 Valores de referência:
Triglicérides: 115 mg/dL Adultos (>20 anos): <150mg/dl (com jejum)
 <175mg/dl (sem jejum)
 Crianças (0-9 anos): <75 mg/dL (com jejum)
 <85 mg/dL (sem jejum)
 Adolescentes (10-19 anos): <90 mg/dL (com jejum)
 <100 mg/dL (sem jejum) 
__________________________________________________________________________________ 
 Valores de referência:
 
	Crianças e adolescentes
	Com jejum
<110 mg/dL
	Sem jejum
<110 mg/dL
	
	Adultos (>20 anos)
	Com jejum
	Sem jejum
	Risco
	
	<130 mg/dL
	<130 mg/dL
	Baixo
	
	<100 mg/dL
	<100 mg/dL
	Intermediário
	
	<70 mg/dL
	<70 mg/dL
	Alto
	
	<50 mg/dL
	<50 mg/dL
	Muito Alto
Colesterol LDL: 97mg/dL 
 
__________________________________________________________________________________ 
 Valores de referência:
Colesterol HDL: 40mg/dL Crianças e adolescentes: >45 mg/dL (com ou sem jejum)
 Adultos (>20 anos): >40 mg/dL (com ou sem jejum)
	Nome e Assinatura do responsável: