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Carlos Eduardo Silva Cristiane Colodel Flávia Roberta Buss Marenda Bioquímica na Escola - uma seleção de experimentos de baixo custo envolvendo biomoléculas - Curitiba 2017 Apresentação Esta apostila foi produzida como um material de apoio para o minicurso “Bioquímica na Escola”, ministrado durante a V Semana Científica da Bioquímica, evento promovido pelo Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFPR. Este minicurso tem como objetivo oferecer aos professores do ensino básico metodologias experimentais para o ensino de Bioquímica, uma área de caráter multidisciplinar mas que ainda encontra certa dificuldade para ser desenvolvida nas escolas, seja por ser considerada muito complexa, seja pela dificuldade em ensinar Bioquímica utilizando apenas o giz e o quadro negro, quando não se dispõe de laboratórios bem equipados. Ao desenvolver este material, nós buscamos reunir experimentos simples, de baixo custo e utilizando materiais acessíveis, que podem ser encontrados mesmo em laboratórios não tão elaborados ou que podem ser facilmente adquiridos pelo professor na ausência de um laboratório, mas que ainda assim oferecem abordagens enriquecedoras para o ensino desta ciência tão encantadora que é a Bioquímica. Sumário Proteínas ....................................................................................................................................... 4 Comparação entre o teor de proteínas em alimentos .................................................................. 5 Hidrólise enzimática de proteínas ................................................................................................. 7 Lipídios .......................................................................................................................................... 9 Extração de lipídios de soja ......................................................................................................... 10 Reações de caracterização de lipídios ......................................................................................... 12 Carboidratos ................................................................................................................................ 17 Extração de carboidratos ............................................................................................................ 18 Caracterização de carboidratos................................................................................................... 21 Hidrólise de carboidratos ............................................................................................................ 22 Gelatinização do amido ............................................................................................................... 23 Produção de bioplástico de amido .............................................................................................. 24 Metabolismo energético ............................................................................................................. 27 Avaliação da produção de energia a partir de diferentes biomoléculas .................................... 28 Proteínas Comparação entre o teor de proteínas em alimentos 1. OBJETIVO . Comparar visualmente o teor de proteínas no leite de vaca integral e em bebida à base de hidrolisado de soja (leite de soja). 2. ASPECTOS TEÓRICOS Proteínas são biopolímeros formados por 20 tipos diferentes de unidades monoméricas, chamadas aminoácidos. São essenciais ao organismo animal, possuindo várias funções, principalmente estruturais, regulatórias e catalíticas. Operam com eficiência máxima em faixas restritas de pH e temperatura, e nestas condições adequadas, possuem quatro níveis estruturais bem definidos, sustentados por forças de atração e repulsão (pontes de hidrogênio, interações eletrostáticas, forças de Van der Walls e interações hidrofóbicas). Quando expostas a condições de pH e/ou temperatura diferentes das condições ótimas em que operam, estas forças de atração e repulsão são rompidas e os níveis estruturais se desfazem (apenas a estrutura primária, que corresponde à sequência de aminoácidos que forma a proteína, é sempre mantida). Neste caso, dizemos que a proteína desnatura. O método do biureto, que permite a determinação quantitativa de proteínas, utiliza o meio alcalino para desnaturar as proteínas presentes na amostra. Ao serem desnaturadas, as proteínas expõem o nitrogênio do grupo amino de cada aminoácido de sua estrutura primária. Estes nitrogênios possuem, cada um, um par de elétrons livres, e atuam como quelantes. Ao quelar o íon Cu²+ presentes no reagente de biureto, formam um complexo colorido, de cor violeta, cuja intensidade pode ser detectada através de um espectrofotômetro e, então, por meio de uma curva de calibração, determina-se a concentração de proteína na amostra. Os dipeptídeos dão reação negativa por apresentarem apenas uma ligação peptídica. Fig. 1 – Representação da complexação do íon Cu2+ pelos grupamentos amino presentes nas proteínas. 3. REAGENTES a) Leite de vaca integral b) Alimento à base de hidrolisado de soja c) Água destilada d) Sulfato de cobre 1% (m/v) e) Hidróxido de sódio 2,5 mol/L 4. PROCEDIMENTOS a) Identificar dois tubos de ensaio. Em um deles, adicionar 1 ml de leite de vaca integral e no outro 1 ml de alimento à base de hidrolisado de soja. Adicionar ml de água destilada em cada tubo e homogeneizar. b) Identificar três tubos de ensaio: no primeiro, adicionar 1 ml do leite de vaca integral diluído preparado no passo anterior; no segundo, adicionar 1 ml do alimento à base de hidrolisado de soja diluído, preparado no passo anterior; no terceiro, adicionar 1 ml de água destilada. Este último tubo funcionará como um branco da análise. c) Em todos os tubos, acrescentar 5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de CuSO4 1%. d) Comparar a intensidade da cor nos três tubos. Hidrólise enzimática de proteínas 1. OBJETIVO . Investigar o efeito do suco de abacaxi no processo de gelificação da gelatina. 2. ASPECTOS TEÓRICOS Proteínas são biopolímeros formados por unidades chamadas aminoácidos, que se unem através de ligações peptídicas, resultado de uma reação de condensação entre um grupo carboxílico de um aminoácido e do grupo amino de um segundo aminoácido. Fig. 1 – Representação da formação da ligação peptídica. As ligações peptídicas podem ser quebradas por ação de ácidos e de enzimas. A hidrólise enzimática de proteínas é de fundamental importância para que o organismo possa absorver os aminoácidos das proteínas ingeridas na alimentação e utilizá-los para suas necessidades metabólicas. As enzimas capazes de hidrolisar proteínas são denominadas proteases. Alguns exemplos são: pepsina, produzida no estômago de vertebrados; papaína, presente no látex do mamão; e bromelina, presente no suco do abacaxi. O colágeno é a proteína mais abundante no organismo dos animais vertebrados. É uma proteína fibrosa, essencial no organismo dos vertebrados, e sintetizada pelas células do tecido conjuntivo. É o principal ingrediente da gelatina, sendo que a consistência da gelatina deve-se à estrutura formada pelas longas cadeias do colágeno, que forma um gel quando dispersa em meio aquoso nas condições apropriadas. 3. REAGENTES a) Preparo para gelatina (qualquer sabor) b) Água c) Abacaxi 4. PROCEDIMENTOS a) Preparar a gelatina conforme instruções do fabricante. b) Descascar o abacaxi e cortar em pedaços. Obter o suco prensando os pedaçosou moendo no liquidificador e coando em um pano. c) Identificar dois tubos de ensaio. Em um deles, adicionar 5 ml da gelatina preparada no passo anterior; no outro tubo, adicionar 4,5 ml de gelatina e 0,5 ml de suco de abacaxi. d) Misturar bem e levar os dois tubos à geladeira por 1h. e) Comparar o que ocorreu nos dois tubos. Lipídios Extração de lipídios de soja 1. OBJETIVO . Isolar triacilgliceróis a partir de grãos de soja e farinha de soja 2. ASPECTOS TEÓRICOS 2.1. Lipídios Os lipídios se caracterizam por sua insolubilidade em água e solubilidade em solventes orgânicos, como clorofórmio, éter, benzeno, mistura de Folch (clorofórmio:metanol). Moléculas de lipídio são hidrofóbicas devido ao pequeno número de grupamentos funcionais que podem fazer pontes de hidrogênio com a água. Essa hidrofobicidade resulta em um tipo especial de comportamento em meio aquoso. Algumas moléculas lipossolúveis, como os triacilgliceróis, formam gotas de gordura que minimizam a área de contato com a água. Outras, como os ácidos graxos, que contêm vários grupamentos funcionais polares, são capazes de formar uma interface com a água, produzindo membranas celulares ou micelas. 2.2. Estrutura e propriedades dos ácidos graxos A configuração ao redor de ligações insaturadas é designada cis ou trans. Ácidos graxos de ocorrência natural contêm duplas-ligações cis, enquanto ácidos graxos insaturados parcialmente hidrogenados contêm alguma forma trans. Ácidos graxos formam micelas esféricas na água devido às suas propriedades anfipáticas (posse tanto de uma extremidade polar [grupamento carboxilato] quanto uma extremidade apolar [cadeia de hidrocarboneto]). Ácidos graxos formam micelas esféricas orientando cadeias de hidrocarbonetos juntas, no centro, e posicionando grupamentos carboxilatos polares na superfície, para formar pontes de hidrogênio com a água. O ponto de fusão dos ácidos graxos é determinado pela extensão da cadeia e pelo seu grau de insaturação: . o aumento da cadeia aumenta o ponto de fusão . o aumento do grau de insaturação diminui o ponto de fusão . cis-insaturação reduz o ponto de fusão mais que a insaturação trans. 2.3. Triacilgliceróis ou triglicerídios O glicerídeo é um composto cuja molécula possui três grupos ésteres que em conjunto com três moléculas de ácidos graxos superiores (ácidos carboxílicos de cadeia longa) formam o triacilglicerol. A esterificação dos grupamentos carboxila livres com glicerol resolve o problema. O glicerol pode ser esterificado com um, dois ou três ácidos graxos para formar mono, di ou triglicerídeos, respectivamente. 2.4. A hidrogenação parcial dos óleos de cozinha produz ácidos graxos trans A maioria das gorduras naturais, como as dos óleos vegetais, dos laticínios e da gordura animal, são misturas complexas de triacilgliceróis simples e mistos, que contêm uma variedade de ácidos graxos que diferem no comprimento da cadeia e no grau de saturação. Os óleos vegetais, como o óleo de milho e o azeite de oliva, são compostos em grande parte por triacilgliceróis com ácidos graxos insaturados e, portanto, são líquidos à temperatura ambiente. Os triacilgliceróis que contêm somente ácidos graxos saturados, como as triestearinas, o componente mais importante da gordura da carne de gado, são sólidos brancos e gordurosos à temperatura ambiente. Quando alimentos ricos em lipídeos são expostos por muito tempo ao oxigênio do ar, eles podem estragar e tornarem-se rançosos. O gosto e o cheiro desagradáveis associados à rancidez resultam da clivagem oxidativa das ligações duplas em ácidos graxos insaturados, que produz aldeídos e ácidos carboxílicos de cadeias curtas e, portanto, de maior volatilidade. Para aumentar o prazo de validade de óleos vegetais de cozinha e para aumentar a sua estabilidade às altas temperaturas utilizadas na fritura, os óleos vegetais são submetidos à hidrogenação parcial. Esse processo converte muitas ligações duplas cis dos ácidos graxos em ligações simples e aumenta o ponto de fusão dos óleos, de forma que eles ficam mais próximos do estado sólido à temperatura ambiente (a margarina é produzida a partir de óleo vegetal dessa maneira). A hidrogenação parcial tem outro efeito indesejado: algumas ligações duplas cis são convertidas em ligações duplas trans. Há, atualmente, forte evidência de que o consumo de ácidos graxos trans através da dieta (frequentemente chamados de “gorduras trans”) leva a uma maior incidência de doenças cardiovasculares e que evitar essas gorduras na dieta reduz consideravelmente o risco de doenças cardíacas. Os ácidos graxos trans da dieta aumentam o nível de triacilgliceróis e de colesterol LDL (o colesterol “ruim”) no sangue e diminuem o nível de colesterol HDL (o colesterol “bom”). Essas mudanças por si só são suficientes para aumentar o risco de doenças no coração, mas eles podem ter mais efeitos adversos. Eles parecem, por exemplo, aumentar a resposta inflamatória do corpo, o que é outro fator de risco para doenças cardíacas. 3. REAGENTES Farinha de soja Grão de soja (sem casca) Acetona (hexano ou éter de petróleo) 4. PROCEDIMENTOS 4.1. Extração do óleo vegetal (triacilgliceróis) a) Em um béquer de 100 mL pesar 10 g de soja (farinha ou grão sem casca) b) Adicionar 25 mL de acetona (hexano ou éter de petróleo) e agitar por 5 minutos c) Filtrar com papel filtro para outro béquer de massa conhecida d) Lavar o resíduo com 10 mL de acetona por duas vezes e) Evaporar o filtrado em banho-maria à temperatura de 50°C, com agitação constante até a eliminação da acetona f) Observar o resíduo amarelo e oleoso, pesar o béquer e, por diferença de peso calcular o rendimento da extração g) Armazenar os triacilgliceróis obtidos para os testes de caracterização Reações de caracterização de lipídios 1. OBJETIVOS . Testar a solubilidade de lipídios em diferentes solventes . Promover a hidrólise alcalina (reação de saponificação) de triacilgliceróis do óleo de soja 2. ASPECTOS TEÓRICOS 2.1. Interação com lipídios Enquanto as forças intramoleculares mantêm os átomos em uma molécula, e constituem a base para a racionalização das propriedades químicas, as forças intermoleculares são responsáveis por todas as propriedades físicas da matéria. À medida que a magnitude das forças intermoleculares aumenta, fica mais difícil o afastamento entre uma molécula e outra. Portanto, espera-se que o ponto de fusão, por exemplo, seja maior para aquelas substâncias que possuam interações intermoleculares mais fortes. Sabe-se que é necessário fornecer energia para transformar um sólido em um líquido e um líquido em um gás. Estas energias estão diretamente relacionadas com a força de atração entre as moléculas nas fases condensadas (líquida e sólida). Uma vez que a energia é diretamente proporcional à temperatura, cada um destes processos irá variar com a magnitude das forças intermoleculares. Isto é, à medida que a magnitude das interações intermoleculares aumenta, as energias necessárias para fundir, vaporizar ou sublimar uma substância aumentam. Uma substância com atração intermolecular muito forte, como a água, misturada com uma substância com atração intermolecular bem menor, como o óleo de cozinha, resulta no seguinte: as moléculas de água irão interagir fortemente não deixando espaço para que o óleo, com polos menos intensos, possa interagir com a água. É mais ou menos como uma mistura de areia com pedacinhos de ímã. Se colocarmos pedacinhos de ímãs em um vidro, espaçados entre si por areia, fecharmoso vidro e chacoalharmos, notaremos que os pedacinhos de ímã, ao se encontrarem, grudarão uns aos outros devido à forte atração entre os seus polos opostos. Ao fim do chacoalho teremos um grumo de pedacinhos de ímã separados da areia. A atração entre os pedaços de imã é mais forte do que a capacidade da areia de entrar entre os pedaços do ímã. Processo semelhante acontece com a água e o óleo: a água interage fortemente entre si, deixando pouco espaço para interação com o óleo, que tem menor força atrativa do que a água. Se for o etanol no lugar do óleo, haverá uma mudança no processo, pois o etanol possui força de atração intermolecular próxima à força de atração intermolecular da água. Água e óleo As interações moleculares atuam, em geral, com a regra: “semelhante dissolve semelhante”. Isso ocorre porque quando há formação de soluções ocorre quebra de interações e novas são criadas. Se as novas forem semelhantes às antigas há pouco gasto de energia. Esta regra pode ser determinada pela polaridade das moléculas, ou seja, substâncias polares solubilizam bem outras substâncias polares, e substâncias apolares solubilizam bem as substâncias apolares. O hexano (C6H14), uma substância apolar, dissolve muito bem óleos e gorduras (apolares). Já a água (polar) solubiliza muito bem ácidos e bases, pois a interação entre estas substâncias é do tipo polar. HCl e óleo O HCl em solução dissocia-se em H+ e Cl-, formando uma solução eletrolítica. A adição desses eletrólitos diminui a solubilidade dos compostos orgânicos. Acetona e óleo Apesar de ser um composto polar, solúvel em água e etanol, a acetona também pode solubilizar compostos orgânicos como isopropanol e tolueno (metilbenzeno). A acetona é menos polar que a água devido aos grupos metila nas extremidades da cadeia. Estes grupos permitem que a acetona solubilize as moléculas de lipídeos. Álcool etílico e óleo O etanol apesar de ser polar pode formar uma emulsão, ou seja, quando gotas de uma fase permanecem em suspensão na outra fase. Após um tempo de repouso a emulsão se desfaz. Éter e óleo Como a acetona, o éter possui grupos metil nas extremidades da cadeia, os quais solubilizam as moléculas de lipídeos. Sulfato de amônia Assim como o HCl, o (NH4)2SO4 também se dissocia em NH4 + e SO4 -2, formando uma solução eletrolítica. A adição desses eletrólitos à solução diminui a solubilidade dos compostos orgânicos. 2.2. Reação de saponificação Os lipídios dos grupos dos acilgliceróis ou glicerídeos, ceras, fosfolipídios e glicolipídios apresentam ácidos graxos esterificados em suas estruturas. Estes compostos, mediante aquecimento em presença de bases fortes, como hidróxido de sódio ou potássio, sofrem hidrólise, produzindo sais de sódio ou potássio de ácidos graxos ou sabões. Graças a esta propriedade, estes lipídios são denominados saponificáveis, já que podem ser caracterizados pela saponificação. A hidrólise alcalina de um triacilglicerol catalisada por hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio produz glicerol e sais potássicos ou sódicos de ácidos graxos. Os sabões são moléculas anfipáticas que apresentam em sua estrutura uma longa cadeia hidrocarbonada (cauda apolar, lipofílica) e um grupo carboxilato (cabeça polar, hidrofílica). FONTE: BARBOSA e SILVA, 1995. Por causa de seu caráter anfipático, em solução as moléculas de sabão se associam por interações hidrofóbicas entre as caudas apolares, formando micelas que apresentam os grupos carboxilatos carregados negativamente em sua superfície. FONTE: BARBOSA e SILVA, 1995. Os líquidos apresentam tensão superficial, uma tendência a minimizar sua área superficial por causa da atração das moléculas da superfície do líquido pelas moléculas de dentro do líquido. Na superfície da água, as moléculas de sabão se orientam em uma camada na qual as cabeças polares interagem com a água e as caudas apolares permanecem fora do líquido. Esta disposição provoca o abaixamento da tensão superficial da água. Sabões também possuem poder emulsificante, visto que, quando agitados com óleo ou gordura, em meio aquoso, interagem com estes a partir das caudas apolares e produzem gotículas carregadas que se mantêm em emulsão. Sob condições específicas, os ácidos graxos dos sabões podem ser precipitados. A adição de ácidos fracos, como ácido acético, leva a formação de ácidos graxos insolúveis por causa do baixo grau de dissociação. Os sabões precipitam quando são usados em águas ricas em sais de cálcio ou magnésio (águas duras). Os íons cálcio e magnésio (metais alcalino-terrosos) da água reagem com os ácidos graxos formando sais insolúveis. Sabões também podem precipitar pela adição de excesso de eletrólitos, os quais reprimem a dissociação dos sabões, fazendo com que as micelas percam a carga e precipitem. 3. REAGENTES a) Óleo de soja b) Margarina c) Manteiga d) Água destilada e) Álcool Etílico f) Éter Etílico g) Acetona h) Solução de potassa alcoólica (misturar 1 volume de hidróxido de potássio 40% (m/v) e 1 volume de álcool etílico 95% (v/v)) 4. PROCEDIMENTOS 4.1. Testes de solubilidade dos lipídios a) Em 3 tubos de ensaio, coloque em cada um 2mL de água destilada e adicione 3 gotas de óleo de soja no primeiro, uma pitada de manteiga no segundo e uma pitada de margarina no terceiro b) Em 3 tubos de ensaio, coloque em cada um 2mL de álcool etílico e adicione 3 gotas de óleo de soja no primeiro, uma pitada de manteiga no segundo e uma pitada de margarina no terceiro c) Em 3 tubos de ensaio, coloque em cada um 2mL de éter etílico e adicione 3 gotas de óleo de soja no primeiro, uma pitada de manteiga no segundo e uma pitada de margarina no terceiro d) Em 3 tubos de ensaio, coloque em cada um 2mL de acetona e adicione 3 gotas de óleo de soja no primeiro, uma pitada de manteiga no segundo e uma pitada de margarina no terceiro e) Agite os tubos e verifique a solubilidade dos lipídios em cada tipo de solvente f) Anote os resultados 4.2. Reação de saponificação a) Em um tubo de ensaio grande colocar 15 gotas de óleo vegetal b) Adicionar 5 mL de solução de potassa alcoólica c) Adicionar perolas de porcelana para evitar ebulição tumultuosa d) Aquecer em banho-maria fervente durante 30 minutos e) Nestas condições o óleo é saponificado, obtendo-se uma solução opalescente de sais de potássio de ácidos graxos (sabões) e glicerol. f) Transferir o sabão obtido para um erlenmeyer g) Acrescente 10ml de água destilada, agite e observe os resultados Carboidratos Extração de carboidratos 1. OBJETIVO . Isolar os polissacarídeos de reserva (amido) da batata 2. ASPECTOS TEÓRICOS 2.1. O que são carboidratos? Os carboidratos (açúcares) podem ser descritos como poliidroxialdeídos ou poliidroxicetonas. A fórmula molecular geral para carboidratos é CnH2nOn. Os grupamentos hidroxila, aldeído ou cetona são sítios potenciais para reação e modificação que produzem derivados de carboidratos. 2.2. Amido O amido é o principal carboidrato de reserva vegetal, além de ser o mais importante na alimentação humana. É encontrado na forma de grânulos nos cloroplastos das folhas, nas frutas, nas sementes e tubérculos. A quantidade de amido em sementes e tubérculos como a batata é extremamente alta, podendo chegar a 75% do peso seco. Os grânulos de amido são insolúveis. Quando uma suspensão de amido é aquecida, os grânulos se desintegram, formando uma dispersão coloidal. O amido pode ser precipitado destas soluções em condições que promovam sua desidratação, tais como adiçãode álcool etílico ou solução saturada de sal. Estruturalmente, o amido consiste de uma mistura de dois homopolímeros de glucose, a amilose e a amilopectina. A amilose é um polissacarídeo linear formado por unidades de D-glucose unidas por ligações glicosídicas do tipo α (1→4). A amilopectina é altamente ramificada, sendo formada por unidades de D-glucose ligadas α (1→4), mas com pontos de ramificação α (1→6). A frequência de ramificações ao longo da cadeia principal é de uma a cada 24 - 30 unidades de glucose. Estrutura química da amilose (a) e amilopectina (b). FONTE: CORRADINI et al., 2005. Por sua estrutura regular, a amilose adota uma conformação em hélice com seis unidades de glucose a cada volta. Não se sabe ao certo se a amilopectina adota algum tipo de conformação preferencial. 3. REAGENTES a) Batata b) Água destilada c) Água destilada fervente 4. PROCEDIMENTOS 4.1. Extração do amido a) Raspar um pedaço de batata com uma lâmina de vidro b) Transferir a raspa para um béquer de 100 mL c) Adicionar 50 mL de água destilada e agitar vigorosamente com um bastão de vidro d) Filtrar o material com uma gaze, recolher o filtrado em um béquer de 150 mL e espremer delicadamente a gaze e) Deixar em repouso por 10 minutos, e a seguir, remover cuidadosamente o líquido sobrenadante. O depósito no fundo do béquer é o amido que foi extraído da batata e será utilizado para o preparo de uma solução 4.2. Preparo da solução de amido a) Manter aproximadamente 50 mL de água fervendo em um béquer b) Acrescentar aproximadamente 50 mL de água fria ao depósito obtido anteriormente c) Adicionar água fervente lentamente e com constante agitação à suspensão de amido d) Continuar o aquecimento até que se forme uma solução opalescente e) Armazenar a solução resultante para os testes de caracterização Caracterização de carboidratos 1. OBJETIVO . Caracterizar o amido através de reações de coloração e precipitação 2. ASPECTOS TEÓRICOS Um teste bastante utilizado para detectar a presença de amido é a reação com iodo, que utiliza o lugol (mistura de iodo e iodeto de potássio). Moléculas de iodo podem ser complexadas pela hélice da amilose, formando um complexo azul escuro. No complexo amido-iodo, as moléculas de iodo estão paralelas ao eixo da hélice. Seis voltas da hélice (contendo 36 unidades de glucose) são necessárias para produzir a cor azul característica do complexo. O componente do amido responsável por esta coloração característica é a amilose, entretanto a reação com a amilopectina dá origem a uma coloração marrom-avermelhada. Este complexo se dissocia por aquecimento graças à perda da estrutura helicoidal, e volta a se formar quando a solução é resfriada. 3. REAGENTES a) Solução de amido de batata b) Solução de lugol c) Álcool Etílico 4. PROCEDIMENTOS 4.1. Reações de coloração REAÇÃO DO LUGOL a) Pipetar 2 mL da solução de amido de batata em tubo de ensaio b) Adicionar 3 gotas de lugol e observar a aparecimento de coloração azul intensa c) Aquecer cuidadosamente direto na chama até observar o desaparecimento da cor azul d) Resfriar em água corrente e observar a cor 4.2. Reações de precipitação PRECIPITAÇÃO COM ÁLCOOL ETÍLICO a) Pipetar 2 mL da solução de amido de batata em tubo de ensaio b) Adicionar 2 mL de álcool etílico e agitar c) Filtrar com gaze d) Verificar a presença de amido no filtrado e no precipitado (teste de lugol) Hidrólise de carboidratos 1. OBJETIVO . Demonstrar a hidrólise ácida do amido . Evidenciar a hidrólise dos polissacarídeos por meio de reações específicas 2. ASPECTOS TEÓRICOS Em presença de ácidos fortes e sob aquecimento, as ligações glicosídicas presentes no amido podem ser hidrolisadas. O ácido quente hidrolisa tanto ligações α (1→4) quanto α (1→6). Em função do tempo de hidrólise são encontrados como produtos intermediários dextrinas e oligossacarídeos, sendo a glucose o produto final da hidrólise ácida. 3. REAGENTES a) Solução de amido de batata b) Vinagre ou ácido clorídrico c) Solução de lugol 4. PROCEDIMENTOS 4.1. Hidrólise ácida a) Pipetar 5 mL da solução de amido de batata em tubo de ensaio e deixa-lo em banho fervente por 5 minutos b) Adicionar 2 mL de vinagre (ou 0,2 mL de ácido clorídrico concentrado) e homogeneizar c) Transferir 0,5 mL da amostra para um tubo de ensaio nos tempos de 5, 10, 15 e 20 minutos e imediatamente fazer o teste de lugol (3 gotas para cada tubo) Gelatinização do amido 1. OBJETIVO . Desenvolver biofilme alimentício a partir de amido de milho 2. ASPECTOS TEÓRICOS A água fria pode penetrar nas regiões amorfas do granulo de amido, sem perturbar as miscelas (zonas cristalinas). Mas, se esse material for aquecido, as moléculas irão vibrar mais intensamente, quebrando as pontes de hidrogênio e permitindo que a água penetre nas miscelas, tornando o amido transparente. Durante a gelatinização, o grão incha formando uma pasta. Quando essa pasta for resfriada, a viscosidade aumenta formando um gel. 3. REAGENTES a) Solução de amido de milho b) Gelatina incolor c) Água d) Maçã 4. PROCEDIMENTOS 4.1. Desenvolvimento de biofilme a) Misturar 100 g de amido de milho, 40 g de gelatina, 250 mL de água b) Adicionar a mistura em uma panela até a formação de um gel c) Resfriar a temperatura ambiente d) Mergulhar uma maçã no gel e deixar secar durante três dias em temperatura ambiente. Produção de bioplástico de amido 1. OBJETIVO . Produzir bioplástico a partir de amido de milho 2. ASPECTOS TEÓRICOS Os plásticos estão presentes em grande quantidade na vida moderna. São matéria-prima para fabricação de equipamentos eletrônicos, utensílios domésticos, brinquedos, peças de automóveis, embalagens e muitos outros objetos. Apesar de trazer benefícios para a sociedade por ser um material leve, resistente, durável, barato e versátil, o plástico também representa um risco, principalmente do ponto de vista ambiental. A primeira desvantagem do uso do plástico é que ele é produzido a partir do petróleo. O petróleo é um recurso natural não-renovável, que leva milhões de anos para ser produzido pela natureza, e algumas estimativas apontam que as reservas irão se esgotar dentro de 50 anos. Outra desvantagem do plástico, e talvez a maior razão para que ele represente um risco ambiental, é o tempo que ele leva para se decompor na natureza – até 450 anos, dependendo do tipo de plástico. Esta resistência à decomposição apresentada pelo plástico se deve ao fato de que não existem microrganismos na natureza capazes de degradar o plástico e por isso as reações químicas que o decompõem ocorrem muito lentamente. Visando buscar alternativas para reduzir o consumo de petróleo e diminuir a poluição gerada pelos plásticos sem afetar o bem-estar da sociedade, alguns cientistas vêm desenvolvendo plásticos produzidos a partir de fontes renováveis e que são capazes de ser degradados por microrganismos, reduzindo seu tempo de permanência na natureza. São os chamados bioplásticos ou plásticos biodegradáveis. Estes plásticos são geralmente produzidos a partir de fontes vegetais ou animais, que são recursos renováveis que existem em abundância na natureza. Uma das possíveis matérias-primas para a produção de plástico biodegradável é o amido. O amido é um polímero utilizado como fonte de energia (alimento) pelas plantas, produzido através da fotossíntese e armazenado nas raízes, frutos, sementes e tubérculos. Por ser armazenado em grande quantidade em vários tipos de plantas, é um recurso abundante, renovávele de baixo custo. Vários estudos vêm sendo realizados para a elaboração de plásticos biodegradáveis a partir de amido, que pode ser aplicado na fabricação de sacos de lixo, filmes para proteger alimentos, fraldas, copos e talheres descartáveis, material escolar e brinquedos. A estrutura das moléculas de amido é formada por unidades de glucose ligadas umas às outras, em sequência, formando um polímero linear bastante longo, como mostra a Fig. 1. Fig. 1 – Estrutura da molécula de amido. Estas longas moléculas possuem forte interação entre si, e quando estão dissolvidas em água e são aquecidas, se aglomeram e formam um gel. Às vezes, podem existir também unidades de glucose ligadas lateralmente à cadeia principal, o que atrapalha a atração entre as moléculas, e para removê-las pode-se acidificar o meio, promovendo hidrólise das cadeias laterais, que são mais lábeis que a cadeia principal. Assim, as moléculas de amido podem atrair-se mais fortemente e manter-se mais unidas. Quando se adiciona uma substância plastificante, como a glicerina por exemplo, à solução de amido, as moléculas de amido ainda mantêm-se fortemente unidas, porém distantes o suficiente para que possam deslizar umas sobre as outras, como pode ser visto na Fig. 2. O plastificante é o agente responsável por manter a consistência, a integridade e principalmente a flexibilidade do plástico, para que ele seja resistente e não se rompa facilmente. Fig. 2 – Representação da ação da glicerina como plastificante, mantendo as moléculas de amido fortemente unidas, mas podendo deslizar umas sobre as outras. n n 3. REAGENTES a) Amido de milho b) Glicerina c) Vinagre d) Água e) Corante alimentício 4. PROCEDIMENTOS 4.1. Preparo do bioplástico a) Em uma panela, misturar 50 g de amido de milho e 500 ml de água b) Adicionar 20 ml de vinagre c) Adicionar algumas gotas de corante alimentício (a quantidade depende da intensidade da cor que se deseja obter) d) Manter em fogo baixo mexendo sempre até se obter um gel e) Espalhar o gel formado em uma superfície plana (um prato, por exemplo) e deixar secar a temperatura ambiente. Metabolismo energético Avaliação da produção de energia a partir de diferentes biomoléculas 1. OBJETIVOS . Comprovar a preferência por carboidrato no metabolismo energético das leveduras . Demonstrar a produção do gás CO2 como um dos produtos da respiração celular 2. ASPECTOS TEÓRICOS Os organismos vivos precisam de energia para realizar trabalho e manter suas atividades. Esta energia é obtida a partir de algumas fontes, que funcionam como “combustíveis” para esses organismos. Porém, diferentes das máquinas, que convertem em energia mecânica o calor gerado pela combustão dos seus combustíveis específicos, os organismos não são capazes de transformar energia térmica em trabalho. Nos sistemas vivos, o tipo de energia utilizada é a energia química, que é armazenada na forma de ATP (adenosina trifosfato). Fig. 1 – Estrutura da molécula de ATP. O ATP é gerado através de processos bioquímicos acoplados que ocorrem no interior das células:a glicólise, que ocorre no citoplasma, e o ciclo dos ácidos tricarboxílicos (também conhecido como Ciclo de Krebs ou ciclo do ácido cítrico) e a fosforilação oxidativa, que ocorrem nas mitocôndrias. Na glicólise, apenas a glucose (e algumas outras D-hexoses) é metabolizada, sendo convertida a piruvato, e então a acetil-CoA, podendo então entrar no ciclo do ácido cítrico. Outras biomoléculas, como ácidos graxos e aminoácidos (que formam as proteínas), também podem ser convertidas a acetil-CoA, e entrar no ciclo do ácido cítrico, sendo que, portanto, açúcares, lipídeos e proteínas atuam como possíveis “combustíveis” para as células. Nestes dois processos – glicólise e ciclo do ácido cítrico – ocorrem diferentes tipos de reações químicas, sendo dois deles importantes neste experimento: a) as reações de óxido- redução, que retiram elétrons das moléculas “combustíveis” e b) as reações de descarboxilação, que retiram carbonos destas moléculas e os convertem em CO2. As moléculas de CO2 entram na corrente sanguínea e são liberadas pelos pulmões no processo de respiração, enquanto os elétrons retirados são captados por moléculas complexas que formam a cadeia respiratória, que é responsável por carregar estes elétrons até moléculas de O2, que são reduzidas a H2O, enquanto bombeiam H + para fora da membrana, formando um gradiente de potencial que fornece energia para a síntese de ATP. Apesar de três das principais classes de biomoléculas serem capazes de fornecer energia para as células, existe certa “preferência” por uma delas. Este experimento permite avaliar qual tipo de biomolécula – carboidratos, lipídeos ou proteínas – é preferencialmente utilizada para obtenção de energia pela levedura Saccharomyces cerevisiae, servindo como modelo para observação do metabolismo celular. 3. REAGENTES a) Fermento biológico b) Água destilada c) Sacarose (solução saturada) d) Clara de ovo in natura e) Óleo de soja 4. PROCEDIMENTOS 4.1. Ativação da levedura a) Dissolver o fermento biológico (10 g) em 40 ml de água à temperatura ambiente b) Completar até 200 ml com água morna (cerca de 40°C) 4.2. Avaliação da produção de energia a partir de diferentes fontes a) Identificar quatro tubos de ensaio (A, B, C e D) b) No tubo A, adicionar 5 ml de água destilada c) No tubo B, adicionar 5 ml da solução saturada de sacarose d) No tubo C, adicionar 5 ml de óleo de soja e) No tubo D, adicionar 5 ml de clara de ovo f) Adicionar 5 ml de levedura ativada em cada tubo g) Tampar os tubos com balões de borracha (balões de festa) h) Deixar em repouso, à temperatura ambiente, por 2 horas i) Comparar o volume dos balões em cada tubo
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