Testes API

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T5 – Identificação de bactérias através de teste API 20E
T5 – Identificação das bactérias através de testes API 20E
Trabalho realizado por: Beatriz Moniz e Carolina Vicente
Data de realização: 19 de novembro de 18
Data de entrega: 27 de novembro de 18
Sumário
	A atividade experimental nº5, designada de “Identificação de bactérias através de testes API 20E”, teve por objetivo identificar uma espécie bacteriana através de um sistema padronizado para a identificação de Enterobacteriaceae e outros bacilos Gram negativos designado de teste API 20E. Os testes realizados englobam
	
Observações experimentais
	De modo a se proceder aos testes API 20E, foi necessário o inóculo, que foi previamente preparado pela docente e a galeria, que contém 20 microtubos, cada um com um substrato desidratado. Ao adicionar o inóculo de uma suspensão bacteriana, os substratos são hidratados e, após incubação, são lidos os resultados com base num Quadro de Leitura, que podem ser positivos ou negativos. Os testes que constam na galeria utilizada são ONPG (Orto-nitrofenil beta-D-galactopiranosídeo), ADH (descarboxilação do aminoacido arginina), LDC (descarboxilação do aminoácido lisina), DOC (descarboxilação do aminoacido ornitina), CIT (utilização de citrato como fonte de carbono), H2S (produção de sulfureto de hidrogénio), URE (teste para a enzima urease), TDA (deteção da enzima triptofanase), IND (produção de indol a partir de triptofano), VP (Voges-Porskauer para deteção da acetoína produzida por fermentação da glucose), GEL (produção da enzima gelatinase), GLU (fermentação da glucose), MAN (fermentação da manose), INO (fermentação de inositol), SOR (fermentação do sorbitol), RHA (fermentação da ramnose, SAC (fermentação da sacarose), MEL (fermentação de melibiose), AMY (fermentação de amigdalina) e ARA (fermentação de arabinose). É de salientar que o teste oxidase constitui o 21º teste de identificação e não está incluído na galeria. Há que ter em atenção que certos testes exigem condições de crescimento como um ambiente anaeróbio ou mesmo adição de reagentes após a incubação. Para os testes CIT, VP e GEL, encheu-se o tubo e a cúpula com inóculo; para os testes ADH, LDC, ODS, H2S e URE adicionou-se óleo de parafina de modo a criar anaerobiose. Depois da incubação a uma temperatura de 36 °C entre 18 a 24 horas, foi adicionado reagente TDA ao microtubo referente ao teste TDA, reagente JAMES no microtubo referente ao teste do indol e, ao teste VP, adicionou-se os reagentes VP1 e VP2. Na Figura 1, encontra-se demonstrados as observações dos testes realizados em aula e na Figura 2, encontra-se a classificação dada (positivo ou negativo) segundo o Quadro de Leitura fornecido pela docente (Tabela 1 em anexo).
Figura 1 - Observações dos resultados dos testes API 20E
 Figura 2 - Observações realizadas ao testes ONPG (Orto-nitrofenil beta-D-galactopiranosídeo), ADH (descarboxilção do aminoacido arginina), LDC (descarboxilação do aminoácido lisina), DOC (descaboxilação do aminoacido ornitine), CIT (utilização de citrato como fonte de carbono), H2S (produção de sulfureto de hidrogénio), URE (teste para a enzima urease), TDA (deteção da enzima triptofanase), IND (produção de indol a partir de triptofano), VP (Voges-Porskauer para deteção da acetoína produzida por fermentação da glucose), GEL (produção da enzima gelatinase), GLU (fermentação da glucose), MAN (fermentação da manose), INO (fermentação de inositol), SOR (fermentação do sorbitol), RHA (fermentação da ramnose e SAC (fermentação da sacarose)
 
 
, Figura 3 – Ficha de leitura com as classificações de acordo com o Quadro de Leitura. ONPG : positivo, ADH: negativo, LDC: positivo, DOC: positivo, CIT: positivo, HSS: negativo, URE: negativo, TDA: positivo, IND: negativo, VP: positivo, GEL: negativo, GLU: positivo, MAN: positivo, INO: positivo, SOR: positivo, RHA: positivo, SAC: positivo, MEL: positivo, AMY: positivo, ARA: positivo e Oxidase: negativo
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Resultados experimentais
	 O teste API é um sistema padronizado para identificação de espécies do género Enterobacteriaceae e outros bacilos Gram negativos não fastidiosos. O método passa por inserir o inóculo em 20 microtubos que apresenta substratos desidratados. Após incubação e leitura de resultados pelo Quadro de Leitura, é possível identificar o microrganismo a partir de um perfil numérico. O perfil numérico é obtido na ficha de leitura (Figura 3), a partir da soma do valor dos testes positivos dos diferentes grupos. Desta forma, é possível concluir que o perfil numérico do microrganismo fornecido pela docente é dado por 5305773.
	Segundo uma base de dados, o perfil numérico é referente à bactéria Enterobacter aerogenes. A bactéria E. aerogenes, pertencente à família Enterobacteriaceae, é um Gram-negativo em forma de bastonete, facultativo anaeróbio, não esporângico, que recorre à fermentação fórmica e lática para obter energia, com produção de etanol, acetoína e butanodiol. Além disso, apresentam características distintas deste género entre estas o facto de ser citrato positivo, maioria são positivas quanto ao teste VP (Voges-Proskauer), citrato e indol positivo, podendo varia na reação do vermelho de metilo (VM).
	O teste do ONPG indica a presença da enzima β-galactosidase no sistema metabólico da bactéria através da adição de ONPG (orto-nitrofenil beta-D-galactopiranosídeo). Pela ação da enzima β-galactosidase ocorre a hidrólise da molécula ONPG, libertando orto-nitrofenol de cor amarela, o que evidencia rapidamente a ocorrência da hidrólise. [ ] Sendo as enzimas β-galactosidase utilizadas essencialmente na fermentação lática, é possível concluir que a bactéria testada recorre à fermentação lática, o que vai de acordo com o teoricamente esperado.
	O teste ADH, LDC E DOC consistem na ação das enzimas arginina dihidrolase, lisina descarboxilase e ornitina descarboxilase, na descarboxilação dos respetivos aminoácidos. Tendo em conta os resultados, a bactéria E. aerogenes apresenta ter capacidade para realizar a descarboxilação da lisina e da ornitina, excepto da arginina. Segundo testes anteriormente realizados, os resultados vão de acordo com o microrganismo em questão. [ ]
	
	
Os testes que constam na galeria utilizada são ONPG (Orto-nitrofenil beta-D-galactopiranosídeo), ADH (descarboxilação do aminoacido arginina), LDC (descarboxilação do aminoácido lisina), DOC (descarboxilação do aminoacido ornitine), CIT (utilização de citrato como fonte de carbono), H2S (produção de sulfureto de hidrogénio), URE (teste para a enzima urease), TDA (deteção da enzima triptofanase), IND (produção de indol a partir de triptofano), VP (Voges-Porskauer para deteção da acetoína produzida por fermentação da glucose), GEL (produção da enzima gelatinase), GLU (fermentação da glucose), MAN (fermentação da manose), INO (fermentação de inositol), SOR (fermentação do sorbitol), RHA (fermentação da ramnose, SAC (fermentação da sacarose), MEL (fermentação de melibiose), AMY (fermentação de amigdalina) e ARA (fermentação de arabinose). 
	
Enterobacter, (genus Enterobacter), any of a group of rod-shaped bacteria of the family Enterobacteriaceae. Enterobacter are gram-negative bacteria that are classified as facultative anaerobes, which means that they are able to thrive in both aerobic and anaerobic environments. Many species possess flagella and thus are motile. Features such as motility, as well as certain biochemical properties, including the ability to synthesize an enzyme known as ornithine decarboxylase, are used to distinguish Enterobacter from the very similar and closely related Klebsiella bacteria. Enterobacter is named for the organisms’ predominant natural habitat, the intestines of animals (from Greek enteron, meaning “intestine”).
Anexos
Na Tabela 1 encontra-se o Quadro de Leitura fornecido pelo docente, usado para classificaras observações como negativas ou positivas
Tabela 1 - Quadro de Leitura