Apostila Microbiologia 2019

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APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS: 
 
IMUNOLOGIA E MICROBIOLOGIA 
 
 
 Fonte: https://kasvi.com.br/meningite-bacteriana-importancia-diagnostico-diferenciacao/ 
 
 
 
 
 
 
 
Acadêmico(a):____________________________________________________ 
Curso:___________________________ Série:___________ Turma:_________ 
 
 
 
NORMAS DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
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NORMAS DO TRABALHO MICROBIOLÓGICO 
 
* Cada aluno é responsável pelo material que receber. 
* No início de cada aula, traçar um plano de trabalho, considerando o tempo necessário para 
uma análise e a sua leitura. 
* Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranquila, constante e metódica, evitando movimentos 
desnecessários como trocas de lugar, etc. 
* Limpar e desinfetar com álcool 70 % a superfície de mesas e balcões antes e depois do 
trabalho de cada dia. 
* Efetuar o registro de análise, anotando o tipo de amostra, procedência, dia e hora de entrada 
no laboratório e qualquer outra observação prévia à análise. Na análise propriamente dita 
anotar: data, método, meio de cultura empregado e os resultados obtidos. 
* Identificar as amostras antes de iniciar a análise e, em geral, não descartar até obter os 
resultados. 
* O material a ser analisado deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estéreis e nunca 
com as mãos. 
* Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso (limpar a alça de semeadura, com exceção 
da alça calibrada, em areia e álcool antes de flambá-la). 
* Colocar todo material usado, tais como lâminas, lamínulas, pipetas, etc. em recipientes 
adequados com solução desinfetante. 
* Os cultivos, antes de terminada a análise, devem ser conservados na geladeira de material 
contaminado. 
* Os cultivos, após terminada a análise, devem ser colocados no descarte de materiais 
contaminados. 
* Nunca desprezar materiais contaminados na pia do laboratório. 
* Colocar todo o material contaminado em recipiente apropriado e descontaminar na autoclave 
antes de proceder a lavagem. 
* O material utilizado na prática microbiológica deve receber a seguinte sequência de 
tratamento: esterilização, lavagem, secagem, acondicionamento, esterilização, armazenamento. 
* Não retirar qualquer cultivo do laboratório. 
* Evitar salpicar bancadas e piso com água ou soluções corantes. 
* No caso de derrubar material contaminado em bancadas ou piso, cobrir com fenol 5 a 10%, 
recobrir com papel toalha e embeber novamente com fenol. Não esqueça de comunicar o 
professor ou técnico. 
* Seguir as normas de uso de equipamentos. 
 
Recomendações: 
A distância do assento, diante da bancada de trabalho, deverá ser regulada de modo que 
os antebraços do manipulador repousem facilmente sobre a bancada. Assim, o tremor das 
mãos, frequente no começo das atividades práticas, será grandemente reduzido. 
 
PROCEDIMENTOS NOS CASOS DE ACIDENTES 
* Comunicar ao professor ou técnico quando derramar ou quebrar tubos, frascos, pipetas, 
placas de Petri ou recipientes contendo micro-organismos patogênicos. 
* Um dos acidentes mais perigosos, devido à grande produção de aerossóis, é a quebra 
de tubos durante a centrifugação. A centrífuga não deve ser aberta até que se 
completem 30 minutos (tempo necessário para a sedimentação dos aerossóis). Recolher 
os cacos de vidro com uma pinça e desinfetar a centrífuga com álcool 70 %. 
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USO DO MICROSCÓPIO 
 
 
O microscópio é usado para visualizar estruturas ou células pequenas demais para serem vistas 
a olho nu. Devido ao fato de o microscópio ser um instrumento delicado e caro, cuidados 
especiais devem ser tomados no seu uso, limpeza e armazenamento. 
As partes de um microscópio são: 
1.Parafuso macrométrico: o controle que ajusta a posição das objetivas do microscópio; usado 
para focar inicialmente a lâmina. 
2.Parafuso micrométrico: o controle que ajusta a posição das objetivas; usado para o foco 
preciso do objeto depois de ter sido focado com o macrométrico. 
3.Charriot: o controle que ajusta a posição da lâmina. 
4.Condensador: aparelho localizado abaixo da platina do microscópio que direciona a luz para 
a objetiva se for baixado ou elevado. Baixando o condensador vai haver um aumento de 
espécimes não corados. 
5.Diafragma: aparelho que regula a quantidade de luz que chega ao espécime examinado no 
microscópio. 
6.Objetiva: lente de aumento que está mais próxima do objeto a ser examinado no microscópio. 
A objetiva pode ser (4x), (10x), (40x) e a objetiva de imersão a óleo (100x). 
7.Ocular: lente de aumento que está mais próxima do olho do examinador. O aumento usual é 
de 10 vezes (10x). 
8.Platina: local onde se coloca a lâmina. 
9.Revolver: local onde se inserem as objetivas. Deve ser utilizado quando for trocar de uma 
objetiva para outra. 
10.Braço: utilizado para o transporte do microscópio; 
Precauções: 
1. Use o ajuste macrométrico somente com objetivas de pequeno aumento. 
2. Use o óleo de imersão sempre e somente que usar a lente de imersão. 
4. Limpe as objetivas após o uso. 
5. Sempre baixar a luz antes de desligar o microscópio. 
6. Para carregar o microscópio, segure com uma mão o braço do microscópio e com outra 
a base. 
7. Evite vibrações e batidas no microscópio. 
8. Guarde o microscópio coberto com uma capa para protegê-lo do pó. 
 
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PRÁTICA: VIDRARIA, EQUIPAMENTOS E OUTROS MATERIAS UTILIZADOS 
NAS PRÁTICAS MICROBIOLÓGICAS 
 
1. VIDRARIA 
1. Alça de Drigalsky: distribuição de culturas líquidas sobre a placa de Petri. 
2. Lâmina escavada (lâmina de Koch): usada para reações de aglutinação e para 
observação de micro-organismos pela técnica da gota pendente. 
3. Pipetas Pasteur: transferência de líquidos. 
4. Pipetas volumétricas: medição e transferência de líquidos. Possui grande precisão. 
5. Pipetas graduadas (sorológicas ou de Mohr): medida e transferência de líquidos. 
6. Placas de Petri: acondicionamento de meios de cultivo. As mais usadas são as de 
7. tamanho 10 x 100 mm e 10 x 80 mm. 
8. Tubos de Durham. 
9. Tubos de ensaio: são apresentados nos tamanhos 13 x 100 mm, 16 x 150 mm, 18 x 
180mm que servirão para distribuição de volumes de 3, 5 e 10 mL, respectivamente. 
Os tubos podem possuir tampa de rosca ou não. 
 
2. EQUIPAMENTOS 
Os equipamentos utilizados no trabalho microbiológico variam de conformidade com 
a complexidade das atividades desenvolvidas no laboratório. A seguir, serão apresentados 
os equipamentos que podem ser encontrados em um laboratório de Microbiologia, bem 
como seu uso: 
1. Autoclave de Chamberland: utilizada para esterilização de soluções, meios de cultura, 
materiais contaminados e vidrarias. 
2. Câmara asséptica (cabine de fluxo laminar): manipulação de microrganismos; 
distribuição de meios de cultura. 
3. Contador de colônias: utilizado para contar as colônias que crescem em meios sólidos 
contidos em placas de Petri. 
4. Estufa bacteriológica – B.O.D. (35-37°C): incubação de culturas de microrganismos. 
Existem micro-organismos que requerem temperaturas diferentes, como 4, 25, 42 e 
45°C. 
5. Jarra de anaerobiose: usada para incubar meios de cultivos semeados com 
microrganismos que requerem tensão de CO2 para crescimento. 
 
3. MATERIAIS 
1. Ágar-ágar. 
2. Alça e agulha de semeadura (níquel-cromo ou platina): usadas para isolamento e 
3. semeadura de micro-organismos. Para uso em rotina, as alças e agulhas devem ser de 
fio n° 24 (Brown & Sharp 24 ou BS 24) e o comprimento deve ser de 45 a 50 mm. As 
alças devem ter um diâmetro interno de 3 mm. 
4. Álcool areia 
5. Meios de cultura desidratados ou prontos para uso: cultivo de microrganismos. 
6. Membranas filtrantes.6 
 
LAVAGEM E ACONDICIONAMENTO DE MATERIAIS 
 
1. INTRODUÇÃO 
A lavagem e esterilização de materiais são atividades de apoio aos vários processos de análises 
de laboratório, sendo definidas como a eliminação de resíduos orgânicos de proteínas e de 
produtos de metabolização dos componentes do meio de cultura, após o seu uso. É de 
fundamental importância a escolha dos detergentes, equipamentos e métodos empregados. Com 
a lavagem inadequada da vidraria poderão ficar restos de meios de cultura e metabólitos que 
irão interferir nos constituintes das soluções e meios de cultura e, consequentemente, nos 
resultados dos exames. Com o enxague inadequado, poderão permanecer resíduos de detergente 
na vidraria, que podem influenciar no crescimento dos micro-organismos. 
2. LAVAGEM MANUAL DE VIDRARIAS 
a) Tubos de Ensaio 
* Colocar os tubos, com as tampas de rosca afrouxadas, em caixa de aço inoxidável e 
autoclavar a 121°C, para a descontaminação. 
* Descartar os conteúdos dos tubos. 
* Se necessário, ferver os tubos com solução de detergente a 0,5%, para eliminar os 
resíduos de meios de cultivo. 
* Caso persistam resíduos, após a fervura, escovar a parte interna de cada tubo com o 
auxílio de um gaspilhão (escovinha). 
* Enxague 10 vezes em água corrente, enchendo e esvaziando totalmente os tubos. 
* Enxague uma vez em água destilada ou deionizada 
b) Placas de Petri 
* Após a descontaminação, por autoclavação, lavar individualmente cada uma das partes 
da placa (tampa e fundo) com o auxílio de uma esponja, para retirar marcas de lápis 
dermatográfico e resíduos do meio de cultura. 
* Enxaguar 10 vezes em água corrente, esfregando com as mãos as superfícies internas e 
externas de cada uma das partes das placas. Verificar se todos os resíduos foram 
eliminados. 
* Enxaguar uma vez cada uma das partes da placa em água destilada ou deionizada. 
c) Pipetas 
* Após a descontaminação por autoclavação, tomando cuidado para não quebrar o bocal, 
retirar o tampão de algodão (bucha) de cada pipeta através de vácuo ou estilete de ponta 
fina (palitos, agulha). 
* Colocar as pipetas em caixas contendo solução de detergente a 0,5 e ferver para eliminar 
os resíduos da parede. 
* Enxaguar 10 vezes em água corrente enchendo e esvaziando totalmente as pipetas. 
* Enxaguar uma vez em água destilada ou deionizada. 
d) Lâminas e lamínulas 
* Colocar o material em recipiente adequado e cobrir com solução de detergente 0,5 a 
1,0%. 
* Aquecer até a ebulição e manter a fervura por 5 a 10 minutos. 
* Enxaguar em água corrente até a retirada do detergente. 
* Enxaguar com água destilada. 
* Secar com o auxílio de um pano limpo e macio (gaze). 
* Desprezar as lâminas e lamínulas que estiverem muito riscadas ou foscas. 
* Lavagem com "solução" sulfo-crômica 
Esta lavagem se faz necessária quando a vidraria apresenta resíduos que resistiram à lavagem 
com detergente. 
O procedimento a seguir é: 
* Adicionar 50 mL de "solução" sulfocrômica no frasco a ser lavado. 
* Agitar com os devidos cuidados de cinco a seis vezes. 
* Com o auxílio de um funil transferir a "solução" sulfo-crômica usada para o próximo frasco 
a ser lavado. 
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* Este procedimento poderá ser repetido, sem descarte da "solução", para a lavagem de, no 
máximo, 10 frascos. 
* Enxaguar 10 vezes em água corrente, enchendo e esvaziando totalmente os frascos. 
* Enxaguar uma vez em água destilada ou deionizada, realizando medidas de pH da água 
destilada ou deionizada antes e depois do enxague (de preferência deixar o frasco em 
teste com água destilada durante a noite e após realizar a medida de pH em potenciômetro 
(pHmetro). 
3. SECAGEM 
Deixar escorrer toda a água e colocar a vidraria na posição emborcada na estufa de secagem a 
100° C por 1 hora. 
4. ACONDICIONAMENTO 
Todo material utilizado no trabalho microbiológico deve ser perfeitamente limpo e também 
estéril. Para ser esterilizado, o material deve ser acondicionado. 
A vidraria, após cuidadosa lavagem e secagem, é acondicionada com papel (kraft, tigre, etc.) e 
esterilizada em autoclave a 121°C por 15 minutos ou em forno de Pasteur a 160°C por 2 horas. 
Os materiais devem ser acondicionados utilizando-se os métodos: 
* A boca de toda a vidraria como tubos, garrafas, balões e erlenmeyers é fechada com 
tampões de algodão (buchas), que não devem ser folgados ou demasiadamente apertados. 
* As garrafas, erlenmeyers, balões de fundo chato, etc. além da bucha de algodão, levam 
também um invólucro de papel, o qual é amarrado com barbante ou fita crepe. 
* Os tubos de ensaio, depois de fechados com as buchas de algodão, são empacotados. O 
número de tubos depende da necessidade de uso do laboratório. 
* As placas de Petri são embrulhadas individualmente ou em número de 2, 5, 10, etc., 
conforme a demanda de uso. Os pacotes são fixados com barbante ou fita crepe. 
* Pipetas são embuchadas na extremidade destinada a aspiração, com pequena bucha de 
algodão colocada com o auxílio de uma agulha ou estilete, sendo então, totalmente envolta em 
papel de embrulho. Elas também podem ser acondicionadas em pacotes de papel (conjunto de 
5, 10 e 20) ou em cilindros de aço inoxidável especialmente fabricado 
para este propósito. A bucha não permite a penetração de micro-organismos que poderiam 
contaminar os líquidos e protegem o operador de líquidos contaminados. 
* Os swabs (cotonetes ou zaragatoa) devem ser recobertos com papel alumínio e embaladas em 
pacotes de papel (com marcas que identifiquem o local onde está o cabo 
do swab) ou colocados em frascos autoclaváveis que devem ser embuchados e envolvidos 
parcialmente em papel. 
 
 
 
 
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ROTEIRO DO DESENVOLVIMENTO DA PRÁTICA: 
 
a) Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%. 
b) Lavar as mãos. 
 
Individual: 
c) Produzir 2 buchas para tubos de ensaio, utilizando algodão, gaze e barbante; 
d) Acondicionar 1 pipeta sorológica (1, 2, 5 e 10 mL): Acondicionar individualmente cada 
pipeta utilizando papel kraft. Amarrar com barbante ou fita crepe e anotar o volume da pipeta. 
e) Embuchar, conforme orientação do professor, 2 tubos de ensaio; 
d) Produzir um swab (zaragatoa); 
 
Dupla: 
f) Acondicionar os quatro tubos de ensaio embuchados em pacotes, utilizando papel kraft; 
g) Acondicionar três placas de Petri (tampa para baixo); 
Dicas para acondicionar: 
Não esqueça de identificar o material e colocar a data. 
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PRÁTICA: PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 
Os meios de transporte são empregados com a finalidade de manter a amostra viável para a 
realização da análise microbiológica quando não é possível executar a cultura imediatamente 
após a coleta do material. 
Os meios de cultura, por definição, destinam-se ao cultivo artificial de microrganismos e 
podem, de uma maneira geral, ser classificados de acordo com suas características e ou 
aplicações. 
 
Em relação à procedência, os meios de transporte e cultura podem ser: 
- Naturais: são aqueles que não sofrem alteração na sua composição. Ex. batata, 
cenoura, leite, suco de laranja, etc. 
- Artificiais: são preparados pela mistura de diversas substâncias. Ex. ágar 
simples, ágar chocolate, ágar Mueller Hinton, MacConkey, etc. 
 
Em relação à consistência, os meios podem ser classificados em: 
- Líquidos: não contêm ágar. 
- Semi-sólidos: Contém de 0,3-0,5% de ágar. 
- Sólidos: Geralmente contém de 1,3 a 2% de ágar. 
 
Em relação aos componentes da fórmula, os meios podem ser classificados em: 
- Sintéticos: aqueles cuja composição química é conhecida quantitativamente. 
- Complexos ou indefinidos: aqueles em que não se conhece a composição exata 
dos seus ingredientes. É conhecida suacomposição química qualitativamente. 
- Transporte: possui a finalidade de manter mais ou menos estável a população 
microbiana presente na amostra. Meio que não contém fontes de carbono e de nitrogênio. 
Isto faz com que as bactérias permaneçam viáveis, mas não podem multiplicar-se. 
- Simples: destinados ao cultivo de microrganismos pouco exigentes ou servem de 
base para outros meios de cultura. 
- Enriquecidos: meios de composição simples adicionados de substâncias muito 
nutritivas que melhoram o seu valor nutritivo e que muitas vezes podem privilegiar o 
crescimento de determinado grupo de bactérias. 
- Diferenciais: meios que permitem, através da visualização macroscópica, a 
diferenciação de microrganismos com características fisiológicas diferentes. 
- Seletivos: são meios que contém substâncias inibidoras para determinados grupos 
microbianos, com finalidade de permitir a dominância absoluta e o crescimento muito mais 
rápido do micro-organismo que se deseja isolar. 
 
As principais substâncias que inibem grupos de bactérias são: 
- Corantes: azul de metileno, cristal violeta, verde brilhante, vermelho neutro: inibem os gram-
positivos. 
- Citratos: inibem o grupo coliforme. 
- Sais biliares (desoxicolato de sódio): inibem os gram-positivos. 
- Azida sódica: inibem bacilos gram-negativos. 
As principais substâncias que servem como indicadores são: 
- Tiossulfato de sódio: fornece enxofre para a produção de ácido su1fidrico (H2S). 
- Sais de ferro: serve como indicador para verificar a produção de H2S. O H2S formado reage 
com o ferro formando sulfeto ferroso que se precipita (cor negra). 
 
 
 
 
 
 
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Preparo de meio de cultura para utilizar nas aulas práticas: 
Grupo 1 
Meio sólido 
MUELLER HINTON AGAR (MHA) 
Ágar Mueller Hinton é um meio de cultura, recomendado para a realização de antibiograma (teste de 
sensibilidade) pela técnica de difusão de discos segundo o CLSI. Possui uma substancial fonte de 
proteínas e carboidratos que proporcionam o desenvolvimento e crescimento de cepas bacterianas de 
interesse clínico. Além disso, a baixa concentração de timina e timidina e níveis adequados de Cálcio e 
Magnésio, evitam falsos resultados de sensibilidade ou resistência. 
Composição: 
Peptona de caseína 17,5 g/L Peptona de carne 2,0 g/L Amido 1,5 g/L Ágar 17,0 g/L Água destilada q.s.p. 
pH final 7,3 ± 0,1 
Aparência do meio desidratado: pó âmbar levemente opalescente. 
Materiais: 
1. Meio de cultura Mueller Hinton agar; 
2. Balança; 
3. Microondas; 
4. Papel alumínio; 
5. Espátula; 
6. Erlenmeyer; 
7. Bucha; 
8. Água Destilada; 
 
Procedimento: 
1. Pesar 30g de pó e transferir para um Erlenmeyer e dissolver em 1litro de água destilada; 
2. Aquecer até ferver e misturar; 
3. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos; 
4. Distribuir em câmara de fluxo laminar para placas de Petri. 
5. para um erlenmeyer 
 
Grupo 2 
Meio Líquido 
CALDO TRIPTICASEÍNA DE SOJA (Tryptic Soy Broth - TSB) 
Materiais: 
1. Meio de cultura; 
2. Balança; 
3. Microondas; 
4. Papel alumínio; 
5. Espátula; 
6. Béquer; 
7. Tubos de ensaio com bucha; 
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8. Água Destilada; 
9. Pera; 
 
Aparência do meio: desidratado: pó bege claro, preparado: âmbar claro, brilhante e 
transparente. 
Materiais: 
Procedimento: 
1. Pesar 30g de pó e transferir para um béquer e dissolver em 1litro de água destilada; 
2. Aquecer até ferver e misturar; 
3. Utilizando a pera, transferir 10 mL para tubo com bucha; 
4. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos; 
 
 
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PRÁTICA: ESTERILIZAÇÃO 
 
Os microrganismos estão amplamente distribuídos em nosso ambiente: no ar, no solo, nas 
águas, nas superfícies externas e internas do organismo humano, dos animais e vegetais. Assim 
sendo, o estudo sistemático de um microrganismo, procedimentos médicos (como uma 
cirurgia), a preparação e preservação de alimentos, e muitas outras situações requerem métodos 
que permitam a destruição ou a remoção dos microrganismos indesejáveis. 
1. Controle de micro-organismos 
Os microrganismos podem ser removidos, inibidos ou mortos por agentes físicos ou químicos 
através de uma grande variedade de técnicas cada uma com seu mecanismo de ação e tendo seu 
limite próprio de aplicação prática. Entretanto, antes de discutir tais processos, convém 
compreender alguns termos empregados para conceituar os agentes físicos e químicos 
destinados ao controle dos micro-organismos. 
a) Assepsia: é o conjunto de processos utilizados para impedir a penetração de microrganismos 
em local que não os contenha. 
b) Esterilização: é o processo de destruição de todas as formas de vida microscópica, ou seja, 
destruição de todos os microrganismos presentes em um determinado material. É obtida pela 
utilização de agentes físicos, agentes químicos e, no caso de líquidos termolábeis, pelo processo 
da filtração. Um objeto é considerado esterilizado quando a probabilidade de se detectar um 
microrganismo vivo, após a esterilização deste material, é infinitamente pequena, ou seja, 
menor do que um para um milhão. 
c) Desinfecção: é o processo de destruição dos agentes infecciosos, através de um desinfetante 
definido como um agente, geralmente químico, que mata as formas vegetativas, mas não as 
formas esporuladas, de microrganismos patogênicos. O termo é comumente utilizado para as 
substâncias aplicadas em objetos inanimados. 
d) Antisséptico: é uma substância que se opõe à "sépsis" ou previne o crescimento ou ação de 
microrganismos pela destruição dos mesmos ou pela inibição de seu crescimento ou atividade. 
Usualmente está associado a substâncias aplicadas ao corpo do homem, isto é, tecidos vivos, 
por exemplo: antissepsia da pele e feridas com álcool 70%. 
e) Degermação: é a redução do número de microrganismos da pele pelo uso de sabão e 
escovação ou aplicação de sabão ou solução contento antisséptico. 
f) Bactericida: é um agente que mata as bactérias. Os termos fungicida, virucida e esporicida se 
referem aos agentes que matam respectivamente, fungos, vírus e esporos. 
g) Bacteriostase: é uma condição na qual se previne o crescimento de bactérias (adjetivo: 
bacteriostático). De maneira semelhante, fungistático descreve o agente que inibe o 
desenvolvimento dos fungos. Aqueles agentes que tem, em comum, a capacidade de inibir o 
crescimento de micro-organismos, são designados, coletivamente como agentes 
microbiostáticos. 
h) Agente antimicrobiano: é aquele que interfere com o crescimento ou atividade dos 
microrganismos. Na linguagem comum, o termo significa inibição do crescimento e, de acordo 
com os tipos de microrganismos sobre os quais agem, recebem a designação de antibacterianos 
ou antifúngicos. 
2. Esterilização e desinfecção em laboratório de microbiologia 
Agentes Físicos: Os processos físicos são geralmente empregados para a esterilização de 
vidraria, materiais em geral, meios de cultura e soluções. Os mais comuns são o calor seco, 
calor úmido e filtração. 
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a) Calor Seco. Destrói os microrganismos por oxidação de seus constituintes químicos. A 
esterilização pelo calor seco é realizada em estufas especiais denominadas de Forno Pasteur. O 
Forno de Pasteur é uma estufa elétrica e consiste de uma câmara dotada de um elemento 
aquecedor elétrico (resistência) que aquece a câmara e seu conteúdo. Além disso, existe um 
ventilador, um termostato que regula a temperatura desejada, e um orifício na parte superior 
que permite a colocação de um termômetro. Promove o aquecimento rápido, controlado e 
uniforme da câmara. Os artigos nela colocados são aquecidos por irradiação do calor, das 
paredes laterais e da base, cuja distribuição deve ser a mais uniforme possível. Sendo ocalor 
seco menos penetrante do que o úmido, o processo requer temperaturas mais elevadas e tempo 
de exposição mais prolongado, geralmente em torno de 140 e 180°C durante 1 a 3 horas. Este 
é o processo indicado para esterilizar vidraria, instrumento de corte ou de ponta, passíveis de 
serem oxidados pelo vapor, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos. Os 
materiais são efetivamente esterilizados quando tratados por uma das várias combinações de 
temperatura-tempo de eficácia comprovada (Quadro 1). 
Quadro 1 - Combinações de tempo e temperatura para esterilização em Forno Pasteur. * 
b) Flambagem. Constitui um processo no qual os instrumentos são expostos à chama do bico 
de Bunsen até se tornarem rubros. Geralmente é utilizada para a esterilização de alças e agulhas 
de semeadura. 
c) Calor Úmido. Representa o processo mais prático e seguro para fins de esterilização. O calor 
úmido, sob a forma de vapor d’água saturado sob pressão, é o mais prático e eficiente agente 
de esterilização, proporcionando temperaturas mais elevadas que as obtidas por ebulição, e 
assim os micro-organismos são destruídos pela coagulação de suas proteínas. 
Este processo é empregado principalmente para a descontaminação de materiais (para descarte 
ou reutilização) e esterilização de soluções, meios de cultura, vidrarias em geral e outros 
materiais termo resistentes e que não sejam afetados pela umidade. O equipamento que produz 
estas condições é chamado de autoclave. O funcionamento da autoclave é baseado no princípio 
da marmita de Papin, em que a água aquecida em recipiente fechado onde o vapor fica retido 
sobre pressão, pode atingir temperaturas superiores a 100°C, sem ferver. A autoclave de 
Chamberland é um recipiente (caldeira) cilíndrico metálico horizontal ou vertical, de parede 
resistente, fechada na parte superior com uma tampa pesada, preferencialmente de bronze, a 
qual é parafusada ou apertada sob uma vedação (guarnição) de borracha e parafusos 
(manipuladores) de fixação. A tampa veda perfeitamente. Compõem ainda o equipamento um 
manômetro e uma válvula de segurança onde se pode fazer o ajuste de pressão e temperatura 
correspondente. No interior da caldeira existe um suporte (cruzeta) sobre a qual se coloca uma 
cesta metálica de superfície perfurada (para permitir a passagem do vapor), contendo o material 
a ser esterilizado. Entre a cruzeta e o fundo da autoclave existe um espaço onde estão localizadas 
resistências elétricas protegidas por material isolantes. Neste espaço é colocada a água que será 
aquecida. A água, de preferência destilada, é aquecida dentro do cilindro pelo emprego de 
resistências elétricas de imersão. O nível da água de dentro do cilindro deve ser examinado a 
cada operação e deve sempre estar acima das resistências. O cilindro da autoclave é provido de 
uma saída lateral com válvulas, que serve para esgotar a água, quando necessário efetuar 
eventuais limpezas. 
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- Operação: (a) abrir a tampa da autoclave e colocar água na caldeira até quase atingir a cruzeta 
(um dedo abaixo); (b) introduzir o cesto metálico contendo o material a ser esterilizado; (c) 
fechar a tampa, apertando por igual os manipuladores; (d) ligar o aparelho na rede elétrica e 
ligar a chave no máximo da intensidade; (e) abrir o registro do orifício do escapamento (deixar 
aberta a torneira de remoção de ar ou vapor para remover todo o ar); a princípio, há expulsão 
do ar contido na caldeira. Quando a água começa a ferver, sai um jato intermitente de ar 
misturado com vapor de água. Quando todo o ar residual é expulso do aparelho, começa a sair 
um jato contínuo de vapor de água. Deixe que o fluxo de vapor fluente persista por cerca de 5 
minutos; (f) fechar o registro do orifício de escapamento. O manômetro começa a acusar o 
aumento de pressão; (g) ao atingir a temperatura de 121°C (1 atmosfera de pressão), diminuir 
a intensidade de calor girando a chave elétrica para a posição média ou mínima, de forma que 
a pressão permaneça estável; (h) quando a temperatura requerida para a esterilização é 
alcançada, conta-se o tempo (15 a 20 minutos) usando um relógio de laboratório (com alarme); 
(i) desligar a chave elétrica girando-a para a posição desligado; (j) manter a autoclave e a 
torneira de ar e vapor fechada e aguardar que a pressão retome a zero atmosfera, pois quando a 
pressão da autoclave é aliviada rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e frascos fervem 
violentamente, fazendo com que os tampões sejam arremessados para fora dos mesmos; (k) 
abrir o registro do orifício de escapamento para equalizar a pressão da autoclave com a do 
ambiente; (l) com auxílio de luvas de amianto, de cano longo, afrouxar os manipuladores; (m) 
abrir a tampa da autoclave com cuidado. Proteger o rosto contra a projeção de vapor; (n) retirar 
o cesto com o material esterilizado. Obs: Para regular a válvula de segurança, deslocar o contra-
peso para frente ou para trás, de maneira a estabilizar a pressão desejada, observando-se o limite 
de até 1,5 atmosferas. A água da caldeira após a esterilização de material contaminado deve ser 
drenada através da válvula de drenagem. 
d) Filtração. A esterilização de gases ou de líquidos pode ser efetuada por meio de filtração, 
através de materiais capazes de reter microrganismos. 
 
15 
 
 
PRÁTICA: ESTERILIZAÇÃO POR AGENTE FISICO 
CALOR SECO FLAMBAGEM 
Materiais 
1. Bico de Bunsen 
2. Alca de semeadura 
3. Álcool areia 
4. Tubo contendo solução; 
Procedimento 
1. Ligar o Bico de Bunsen e aprender a regular a chama: a chama deve ser azul, mais 
quente que a laranja; 
2. Realizar a flambagem da alça de semeadura: Flambar até o rubro com ângulo de 45°C 
em relação a bancada; 
3. Passar a alça no tubo contendo solução 
4. Passar no álcool areia, antes de flambar novamente; 
5. Utilizar o álcool areia: antes de flambar evitando formação de aerossóis; 
 
 
 
16 
 
PRÁTICA: HIGIENIZAÇÃO E CONTROLE DA MICROBIOTA DAS MÃOS 
 
As mãos constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infecção cruzada. A 
quantidade de micro-organismos constituintes da microbiota normal da pele da equipe de saúde 
deve ser reduzida, assim como possíveis micro-organismos patogênicos presentes devem ser 
eliminados. 
A finalidade da técnica básica de higienização das mãos é remover os microrganismos 
que colonizam as camadas superficiais da pele, assim como o suor, a oleosidade e as células 
mortas, retirando a sujidade propícia à permanência e à proliferação de micro-organismos. 
 
1. Técnica básica de higienização das mãos: 
- Remova todas as joias e adornos. 
- Abra a torneira e molhe as mãos, evitando encostar na pia. 
- Aplique na palma da mão quantidade suficiente de sabonete líquido para cobrir toda 
a superfície das mãos (seguir a quantidade recomendada pelo fabricante). 
- Ensaboe as palmas das mãos, friccionando-as entre si. 
 
- Esfregue a palma da mão direita contra o dorso da mão esquerda (e vice-versa) entrelaçando 
os dedos. 
 
- Entrelace os dedos e friccione os espaços interdigitais. 
17 
 
 
- Esfregue o dorso dos dedos de uma mão com a palma da mão oposta (e vice-versa), segurando 
os dedos, com movimento de vai-e-vem. 
 
- Esfregue o polegar direito, com o auxílio da palma da mão esquerda (e vice-versa), utilizando 
movimento circular. 
 
- Friccione as polpas digitais e unhas da mão esquerda contra a palma da mão direita, fechada 
em concha (e vice-versa), fazendo movimento circular. 
 
- Esfregue o punho esquerdo, com o auxílio da palma da mão direita (e vice-versa), utilizando 
movimento circular. 
 
- Enxágue as mãos, retirando os resíduos de sabonete. Evite contato direto das mãos ensaboadas 
com a torneira.- Seque as mãos com papel-toalha descartável, iniciando pelas mãos e seguindo pelos punhos. 
 
18 
 
Anotações sobre a prática: 
 
19 
 
PRÁTICA: MANIPULAÇÃO ASSEPTICA 
Técnica de manipulação asséptica 
Introdução: 
1. Área contaminada: Esta denominação é dada ao local onde se manipulam materiais que 
contenham ou possam conter microrganismos patogênicos ou potencialmente 
patogênicos. 
2. Conceitos importantes: 
Assepsia 
Limpeza 
Desinfecção 
Antissepsia 
Esterilização 
 
Materiais: 
Etapa 1 
Placas de Petri 
Etapa 2 
1. Um tubo de 20 ml, contendo 10 ml de TSB (Caldo de tripticaseína de soja- (Tryptic 
Soy Broth) autoclavado; 
2. Três tubos de 13/100 esterilizados; 
3. Grade; 
4. Pipeta com algodão embalada e autoclavada; 
5. Bico de Bunsen. 
 
Metodologia: 
Etapa 1 
Treinar o uso da placa de Petri 
Etapa 2 
1. Fazer a desinfecção da bancada (álcool 70% e papel toalha, limpar em sentido 
unidirecional); 
2. Lavar as mãos; 
3. Enumerar os tubos de 13/100 e identificar com suas iniciais; 
4. Ligar o bico de Bunsen e ajustar a chama; 
5. Atrás da chama abrir a pipeta, verificar o volume da mesma; 
6. A partir de um tubo de 20 ml de capacidade contendo 10 ml de TSB, previamente 
esterilizado, transferir assepticamente utilizando a pipeta 5 ml para o tubo de ensaio 1. 
• Cada vez que abrir e antes de fechar os tubos atrás da chama passar rapidamente na 
chama; 
7. Na sequência, transferir 3 ml do tubo 1 para o tubo 2; 
8. Na sequência, transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3; 
9. Incubar os 4 tubos em estufa 35-37°C por 24 horas. 
10. Fazer a leitura de turbidez e preencher o relatório. 
11. Fazer a desinfecção da bancada com álcool 70% e papel toalha, unidirecional. 
12. Lavar as mãos; 
 
20 
 
Esquema da transferência do TBS para os tubos: 
 
 
 
 
 
 
 
Resultados do teste de manipulação asséptica 
 
TUBOS LIMPIDO TURVO 
A 
1 
2 
3 
Considerações: 
1. Por que não contaminamos as soluções se pipetamos com a boca? 
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________ 
2. Qual a função da chama? 
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________ 
3. Qual a função da desinfecção? 
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________ 
 
4. Qual a função da esterilização? 
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________ 
5. Qual a função da assepsia? 
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________ 
6. Os tubos estavam límpidos os turvos, caso estejam turvos, qual momento do manuseio 
pode ter ocorrido a contaminação? 
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________ 
21 
 
PRÁTICA: COLORAÇÃO DE GRAM 
 
Introdução: 
O método de Gram se baseia no fato de que o complexo formado entre o iodo (lugol) e a violeta 
de genciana (“complexo iodo-pararosa-anilina”) permanece retido dentro da célula de algumas 
bactérias mesmo após o tratamento subsequente com o álcool (“agente descorante”). Estas 
bactérias são denominadas gram-positivas ou que tomam o Gram. 
Outras bactérias chamadas gram-negativas ou que não tomam o Gram descoram facilmente 
pelo álcool. Entretanto, se após a ação do álcool, se efetuar uma coloração de fundo utilizando-
se a fucsina básica, as bactérias gram-negativas aparecerão coradas em vermelho, ao passo que 
as gram-positivas se apresentarão roxas, isto é, conservarão a cor violeta do complexo iodo-
violeta de genciana. 
O mecanismo da coloração de Gram não está ainda bem definido, porém se relaciona 
indubitavelmente a diferenças de permeabilidade da parede celular. Nas bactérias gram-
positivas, a parede é constituída essencialmente por um componente mucopeptídico e o 
tratamento com álcool resulta em uma desidratação e consequente diminuição da 
permeabilidade, o que impede ou dificulta a eluição do complexo iodo-corante. O mesmo não 
acontece nas bactérias gram-negativas, nas quais o solvente orgânico atua em sentido contrário, 
determinando aumento de permeabilidade celular. 
A coloração de Gram é de elevada importância para a sistemática em bacteriologia, pois divide 
as bactérias em dois grandes grupos: GRAM-POSITIVAS e GRAM-NEGATIVAS, que 
reagem diferentemente frente a muitos agentes físicos e químicos. 
 
Objetivo: 
Diferenciar bactérias Gram-Positivas e Negativas pelo método de Gram. 
 
PREPARO DOS CORANTES 
1. CRISTAL VIOLETA FENICADO (segundo Nicolle): 
Fórmula: 
Cristal violeta 1,0 g 
Álcool a 95° GL 10,0 mL 
Fenol fundido 2,0 g 
Água destilada 100 mL 
Fenol fundido: para manter o fenol fundido, dissolver em banho-maria a 50-60°C e adicionar 
10% de água destilada. 
Preparo: triturar o cristal violeta em um gral. Adicionar o álcool, homogeneizar. Juntar o fenol 
fundido. Acrescentar aproximadamente 50 mL de água destilada, misturar e transferir para um 
frasco âmbar de rolha esmerilhada. Lavar o gral 2 a 3 vezes com o restante de água destilada. 
Deixar em repouso durante 24 horas. Filtrar em papel ou algodão para outro frasco âmbar de 
rolha esmerilhada. Estocar. 
NOTA: Quando da transferência do corante em estoque para frascos conta-gotas, filtrar 
22 
 
novamente com papel de filtro ou algodão. 
2 MORDENTE (solução de lugol) 
Fórmula: 
Iodo 1,0 g 
Iodeto de potássio 2,0 g 
Água destilada 300 mL 
Preparo: triturar o iodo com iodeto de potássio em um gral. Adicionar aos poucos a água 
destilada. Misturar bem. Filtrar e estocar em frasco âmbar de rolha esmerilhada. 
 
3 AGENTE DESCORANTE (álcool-cetona) 
Usar apenas solventes P.A. podendo-se empregar o álcool etílico 95° à mistura de 
álcool-cetona (1:1); ou a de éter-cetona na proporção de (1:3). 
 
4 CORANTE DE FUNDO (FUCSINA BÁSICA) 
Preparo: diluir a fucsina de Ziehl (ver método de coloração de Ziehl) 1:10 em água destilada. 
Filtrar em papel ou algodão e estocar em frasco âmbar de rolha esmerilhada. 
 
Materiais: 
• Alça de platina; 
• Lâmina de vidro; 
• Placas de petri com cultura de microrganismos (Staphylococcus aureus e Escherichia 
coli). 
• Tubo de ensaio com solução salina; 
• Grade; 
• Crista violeta a 1%; 
• Lugol; 
• Fucsina Básica 
• Luvas 
 
Metodologia: 
Preparo do Esfregaço: 
1. Flambar a alça corretamente; 
2. Esfriar a mesma na parede do tubo contendo solução salina; 
3. Mergulhar a alça na solução salina, inclinando o tubo e transferindo para a lâmina de 
vidro em posição central da mesma, está deve ser mantida em cima da grade atrás da 
chama; 
4. Com a alça coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano; 
5. Homogeneizar este material com a solução salina, espalhando iniciando no centro da 
gota e distribuindo em formato de caracol, delicadamente; 
6. Secar a lâmina, mantendo a mesma em cima da grade, próxima a chama; 
7. Passar a alça no álcool areia, antes de flambar. 
23 
 
 
Técnica da Coloração: 
1. Na cuba de coloração: 
2. Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto; 
3. Somente escorrer o corante (sem lavar); 
4. Lugol por 1 minuto; 
5. Escorrer o lugol; 
6. Descorar rapidamente com álcool/acetona; 
7. Lavar com água destilada; 
8. Fucsina por 30 segundos; 
9. Lavar com água destilada; 
10. Deixar secar, paraobservar e esquematizar os M.O da lâmina; 
11. Fazer a leitura ao microscópio com objetiva de imersão. Observar: 
Cor (vermelha ou roxa); 
Forma (cocos ou bacilos); 
Arranjo (diplococos, estreptococos, estafilococos ou diplobacilos, estreptobacilos); 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
PRATICA: ANTIBIOGRAMA 
Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA): Teste de Kirby Bauer 
1. Disco de difusão; 
2. Teste Qualitativo; 
3. Meio Mueller Hinton Agar (MHA); 
Introdução: 
Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a suscetibilidade de 
bactérias aos antimicrobianos. Estes testes são utilizados para avaliar in vitro a atividade de 
novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. A 
suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, 
intermediário ou resistente ou quantitativamente em termos de MIC (minimum inhibitory 
concentration) ou MBC (minimum bactridal concentration). 
A realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) é uma das principais tarefas 
executadas pelo laboratório de microbiologia. Além de orientar a escolha da terapia 
antimicrobiana mais adequada, o TSA representa uma importante ferramenta no monitoramento 
da evolução da resistência bacteriana e age também como um método auxiliar na implantação 
de medidas de controle que evitem a disseminação de bactérias multirresistentes. 
Objetivos: 
Analisar pelo método de difusão a resistência de Escherichia coli a alguns antibióticos. 
Materiais: 
1. Tubo pequeno contendo salina(fisiológica) autoclavada; 
2. Tubo grande contendo meio de cultura líquida com microrganismo E.coli: 
3. Alça bacteriológica; 
4. Grade; 
5. Placa de petri contendo MHA; 
6. Frasco contendo discos de antibióticos, conservados em geladeira; 
7. Pinça; 
8. Régua; 
9. Luvas; 
10. Swab; 
11. Luvas; 
 
Procedimento: 
1. Padronizar um inóculo de microrganismo de acordo com a escala (turvação) de 0,5 de Mac 
Farland; 
2. Transferir alçadas (aproximadamente 10) do tubo contendo o microrganismo para o tubo 
contendo a salina, até observar a turvação da escala; 
3. Semear o inóculo padronizado com auxílio de um swab estéril; Dica, retirar o excesso de 
líquido comprimindo o swab na parede do tubo, semear com o swab deitado para não rasgar 
o meio e fazer as estrias: 1, 2, 3 
 
 
 
25 
 
 
 
4. Aplicar os discos antimicrobianos (Dica entre eles 2 cm e da borda 1,5 cm), com pinça 
flambada e resfriada, fazendo leve pressão para que o mesmo fixe no meio de cultura; 
5. Identificar com suas iniciais na borda na placa, não na tampa, relembrando que sempre a 
tampa que fica voltada para baixo; 
6. Incubar em estufa a 37° por 16 a 24 horas; 
7. Medir os halos formados (em mm) registrar os dados e relacionar com a tabela abaixo: 
 
Bactéria Discos com antibióticos 
Escherichia 
coli 
 
Leitura 
(mm) 
 
 
 
Padrões R ≤10 
S ≥ 13 
R ≤ 13 
S ≥17 
R ≤ 12 
S ≥15 
R ≤ 16 
S ≥20 
R ≤ 12 
S ≥ 17 
R ≤ 11 
S ≥ 15 
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo5/intro
ducao.htm 
 
Interpretação: 
Dicas para correta interpretação: 
Medir o diâmetro do halo em mm para comparar com os padrões citados na tabela se o 
microrganismo é Sensível, Resistente ou Intermediário. 
Os halos devem ser medidos em todas as direções para verificar o tamanho exato. 
O que é um antibiograma e qual sua utilidade? 
Dos antibióticos testados acima qual seria o indicado para o tratamento da infecção causada por 
este microrganismo. Justifique. 
 
26 
 
PRÁTICA: TÉCNICAS DE SEMEADURA 
 
Introdução: 
1. Considerações gerais sobre cultura pura: Um pré-requisito para a caracterização de 
uma espécie microbiana no laboratório de microbiologia é que ela esteja disponível para estudo 
como uma cultura pura. O termo cultura pura quer dizer que todas as células da cultura têm 
uma origem comum, isto é, são descendentes da mesma célula. É possível obter uma cultura 
pura através da transferência de uma célula para um meio de cultura adequado, através do uso 
de micromanipulador acoplado a um microscópio. Entretanto, na prática microbiológica são 
empregados métodos indiretos para a obtenção de culturas puras, baseados em técnicas de 
isolamento de colônias, como por exemplo: (1) Técnicas de esgotamento por estrias contínuas 
ou descontínuas, na superfície do ágar nutriente; (2) Diluição e semeadura por técnica de "pour 
plate" ou de semeadura em superfície de ágar nutriente. Em termos práticos, considera-se que 
a população microbiana de uma colônia é proveniente de uma única célula e, portanto, 
representa uma cultura pura. Na realidade, neste caso, o termo cultura axênica pode ser mais 
apropriado do que cultura pura porque cultura axênica significa o crescimento de um 
microrganismo em um ambiente livre de outros organismos. Essencialmente, o termo cultura 
pura implica em pureza genética enquanto que cultura axênica não. A maioria dos trabalhos 
práticos no laboratório de microbiologia é realizada a partir de culturas puras, isto é, populações 
microbianas provenientes de uma única célula. Cabe ao bacteriologista então, usar técnicas 
adequadas a fim de isolar um determinado microrganismo em cultura pura a partir de materiais 
que contém uma microbiota mista de microrganismos, como por exemplo: os alimentos, água, 
espécimes biológicos e outros, considerando-se naturalmente a especialidade da rotina mantida 
pelo laboratório. 
2. Formação e crescimento de colônias: Quando uma bactéria isolada se reproduz dentro de 
um meio solidificado ou na sua superfície, sua progênie vai se acumulando na forma de uma 
massa de células conhecida como colônia, visível macroscopicamente. Inicialmente o 
crescimento da colônia é exponencial em relação ao tempo. Após algumas divisões, entretanto, 
a ordem de crescimento se torna mais complexa devido à grande proximidade das células 
acumuladas. Esta proximidade cria uma situação, que pode ser chamada de “aglomeração 
fisiológica”, na qual as células individuais competem entre si pelos nutrientes disponíveis e 
afetam-se mutuamente pelo acúmulo localizado de produtos residuais. Como os nutrientes 
precisam se difundir do meio circundante para as células, enquanto os produtos residuais do 
metabolismo devem se difundir das células para o ambiente, os membros individuais das 
colônias ficam sujeitos a uma variedade de condições ambientais, segundo sua localização 
dentro da colônia. O crescimento de colônias bacterianas é afetado, não só pelas interações 
celulares dentro de cada colônia, mas também por interações com colônias vizinhas. Se as 
colônias estiverem muito próximas, elas interferem com o crescimento uma das outras pela 
depleção de nutrientes do meio ou pela excreção de produtos residuais tóxicos. O fenômeno é 
comumente observado em “placas semeadas por estrias” em ágar nutriente, para isolamento de 
bactérias. Nestas placas, as colônias que estão juntas são pequenas, enquanto aquelas que se 
encontram bem isoladas atingem tamanhos maiores. 
3. Manutenção e estoque de culturas puras: Após a obtenção das culturas puras, faz-se 
necessário em alguns casos, o seu estoque em laboratório, para estudos posteriores. É essencial 
que o método de conservação e manutenção preserve todas as características da espécie, tais 
como foram evidenciadas no momento do seu isolamento. No laboratório, dispõem-se das 
seguintes técnicas para a estocagem de culturas puras: 
a) Transferência periódica para meios de culturas novos (recém preparados); 
b) Conservação das culturas sob camada de óleo mineral; 
c) Conservação das culturas pela dessecaçãorápida em estado congelado (Liofilização); 
d) Estocagem em temperaturas muito baixas como, por exemplo: freezer (-70°C) e em 
nitrogênio líquido (-196°C). 
27 
 
Existem organizações que mantêm em estoque culturas puras de amostras tipos (padrões 
internacionais) de bactérias, fungos, vírus, algas, protozoários, bem como de células animais. 
Algumas dessas organizações são: (1) American Type Culture Collection (ATCC) em 
Rockville - Maryland; (2) Instituto Pasteur de Paris; (3) National Collection of Type Culture 
(NCTC) em Londres; (4) Japanese Type Culture Collection em Nagao Tóquio. Culturas puras 
de amostras padrões podem ser solicitadas a estas organizações, para uso em trabalhos de 
pesquisa, de controle de qualidade da rotina microbiológica e etc. Usualmente, estas amostras 
são remetidas em ampolas (liofilizadas), mediante a compra e/ou doação. 
4. Uso correto dos materiais em microbiologia: 
a. Pipeta: As pipetas utilizadas em microbiologia são preparadas previamente embrulhadas em 
papel kraft e esterilizadas. Para uso, torcer o papel na região central da pipeta, retirar 
primeiramente o papel da parte superior e depois a inferior (correspondente a ponta da pipeta). 
Esta sequência evita que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Uma vez usada a 
pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro contendo desinfetante. OBS.: as pipetas 
não devem ser flambadas. 
b. Alça e agulha bacteriológica: Toda vez que se fizer uma semeadura siga as regras abaixo 
mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura pelos microrganismos presentes 
no meio ambiente. A alça/agulha bacteriológica deve ser flambada antes e depois de qualquer 
operação de semeadura até ficar incandescente. Para tanto, deve ser passada na chama e a 
posição correta para a flambagem da alça/agulha é que a mesma faça um ângulo de 45°C em 
relação ao bico de Bunsen. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. A 
seguir, para retirar o material a ser manipulado, esfriar previamente a alça/agulha na parede 
interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri. Após o uso, passar a alça/agulha no 
álcool e areia e posteriormente flambá-la. A alça calibrada não deve ser passada no álcool e 
areia. 
5. Semeadura de microrganismos: 
a. Pelo método de espalhamento em placa – semeadura em superfície (“spread plate”): Alíquota 
(normalmente de 0,1 a 1 mL) de amostra direta ou diluída é inoculada na placa contendo meio 
de cultura e depois se espalha essa amostra com a alça de drigalski, previamente esterilizada 
(forno, por 2 horas a 180°C, ou em autoclave, a 121°C por 30 minutos) ou ainda pode-se fazer 
uma esterilização imediata mergulhando a alça em álcool absoluto e em seguida passando na 
chama – flambar (3 vezes consecutivas). 
b. Pelo método de espalhamento em placa – semeadura em superfície e profundidade 
(“pour plate”): Alíquota de uma amostra é inoculada em um tubo contendo ágar 
nutriente liquefeito e homogeneizado. Em seguida é vertido para uma placa de Petri e 
incubado ou é colocado uma alíquota da amostra direto na placa de Petri e posteriormente é 
colocado o meio de cultura, homogeneizado e incubado. 
c. Em placa - na superfície do ágar, para o isolamento de colônias, utilizando alça 
microbiológica: As placas de Petri deverão ser abertas próximas ao bico de Bunsen para 
evitar contaminação com microrganismos do ar. Uma vez semeadas, as placas devem ser 
incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. A técnica de semeadura para 
isolamento de colônias pode ser: 
Técnica de esgotamento por estria contínua na superfície do ágar: 
Técnica de esgotamento por estrias descontínuas na superfície do ágar (4 estrias): 
d. Em tubos (meio sólido) pelo método de estrias superficiais (ágar inclinado): Toda vez que se 
fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos 
imediatamente à retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido seguro pelo dedo 
mínimo da mão que está segurando a agulha. Semear o material por estrias descontínuas na 
superficie do ágar. Após a semeadura, a agulha deve ser passada no álcool e areia e em seguida 
flambada. 
e. Em tubos (meio sólido) pelo método de picada profunda: Semear o material por picada 
profunda e, todo o ágar. Após a semeadura, a agulha deve ser passada no alcool e areia e em 
seguida flambada. 
28 
 
f. Em tubos (meio líquido) pelo método de semeadura por dispersão: A semeadura em tubos 
contendo meio líquido pode ser feita com a alça bacteriológica, a agulha ou pipeta. Semear em 
todo o meio. Após a semeadura, a alça e/ou agulha deve ser passada no álcool e areia e em 
seguida flambada. 
 
Objetivos: Isolar colônias e saber que a origem da mesma foi a partir de uma célula. 
Materiais: 
Duas placas de Petri contendo meio de cultura sólido (ágar nutriente); 
1 Tubo com M.O E. coli em meio de cultura líquido; 
Grade; 
Alça; 
Luva; 
Bico de Bunsen; 
 
Metodologia: Semeadura por estriamento com crescimento na superfície 
Estria Contínua: 
Limpeza da bancada, lavagem das mãos, colocar a luva, flambar a alça esperar a mesma esfriar 
após identificar a placa de Petri na borda parte externa, abrir o tubo contendo os M.O, flambar 
a boca do mesmo e retirar uma alçada de M.O, e colocar na parte interna da identificação, a 
partir deste local utilizando a alça espalhar até o fim da placa desenhando estrias (figura abaixo): 
 
 
 
 
 
Estrias descontinuas: 
Flambar a alça esperar a mesma esfriar após identificar a placa de Petri na borda parte externa, 
abrir o tubo contendo os M.O, flambar a boca do mesmo e retirar uma alçada de M.O, e colocar 
na parte interna da identificação, a partir deste local utilizando a alça espalhar até o fim da placa 
29 
 
desenhando estrias. Sendo que a semeadura para diminuir a quantidade de M.O será 
desenvolvida em quatro etapas conforme demonstrado no esquema abaixo: 
 
Sempre que terminar o estriamento a alça deverá ser mergulhada no álcool areia, flambada para 
a nova iniciar nova semeadura, tocar 3 vezes no fim da estria anterior e semear a partir desse 
local. As placas serão incubadas a 37°C e a análise das mesmas deverá ser no mínimo em 
______ horas. 
 
Resultados e discussão. 
Analise da placa: Estriamento contínuo X descontínuo 
1. Em qual dos mesmos foi obtido melhor isolamento de colônias? 
2. Esquematizar as placas e indicar em qual placa conseguiu isolar colônias 
3. Por que a placa sempre deve ser incubada com a tampa para baixo? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
PRATICAS DE IMUNOLOGIA 
 
 PRÁTICA 1: CÉLULAS DO SANGUE 
Introdução: 
Objetivos: 
Reconhecer e diferenciar as células do sangue, sendo que observar nas células de defesa a 
morfologia do núcleo e coloração/tamanho dos grânulos; 
Materiais: 
1. Duas Lâminas 
2. Lanceta; 
3. Álcool 70%; 
4. Algodão; 
5. Corantes: May-Grunwald e Giemsa 
6. Giemsa diluído: 1 gota da solução estoque para cada mL de água destilada ou tampão 
fosfato; 
Procedimento: 
1. Fazer a assepsia do dedo com álcool 70% e algodão; 
2. Puncionar a polpa digital, colocar uma gota (pequena) na extremidade da lâmina, 
deixando a mesma sob superfície reta; 
3. Pegar a outra lâmina e colocar a mesma com um ângulo de 45°C a frente da gota de 
sangue; 
4. Tocar a gota de sangue com a lâmina, observando que o sangue preencherá o ângulo 
entre as duas lâminas; 
5. Tracionar a lâmina da direita para a esquerda da lâmina, mantendo o ângulo com 
movimento uniforme, sem separar uma lâmina da outra; 
6. Observar a formação de uma delgada camada de sangue. 
 
 
 
A espessura do esfregaço está relacionada: 
• Rapidezdo deslizamento, quanto mais lento mais fino o esfregaço; 
• Variação do ângulo entre as duas lâminas, quanto menor o ângulo mais fino o 
esfregaço; 
• Pressão, quanto maior a pressão, mais fino o esfregaço; 
31 
 
• Extensão do esfregaço, quanto maior mais fino o esfregaço; 
• Tamanho da gota de sangue, quanto menor mais fino o esfregaço. 
7. Secar a lâmina ao ar, agitando a mesma. Na sequência corar; 
Procedimento para coloração: 
1. Colocar a lâmina sobre suporte apropriado. 
2. Recobrir o esfregaço com 20 gotas de May-Grunwald, deixar agir por 2 minutos; 
3. Acrescentar 20 gotas de água destilada durante 2 minutos; 
4. Escorrer a mistura e sem lavar, recobrir o esfregaço com 20 gotas da solução diluída 
de Giemsa, deixar corar por aproximadamente 10 minutos. 
5. Lavar a preparação abundantemente em água corrente; 
6. Deixar secar espontaneamente em posição vertical. Examinar e esquematizar as 
células de defesa identificando as mesmas. 
 
Elementos Celulares Coloração 
 Núcleo Citoplasma/ grânulos 
Hemácias anucleada Rosa 
Linfócitos Núcleo azul-violeta 
Volumoso, circular e denso 
Azul 
Monócitos Núcleo azul-violeta com depressão Azul claro 
Neutrófilo Núcleo azul escuro 
multilobado/polimorfonuclear 
Citoplasma: rosa pálido Grânulos finos 
corados em rosa/azul claro 
Eosinófilo Núcleo azul bilobado Citoplasma: rosa pálido Grânulos 
vermelho e vermelho laranja 
Basófilo Núcleo purpura/ azul escuro Grânulos grandes corados em azul escuro 
Plaquetas - Azul 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.000X 
32 
 
 
PRÁTICA 2: ÓRGÃOS LINFOIDES 
 
Introdução: 
Órgãos primários: 
Medula óssea: função hematopoiese 
Timo: Maturação dos Linfócitos T 
É um órgão bilobado, de formato piramidal e achatado envolvido por uma cápsula de tecido conjuntivo 
denso não modelado, da qual partem trabéculas para o interior, dividindo-o em lóbulos. A cápsula e 
as trabéculas contêm vasos sanguíneos, vasos linfáticos (eferentes) e nervos. Cada lóbulo tem uma 
parte periférica, a zona cortical, e uma parte central, mais clara, a zona medular. No córtex, há uma 
grande quantidade de linfócitos T em proliferação e maturação. Há ainda macrófagos, células 
dendríticas apresentadoras de antígenos e as células reticulares epiteliais. Na medula, há linfócitos T 
imunocompetentes, macrófagos, células dendríticas apresentadoras de antígenos e abundância de 
células reticulares epiteliais, inclusive com a organização dos corpúsculos tímicos (ou de Hassall). 
Verificar: 
Córtex: quantidade grande de linfócitos T; 
Medula: Corpúsculo de Hassal; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Órgãos Secundários: 
 
Linfonodos: São numerosos, cerca de 500 a 600 espalhados pelo corpo, interpostos no trajeto dos 
vasos linfáticos. São órgãos pequenos (1 a 20mm), ovoides, com uma reentrância, o hilo. No lado 
convexo do órgão, entram os vasos linfáticos aferentes, e, no lado côncavo, no hilo, penetram a(s) 
artéria(s) e os nervos e saem as veias e o vaso linfático eferente. A linfa percorre um caminho 
unidirecional, por causa das válvulas dos vasos linfáticos. O linfonodo é envolvido por uma cápsula de 
tecido conjuntivo denso não modelado, contínua ao tecido circundante, inclusive com tecido adiposo 
unilocular. A cápsula é mais espessa no hilo. Ela emite trabéculas para o interior do órgão, levando 
vasos sanguíneos. O arcabouço de sustentação do linfonodo é constituído pelas trabéculas ricas em 
fibras colágenas e pela trama de fibras reticulares do tecido linfoide. O parênquima do linfonodo é 
dividido em: córtex, que é periférico, e medula, em posição central e junto ao hilo. O córtex pode ser 
subdividido em: córtex superficial, mais externo, e em córtex profundo (ou paracórtex), subjacente ao 
33 
 
anterior. Em cortes corados com hematoxilina e eosina, o córtex, devido à maior concentração de 
linfócitos, é mais basófilo, e a medula é mais clara e eosinófila. A zona cortical contém tecido linfoide 
nodular, ou seja, nódulos linfáticos e, entre eles, tecido linfoide difuso. Nos nódulos linfáticos, há 
principalmente linfócitos B, mas há também uma pequena população de linfócitos T, macrófagos e 
células foliculares dendríticas. Os seios linfáticos são espaços por onde circula a linfa, delimitados por 
endotélio geralmente descontínuo e sem lâmina basal, o que facilita o trânsito de macrófagos e 
linfócitos. A zona paracortical é subjacente à zona cortical e é constituída por tecido linfoide difuso, 
rico em linfócitos T, mas contém ainda linfócitos B, macrófagos e células apresentadoras de antígenos. 
Possui as vênulas de endotélio alto, onde ocorre a recirculação dos linfócitos. Na zona medular, há os 
cordões medulares, de tecido linfoide difuso, com linfócitos B, plasmócitos e uma grande quantidade 
de macrófagos. A circulação da linfa é lenta, favorecendo a fagocitose de macromoléculas, células 
estranhas e micro-organismos pelos macrófagos. 
Verificar: 
Córtex: Córtex superficial nódulos linfáticos: principalmente linfócitos B; 
 Córtex profundo tecido linfoide difuso: rica em Linfocitos T; 
Medula: Na zona medular, há os cordões medulares, de tecido linfoide difuso, com linfócitos B, 
plasmócitos e uma grande quantidade de macrófagos; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Baço: O baço situa-se no peritônio, no quadrante superior esquerdo do abdômen, atrás do estômago, 
imediatamente abaixo do diafragma. Tem a forma e o tamanho de um punho fechado e pesa 180 a 
250g no adulto, sendo o maior órgão linfoide do organismo. O baço possui uma superfície convexa e 
outra côncava, o hilo. É revestido pelo mesotélio da serosa, contínuo ao peritônio. Subjacente há uma 
cápsula de tecido conjuntivo denso não modelado, que é mais espessa no hilo. Ela emite trabéculas, 
principalmente no hilo, por onde entram a artéria esplênica e os nervos e saem a veia esplênica e os 
vasos linfáticos. O tecido linfoide apresenta uma trama de células reticulares e fibras reticulares, que 
sustenta as células de defesa: linfócitos, plasmócitos, macrófagos, células dendríticas apresentadoras 
de antígenos e células dendríticas foliculares. O parênquima do baço (polpa esplênica) divide-se em: 
polpa branca, que corresponde aos nódulos linfáticos, e em polpa vermelha, com os cordões 
esplênicos (ou de Billroth), estruturas alongadas de tecido linfoide, e os seios esplênicos, que são 
capilares sinusoides. Em cortes frescos ou fixados, observados a olho nu, as regiões com nódulos 
linfáticos são pontos esbranquiçados, enquanto o tecido circundante, ricamente vascularizado, é 
vermelho-escuro, por isso as denominações polpa branca e polpa vermelha. Pela cápsula do hilo entra 
34 
 
a artéria esplênica, que se divide e cujos ramos correm pelas trabéculas. As artérias trabeculares 
originam as artérias centrais, as quais são envolvidas por uma bainha de linfócitos que pode se 
espessar em um nódulo linfático. A bainha é rica em linfócitos T, e o nódulo, em linfócitos B. Essas 
arteríolas geralmente situam-se em posição excêntrica nos nódulos linfáticos, mas são denominadas 
arteríolas centrais por serem ramos das artérias centrais, que foram assim designadas pela localização 
central na bainha linfocitária. Na polpa vermelha, elas se ramificam nas arteríolas peniciladas, e estas 
terminam nos capilares embainhados (ou com elipsoides), que apresentam uma bainha de 
macrófagos. A presença de uma arteríola no nódulo linfático permite o diagnóstico histológico do 
baço. O sangue é lançado nos espaços intercelulares dos cordões esplênicos (circulação aberta), onde 
as células de defesa removem os antígenos presentes e produzem anticorpos a estas substâncias. Os 
macrófagos fagocitam também células sanguíneas alteradas ou velhas, especialmente as hemácias 
(hemocaterese) e as plaquetas.Verificar: 
Polpa Branca: Nódulo linfático: artéria central, bainha periarterial (linfócitos T), linfócitos B. 
Polpa Vermelha: Cordões Esplênicos e Seios Esplênicos (capilares sinusoides); 
 
 
 
35 
 
PRÁTICA: AGLUTINAÇÃO DIRETA E INDIRETA 
 
Introdução: 
Reação de aglutinação direta e indireta 
Reações de aglutinação ocorrem entre um antígeno particulado e seu anticorpo específico 
(aglutinação direta ou ativa) ou entre uma partícula inerte (hemácia, látex, partículas de gelatina, 
poliestireno) recoberta por antígeno solúvel e seu anticorpo específico ou vice-versa 
(aglutinação indireta ou passiva). 
Devem-se a formação de pontes de anticorpos bivalentes ligados a determinantes antigênicos 
das superfícies de partículas adjacentes. As interações Ag-Ac podem ser divididas em três 
categorias: 
Primária: Ligação Ag-Ac 
Secundaria: Precipitação, aglutinação e fixação de complemento 
Terciária: expressão biológica (bacteriólise, hemólise...) 
São em geral simples em lâminas ou tubos, porém, necessitam de uma cuidadora padronização 
e do uso de controles positivos e negativos. Alguns fatores como a concentração da suspensão 
de antígeno, temperatura, tempo de incubação e eletrólitos no diluente que mantem o pH ao 
redor de 7.0. A titulação de soros aglutinantes é feita com quantidades decrescente de soro que 
apresenta aglutinação visível. 
Estes testes podem ser: 
Qualitativos: presença ou ausência de Ac (triagem) 
Semi-quantitativos: [ ] Ac aglutinante (titulação) 
Bactérias e outras suspensões celulares são aglutinadas quando misturadas a anticorpos 
específicos. A reação de aglutinação é realizada para detecção e dosagem de anticorpos no soro 
ou para a identificação de microrganismos. 
 
Antígenos Solúveis: 
Quando combinados com anticorpos específicos levam a precipitação, cujos complexos 
antígeno-anticorpo formam grandes agregados insolúveis. Os mesmos antígenos, se ligados 
natural ou artificialmente a partículas, por exemplo, células bacterianas, hemácias, partículas 
de látex, formarão aglutinados. Este fenômeno é denominado aglutinação. 
 Até certo ponto, a precipitação e a aglutinação podem ser consideradas como manifestações de 
uma mesma manifestação antígeno -anticorpo, tendo como diferença básica a forma física do 
antígeno em teste. Em ambas as reações ocorre uma reunião reversível em dois estágios. No 
primeiro estágio, os anticorpos presentes no soro imune reagem com determinantes antigênicos 
específicos existentes no antígeno. A facilidade da combinação entre o antígeno e o anticorpo 
depende de diversos fatores: pH do meio, força iônica, temperatura de reação, concentração de 
antígeno e de anticorpo, natureza do anticorpo, tempo de reação, anticorpos incompletos, 
fenômeno pro-zona.... 
Quando a reação de acoplamento primário alcança seu equilíbrio, ocorre o segundo estágio, que 
é a formação do mosaico. Como na precipitação o antígeno é uma molécula solúvel, é preciso 
que se forme um mosaico grande antes que se possa observar um agregado visível. 
36 
 
Na aglutinação, por outro lado, o antígeno faz parte de uma grande partícula insolúvel, sendo 
necessário um numero relativamente pequeno de moléculas para que ocorra uma agregação 
visível. Consequentemente, a aglutinação é um ensaio sorológico mais sensível para a detecção 
de anticorpos do que a precipitação. Algumas vezes, pode ser necessário converter-se um 
sistema de precipitação em um sistema de aglutinação, para que aumente a sensibilidade do 
ensaio (aglutinação indireta). 
 
Objetivos: 
1. Observar a reação de aglutinação direta através do sistema ABO e Rh; 
2. Compreender a reação de aglutinação indireta através da analise de teste de gravidez; 
 
Materiais: 
• Lâminas 
• Palito 
• Lanceta 
• Algodão 
• Álcool 70% 
• Anticorpo: anti-A, anti-B, anti-D 
• Caneta marcadora 
 
Metodologia: 
Identificar na borda da lamina: anti-A, anti B e anti D, limpar o dedo com algodão embebido 
em álcool 70%, perfurar o dedo com a lanceta, colocando uma gota de sangue abaixo de cada 
identificação, acrescentar o anticorpo e homogeneizar cada gota com um palito, cuidando para 
não utilizar o mesmo palito, observar as características da gota de sangue antes e após 
acrescentar as soluções de anticorpos. 
 
Resultados: 
 
 
 
 
 
Positivo: Aglutinação hemácias, presença de Ag correspondente; 
Negativo: Ausência de aglutinação, ausência de Ag; 
 
Sistema ABO: 
É o mais importante dos sistemas sanguíneos referente a transfusões: 
 
Genótipo Tipagem/Fenótipo/ 
grupo sanguíneo 
Anti-A Anti-B 
Anti-A 
Kirby 
Bauer 
Anti-B 
Kirby 
Bauer 
Anti-D 
dddKir
by 
Bauer 
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IAIA ou IAi A + - 
IBIB ou IBi B - - 
IAIB AB + + 
ii O - - 
 
Sistema Rh: 
Existem mais de 40 tipos de antígeno, onde o Ag D é o mais imunogênico. Contudo, 75% da 
população apresentam o gene D, mas 25% apresentam outros variantes ou pouca expressão do 
antígeno, sendo impossível tipar pelo Kit (anti-D), sendo necessários exames de laboratório 
com outros soros (Ac) e outras técnicas. 
Genótipo Tipagem/fenótipo Antígeno 
DD ou Dd (d+) Rh + Presente 
dd (d-) Rh - Ausente 
 
 
Materiais: 
• Teste de gravidez 
• Urina 
 
Metodologia: 
Compreender o teste de gravidez na urina e observar através do teste de imunocromatografia a 
determinação qualitativa rápida da gonadotrofina coriônica humana pela aglutinação indireta. 
Resultados: 
 
 
 
 
 
Interpretação: 
 
 
38