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INTEGRANTES: ANDRESSA AP. JACINTO SAMPAIO MARCELO MARTINS PEREIRA PEDRO H. SILVA DE ROSSI TATIANE BARBOZA DA COSTA DISCIPLINA: Microbiologia de Alimentos PROFA. DRA. Alice Yoshiko Tanaka TECNOLOGIA EM ALIMENTOS 3º TERMO ∫ NOTURNO RELATÓRIO FINAL DE AULA PRÁTICA Aula prática 1: Contagem total de bactérias mesófilas aeróbias e fungos em vegetais. Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que, quando presentes e um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento (FRANCO & LANDGRAF, 1996). Esses microrganismos indicadores podem ser utilizados para refletir a qualidade microbiológica dos alimentos em relação à vida de prateleira ou à segurança, neste ultimo caso, devido à presença de patógenos alimentares. Em geral, microrganismos indicadores são utilizados para avaliar aspectos de qualidade a sanificação dos alimentos. OBJETIVO: Mostrar a técnica de quantificação de bactérias mesófilas totais e fungos deteriorantes em matérias-primas. MATERIAIS Erlenmeyer Placa de Petri Pipetas Balança semi-analítica Tubos de ensaio Banho maria Incubadora Alça de Drigalski MEIOS DE CULTURA PCA 2,35% PDA 3,9% Solução para a diluição seriada: água peptonada 0,1% (p:v) (2916 mL- 2,92g). MATERIAL ANALISADO Maça RESUTADOS E DISCUSSÃO: Após fazer a higienização da maça próximo ao Bico de Bunsen (com chama), adicionamos a amostra 225ml de água peptonada (diluição 10-1) previamente esterelizada em Erlenmeyer. Foi homogeneizado. Retiramos 1 ml da solução homogeneizada da amostra e passamos para um tubo de ensaio com 9 ml de água peptonada (diluição 10-2). Foi homogeneizado. Retiramos mais 1 ml da diluição 10-2 e adicionamos 9 ml de água peptonada (diluição 10-3). Foi homogeneizado. Para o plaqueamento em superficie das diluições 10-1, 10-2 e 10-3 no meio PCA e PDA, usamos 0,1 ml de cada amostra diluida e espalhamo com a alça de Drigalski sobre o meio agar. Levamos o meio PCA vertido até a estufa 35ºC por até 48h e o meio PDA não vertido a 25ºC até 5 dias. Após esse tempo, vericamos a existencia sobre a formação de colônias no meio PCA e PDA, respectivamente. Meio PDA: contamos até a 102: 16 colônias. Meio PCA: Permaneceu muito tempo na incubadora. Contamos apenas as colônias mais brilhantes (103 = 3 colônias). Sabemos que a maça, assim como outros frutos, tem a sua resistência particular, uma vez que, a maça possui fatores antimicrobianos naturais. Aula prática 2: Quantificação de coliformes totais e Escherichia coli em amostras de Queijo Minas Frescal através do meio Chromocult Agar. O queijo Minas Frescal é um produto que tem ampla aceitação comercial e que faz parte do hábito alimentar da população, na maioria das regiões do país. Apesar da legislação brasileira exigir a utilização de leite pasteurizado no seu preparo, é bastante frequente a comercialização do produto que não atende a esta especificação legal (PEREIRA et al., 1991). Quando este produto é fabricado de forma artesanal, por pessoas não treinadas, pode ocorrer a contaminação por diversos microrganismos, comprometendo tanto a sua qualidade como a segurança da saúde do consumidor. Por este motivo, as práticas higiênicas devem ser observadas com rigor, para prevenir uma possível contaminação ou recontaminação do produto. Além disso, por não ser maturado, é um produto perecível, devendo ser consumido rapidamente após curta estocagem em ambiente refrigerado (SILVA & LEITÃO, 1980). A ingestão de queijos com condições inadequadas para consumo pode trazer graves consequências para a população, sendo, portanto, um problema de Saúde Pública. De acordo com o anexo I da Portaria 451 do DINAL (BRASIL, 1997), o queijo Minas Frescal deve atender aos seguintes padrões microbiológicos: número mais provável (NMP) máximo de 102/g para coliformes fecais e NMP ou contagem direta em placa (máximo) de 103/g para Staphylococcus aureus, objetivando levar ao consumidor um produto de boa qualidade higiênico-sanitária. OBJETIVO: Análise de coliformes e Escherichia coli pelo meio oficial Chromocult Agar Merck em queijo, fazendo um paralelo desta técnica com a do Número Mais Provável (NMP). MATERIAIS Erlenmeyer Placa de Petri Pipetas e Provetas Balança semi-analítica Tubos de ensaio Banho maria Béquer Alça de Drigalski Solução diluente: Água peptonada 0,1% - 1108 ml = 1,1g. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Foram realizadas diluições seriadas da amostra em água peptonada, para tanto, pesamos 25g e adicionamos 225ml de água peptonada 0,1%, homogeneizamos por um minuto, e em seguida a diluição em tubos de ensaio 102 e 103. Como a legislação sanitária só apresenta padrões para dois destes microrganismos, apresentamos a conformidade destes resultados com a Portaria 451 do Ministério da Saúde (BRASIL, 1997), que considera o queijo Minas Frescal em desacordo com os padrões legais vigentes quando as contagens de coliformes fecais e S. aureus é superior a 10²ufc/g e 10³ufc/g, respectivamente. A presença de E. coli em um alimento pode ser avaliada sob dois significados. Inicialmente, E. coli, por ser uma enterobactéria, uma vez detectada no alimento, indica que este tem contaminação microbiana de origem fecal e portanto está em condições higiênicas insatisfatórias. O outro aspecto a ser considerado é que diversas linhagens de E. coli são comprovadamente patogênicas para o homem e animais (FRANCO & LANDGRAF, 1996). MATERIAL ANALISADO Quejo Minas Frescal Aula prática 3: Verificação de presença de estafilococos coagulase positiva em queijo pelo método Petrifilm 3 M. Métodos analíticos microbiológicos são imprescindíveis para a verificação da presença de micro-organismos patogênicos em alimentos. Neste sentido, métodos microbiológicos clássicos também chamados convencionais são aplicados, porém tais métodos apresentam desvantagens que podem levar à liberação de lotes de alimentos contaminados devido a amostras falso-negativas. Desse modo, métodos rápidos alternativos estão sendo desenvolvidos e empregados como potenciais substitutos aos métodos clássicos ou como complementares a estes (RODRIGUES et al., 2011). Na metodologia convencional foi utilizada a Instrução Normativa nº 62 de 26 de Agosto de 2003 do Ministério da Agricultura, a qual Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água (BRASIL, 2003). Já para a metodologia rápida, foi utilizado o sistema Petrifilm™, e seguidas às instruções do fabricante. OBJETIVO: Verificar a presença ou ausência de estafilococos coagulase positiva em queijo minas frescal. MATERIAIS Erlenmeyer Placa de Petri Pipetas e Provetas Balança semi-analítica Tubos de ensaio Banho maria Béquer Alça de Drigalski MATERIAL ANALISADO Quejo Minas Frescal Meio Petrifilme 3M para rápida identificação de Staphylococcus aureus. Água peptonada 0,1%. Realizamos a diluição seriada até 103 do queijo e inoculamos 1 ml das três diluições em meio Petrifilme (3M) para identificação rápida. Após, incubamos no meio Petrifilmea 35ºC por 24 h. As principais vantagens das placas Petrifilm™ em relação aos métodos convencionais é que são simples de utilizar, de tamanho pequeno, com longa vida de prateleira e facilitam a leitura dos resultados (FUNG, 2002). São prontas para uso, eliminando as etapas de preparação dos meios de cultura e vidrarias necessários, ocupam menos espaço em incubadoras, geladeiras, armários, autoclaves, têm descarte mais fácil, não quebram, não derramam e podem ser congeladas para contagem posterior ou reanálise (FRANCO; BELOTI, 1990). Amostra, diluída ou não, é inoculada na superfície do filme base e o filme superior é sobreposto. Com o auxílio de um difusor plástico, a amostra é espalhada em uma área determinada. Após solidificação da substância geleificante, o conjunto é incubado na temperatura e tempo indicados pelo fabricante. Para a avaliação da qualidade microbiológica do queijo analisado durante a aula prática, os resultados obtidos foram comparados com os padrões microbiológicos determinados para queijos de muito alta umidade pela RDC no 12, de 2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 2001), que estabelece como grupos de microrganismos indicadores de qualidade os coliformes a 45°C e os estafilococos produtores de coagulase. Para a comparação das populações de coliformes a 35°C, grupo de microrganismos não obrigatório como parâmetro de qualidade pela RDC no 12, utilizou-se a Portaria no 146, de 07/03/1996, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (BRASIL, 1996). Sabe-se que esse grupo de microrganismos geralmente é contaminante ambiental, e sua contagem elevada indica deficiência na qualidade higiênico-sanitária do produto (BRANT et al., 2007). Aula prática 4: Meio de identificação Rugai com Lisina Conhecida como meio IAL (Instituto Adolfo Lutz), a série bioquímica composta por nove provas foi inicialmente desenvolvida em 1972, por Pessoa & Silva, na qual um meio possibilitava a pesquisa da motilidade e da descarboxilação da lisina. Em 1986, tais provas foram testadas em uma segunda adaptação, com mais reações obtidas no meio clássico de Rugai & Araújo. Este meio de identificação possibilita todas as reações em um único tubo, verificando basicamente a presença de enzimas, emissão de gás e motilidade. As provas bioquímicas são motilidade da bactéria pela turvação da lisina, lisina descarboxilase, fermentação da glicose, fermentação da sacarose, produção de gás sulfídrico (H₂S), produção de gás, utilização do aminoácido L-triptofano (desaminação), hidrólise da ureia e formação de indol. Em adição, realiza-se a verificação da fermentação de lactose em ágar MacConkey e o teste de citrato, não inclusos no meio. Elaborado para a triagem de enterobactérias, vibrios e não- fermentadores, o meio IAL permite a identificação dos principais gêneros e espécies de bactérias Gram-negativas: Escherichia coli, Shigella spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Providencia spp., Morganella morganii, Proteus spp., Salmonella spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Vibrio spp. e não-fermentadores. Pela elevado número de provas bioquímicas em apenas um tubo, é necessário ter prévio conhecimento durante a interpretação do teste. A dificuldade para diferenciar gêneros com resultados de provas bioquímicas similares exige a realização de provas adicionais, como a enzima ornitina por exemplo. A inoculação é feita com o auxílio de um fio de platina, no qual o colocamos a amostra da colônia bacteriana, inoculada com uma picada até o fundo do tubo e realiza estrias na superfície do meio. Em seguida, o meio é incubado em estufa a 37°C por 18-24 horas. Realiza-se a leitura das provas comparando-as a uma tabela padronizada, na qual são exibidos os perfis bioquímicos das principais espécies bacterianas pesquisadas. É importante salientar que a caracterização correta de espécies de Enterobacter spp., Serratia spp. e Pseudomonas deve ser feita com provas complementares. REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO BRASIL. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Portaria N° 146 de 07 de Março de 1996. Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade dos Produtos Lácteos. Disponível em: < http: / www.agricultura.gov.br >. FAO (Food and Agricultural Organization). Milk / Dairy products. Agribusiness Handbook. Viale delle Terme di Caracalla, Rome, Italy, 2009. FOTOU, K.; TZORA, A.; VOIDAROU, CH.; ALEXOPOULOS, A.; PLESSAS, S.; AVGERIS, I.; BEZIRTZOGLOU, E.; AKRIDA- DEMERTZI, K.; DEMERTZIS, P. G. Isolation of microbial pathogens of subclinical mastitis from raw sheep’s milk of Epirus (Greece) and their role in its hygiene. Journal of the Anaerobe Society of the Americas, n. 17, p. 315-319, 2011. PANDYA, A.J.; GHODKE, K.M. Goat and sheep milk products other than cheeses and yoghurt.Small Ruminant Research, n. 68, p.193–206, 2007. PARK, Y. W.; WENDORFF, W. L. Sheep milk. In: Handbook of milk of non bovine mammals. Blackwell Publishing, Iowa, USA, p. 137- 194, 2006. REIS, G. L.; ALVES, A. A.; LANA, A. M. Q.; COELHO, S. G.; SOUZA, M. R., CERQUEIRA, M. M. O. P.; PENNA, C. F. A. M.; MENDES, E. D. M. Procedimentos de coleta de leite cru individual e sua relação com a composição físicoquímica e a contagem de células somáticas. Revista Ciência Rural, n. 4, v.37, p.1134-1138, julago, 2007. RIBEIRO. L. C.; PÉREZ, J. R. O.; CARVALHO, P. H. A.; SILVA, F. F.; MUNIZ, J. A.; JÚNIOR, G. M. O.; SOUZA, N. V. Produção, composição e rendimento em queijo do leite de ovelhas Santa Inês tratadas com ocitocina. Revista Brasileira de Zootecnia, v.36, n.2, p.438-444, 2007.