REGRAS+PARA+CÁLCULO+DE+CONTAGEM+DOS+MICRORGANISMOS (1)

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REGRAS PARA CÁLCULO DE CONTAGEM DOS MICRORGANISMOS (extraídas do “Compendium of methods for the microbiological examinations of foods“, editado por Vanderzant, C. & Splittstoesser, D.F. e compilado pela APHA - American Public Health Association)
1. CONTAGEM DAS COLÔNIAS
Deve-se usar um contador de colônias. Esse equipamento possui um guia reticulado em cm2, o que permite que, em alguns casos, não seja necessário contar a placa toda: conta-se alguns quadrados, faz-se a média do número de colônias por cm2 e extrapola-se para a placa toda (as placas costumam ter 56 cm2).
O contador possui também iluminação artificial e lente de aumento, o que possibilita minimizar as confusões entre colônias (principalmente as pequenas, puntiformes) e partículas de alimentos, do meio de cultura, gotas de óleo, sujidades em geral.
O operador deve ter boa visão e cuidado para a obtenção de bons resultados. Em relação ao mesmo laboratorista, admite-se diferenças de até 5% em duas contagens da mesma placa; entre laboratoristas diferentes, até 10%. Deve-se usar uma rotina de trabalho que minimize a fadiga dos olhos, para a obtenção de melhores resultados.
A não ser que o número de colônias seja muito alto (ver regras abaixo), deve-se contar todas as colônias, logo após a incubação. Se não for possível fazer a contagem logo em seguida, as placas devem ser armazenadas em geladeira, por no máximo 24 horas. Esse procedimento, no entanto, não deve ser rotineiro.
2. CÁLCULOS
2.1. ESCOLHA DAS PLACAS
Para efeito de cálculo, considerar as placas que tenham entre 10 e 300 colônias.
2.2. CORREÇÃO DA DILUIÇÃO E VOLUME
No caso de haver apenas uma placa nas condições ideais, o resultado vai ser o número de colônias multiplicado pelo inverso da diluição utilizada. Lembrar que, no caso de se realizar semeadura em superfície, deve-se também multiplicar por 10, a fim de corrigir o volume, uma vez que o inóculo é de 0,1 mL e o resultado é expresso em 1 mL ( ou grama ).
Exemplo:
diluição 1/100 234 colônias
diluição 1/1000 22 colônias
 resultado se a semeadura foi em profundidade = 23.000 UFC/mL
 resultado se a semeadura foi em superfície = 230.000 UFC/mL
OBSERVAÇÂO: em Microbiologia de Alimentos e em Microbiologia Clínica, costuma-se utilizar diluições decimais e semeaduras de 1,0 mL ou 0,1 mL, conforme os exemplos acima. No Contole Microbiológico de Medicamentos e Cosméticos, as diluições nem sempre são decimais, bem como o inóculo. Assim, a correção de diluição e de volume deve ser adaptada a cada caso.
2..3. UFC
O resultado é expresso em “Unidades Formadoras de Colônias” por mL ou grama, no caso de material sólido (não dá para assegurar que o número de colônias corresponda ao número de bactérias, pois algumas destas se apresentam em pares, cadeias, cachos, etc).
2.4. ARREDONDAMENTO
Considerar, no resultado, apenas dois dígitos, utilizando zeros depois deles.
· Quando o terceiro dígito for um número > 5, arredondar para cima.
· Quando o terceiro dígito for um número < 5, arredondar para baixo.
Exemplos:
 23.600 colônias = 24.000 UFC = 2,4 x 104 UFC/mL
 14.200 colônias = 14.000 UFC = 1,4 x 104 UFC/mL
(alternativamente, os resultados podem ser expressos sob forma de potência)
OBSERVAÇÃO: os resultados dos exemplos acima são relativos à técnica de semeadura em profundidade, na qual não há correção de volume, pois o inóculo é de 1,0 mL.
2.5. CONTAGEM SIMPLES
Quando houver duas diluições consecutivas que resultaram um número de colônias entre 10 e 300, faz-se o cálculo com as duas e a média dos dois resultados é arredondada somente no final. Exemplo:
 diluição 1/100 = 243 colônias
 diluição 1/1000 = 34 colônias 
resultado = 29.000 UFC/mL ou 2,9 x 104 UFC/mL
Se a contagem mais alta for maior do que duas vezes a DILUIÇÃO mais baixa, considerar apenas a mais baixa. Exemplo:
 diluição 1/100 = 250 colônias
 diluição 1/1000 = 80 colônias 
resultado = 25.000 UFC/mL ou 2,5 x 104 UFC/mL
2.6. CONTAGEM EM DUPLICATA
No caso da contagem ter sido feita em duas placas para cada diluição (duplicata), considerar aquelas que resultaram um número de colônias entre 10 e 300, e calcular a média dos resultados. Exemplos:
diluição 1/100 = 228 e 240 colônias
diluição 1/1000 = 26 e 28 colônias
 resultado = 25.000 UFC/mL ou 2,5 x 104 UFC/mL
 diluição 1/100 = 175 e 208 colônias
 diluição 1/1000 = 05 e 08 colônias 
resultado = 19.000 UFC/mL ou 1,9 x 104 UFC/mL
 (os números 15 e 18 foram desprezados por serem menores do que 10)
 diluição 1/100 = 227 e 243 colônias
 diluição 1/1000 = 05 e 28 colônias 
resultado = 25.000 UFC/mL ou 2,5 x 104 UFC/mL
2.7. NENHUMA PLACA COM 10 A 300 COLÔNIAS
Se não houver nenhuma placa com 10 a 300 colônias, selecionar os valores mais próximos de 300, dando o resultado como estimado. Exemplos:
 diluição 1/100 = 325 colônias
 diluição 1/1000 = 06 colônias
 resultado = 33.000 UFC/mL (estimado) ou 3,3 x 104 UFC/mL (estimado)
2.8. TODAS AS PLACAS COM MENOS DE 10 COLÔNIAS
Se todas as placas tiverem menos de 10 colônias, utilizar o número real obtido na menor diluição, dando o resultado como estimado. Exemplos:
 diluição 1/100 = 08 colônias
 diluição 1/1000 = 2 colônias
 resultado = 800 UFC/mL (estimado) ou 8 x 102 UFC/mL (estimado)
 diluição 1/100 = 18 e 16 colônias (duplicata)
 diluição 1/1000 = 2 e 0 colônias
resultado = 1700 UFC/mL (estimado) ou 1,7 x 103 UFC/mL (estimado)
2.9. NENHUMA PLACA COM CRESCIMENTO
Se não houver crescimento em nenhuma placa, relatar o resultado estimado como menor que a diluição mais baixa. Exemplo:
 diluição 1/100 = 0 colônias
 diluição 1/1000 = 0 colônias 
 resultado = < 100 UFC/mL (estimado)
Se tiver sido semeado 0,1mL, é necessário multiplicar por 10 para corrigir o volume.
2.10. PLACAS COM MUITAS COLÔNIAS (>300)
Se o número de colônias exceder 300 UFC em todas as placas, procede-se da seguinte forma:
· Se houver menos de 10 colônias por cm2:
· Contar as colônias de 12 quadrados (6 numa direção e as outras 6 perpendicularmente);
· Fazer uma média, que vai fornecer o número de colônias por cm2 e multiplicar pela área total da placa (as placas comuns costumam ter 56 cm2, mas é aconselhável calcular as áreas das placas utilizadas em cada laboratório A = r2).
· Quando houver mais de 10 colônias por cm2: para placas com área de 56 cm2 o resultado deve ser expresso como: > 560000 UFC/mL (estimado) ou > 5,6 x 105 UFC/mL (estimado) quando a semeadura é em profundidade e > 5,6 x 106 UFC/mL (estimado) quando a semeadura é realizada em superfície.
Esse procedimento deve ser utilizado quando, mesmo na maior diluição utilizada (no exemplo, 1/1000), a contagem for muito alta. Desta forma, nunca se deve expressar o resultado como incontáveis (ou TNTC = too numerous to count) e sim como resultado estimado.
2.11. ESPALHAMENTOS
Ocasionalmente podem acontecer placas com “espalhamentos” (spreaders), em conseqüência, principalmente, de má homogeneização. Deve-se rever o procedimento laboratorial quando, num laboratório ocorrer um número > 5% de placas com espalhamentos, ocupando mais de 25% das placas.
Se a placa tiver espalhamentos, ela deve ser considerada apenas nos casos em que, pelo menos 50% dela apresentar crescimento homogêneo. Neste caso, conta-se alguns quadrados da área homogênea, faz-se a média e multiplica-se pela área total da placa, dando o resultado como estimado.
Quando não houver pelo menos 50% da placa com crescimento homogêneo, relatar o resultado como “acidente de laboratório”. Deixe-se claro que as placas com espalhamento só devem ser consideradas quando não houver outras em melhores condições. 
Existe um tipo especial de espalhamento que consiste de uma cadeia de colônias, que parecem originar-se da desintegração de um arranjo de bactérias. Neste caso, deve-se considerar como apenas uma UFC.
2.12. SUSPEITA DA PRESENÇA DE SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS
Quando houver crescimento de colônias em número desproporcionalmente maior nas placas de maior diluição, deve-se suspeitar da presença de conservantes no material. Entretanto, essa suspeitadeve ser confirmada através de outras determinações, pois pode se tratar apenas de um “acidente de laboratório”.
3. EXERCÍCIOS
1. Numa contagem de bactérias em alimento (semeadura em superfície) obtiveram-se os seguintes resultados:
	A) diluições
	nº colônias
	10-1
	Incontável
	10-2
	220
	10-3
	30
	B) diluições
	nº colônias
	10-1
	Incontável
	10-2
	430
	10-3
	93
2. Numa contagem de bactérias mesófilas que crescem em aerobiose em leite tipo C (semeadura em profundidade) obtiveram-se os seguintes resultados:
	A) diluições
	nº colônias
	10-1
	Incontável
	10-2
	Incontável
	10-3
	240
	B) diluições
	nº colônias
	10-1
	incontável
	10-2
	320
	10-3
	40
Considerando que a Legislação permite, para esse tipo de leite, um número de até 3,0 x 105 UFC/mL, diga se esses leites estão ou não aprovados. Justifique.
3. A contagem de fungos em alimentos é feita pela técnica do “pour plate”, utilizando-se meio de cultura e condições de incubação apropriados. Foi realizada uma contagem em um suco de laranja industrializado, em cuja embalagem estava escrito “ESTÉRIL - SEM CONSERVANTES”, obtendo-se os seguintes resultados: 
	diluições
	Nº colônias
	10-1
	Zero
	10-2
	Zero
	10-3
	50
Considerando-se que não houve erros técnicos, discuta os resultados.
4. Calcule o nº de UFC/mL nas contagens cujos números de colônia por placa estão expressos abaixo. Considerar que nos 5 primeiros casos a técnica foi de semeadura em profundidade (inóculo de 1mL), enquanto nos demais foi utilizada a técnica de semeadura em superfície (inóculo de 0,1mL).
	Diluição
	Caso 1
	Caso 2
	Caso 3
	Caso 4
	Caso 5
	Caso 6
	Caso 
7
	Caso 8*
	Caso 
9
	Caso 
10
	10-1
	212
	245
	183
	348
	15
	0
	TNTC
	0
	180;120
	TNTC;TNTC
	10-2
	18
	36
	42
	20
	3
	0
	TNTC
	33
	30;45
	234;188
	10-3
	3
	9
	3
	1
	0
	0
	>10/cm²
	2
	2;8
	28;35
* Não houve erro técnico
5. Calcule o número de UFC/mL de uma contagem realizada com alça calibrada de 10µL na qual houve crescimento de 48 colônias.
6. Por que o resultado das contagens de bactérias é expresso em “unidades formadoras de colônia” por mL e não em bactérias/mL?
7. Por que se utiliza, para efeito de cálculo, placas com números de colônia entre 10 e 300 (segundo o manual da APHA para alimentos)?
8. Por que, nas técnicas tradicionais de contagem, é necessário diluir a amostra?
9. Calcule o número de UFC/mL nas contagens que você realizou no laboratório e compare os resultados entre as técnicas e entre os outros colegas.