Diálise: técnica de separação de moléculas

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DIÁLISE 
 
 
 A diálise é uma técnica usada para a separação tanto de moléculas grandes como de moléculas 
pequenas, e depende do fato de que moléculas pequenas (peso molecular até 15.000) passam 
livremente através de uma membrana, enquanto que as moléculas grandes (de peso molecular 
mais elevado) ficam retidas. Cientificamente, esta ponderação é muito simplificada, porque tanto 
grupos específicos como cargas existentes nas moléculas afetam a velocidade de difusão, 
particularmente com moléculas de tamanho intermediário. A velocidade da diálise também sofre 
influência pela temperatura, de tal forma que quanto mais elevada for a temperatura, maior será 
a velocidade da diálise. Em temperaturas elevadas, a viscosidade do solvente é menor e a 
velocidade de difusão é aumentada. Por outro lado, muitas moléculas são sensíveis à temperatura. 
Desta forma, a diálise de enzimas é geralmente executada em geladeiras. O solvente afeta a 
velocidade de diálise de diversas formas, necessitando, portanto, de escolha cuidadosa. Em geral, 
a velocidade de diálise é maior usando água como solvente, mas um controle cuidadoso da força 
iônica e pH são freqüentemente necessários para estabilizar as moléculas sob investigação. A 
presença de sais reduz a velocidade de diálise, provavelmente, por alterar a forma e a carga da 
molécula. Qualquer reagente no solvente que possa desnaturar as moléculas também pode reduzir 
consideravelmente a velocidade de diálise. As membranas mais primitivas usadas para diálise são 
as tripas de porco ou o colódio. Atualmente também são usadas membranas de celofane. Os tubos 
(sacos ou membranas), recomendados para o experimento a seguir, são feitos pela Union Carbide 
e fornecidos em diferentes tamanhos e texturas. Um tubo de comprimento considerado suficiente 
é cortado e embebido em água sendo que uma das extremidades é amarrada com um nó. O 
material a ser dialisado é colocado no interior do saco e a sua extremidade superior é amarrada 
ou presa por grampo ou pinça. A seguir, o material é submetido a diálise. Após ter sido usado, o 
saco de diálise pode ser reutilizado sendo, no entanto, susceptível ao ataque de microorganismos. 
Deste modo, deve ser conservado em água contendo traços de ácido benzóico. Existem inúmeros 
exemplos de procedimento para isolamento bioquímico onde a concentração de sais ou outros 
materiais de baixo peso molecular devem ser retidos ou diminuídos antes de executar novo estágio 
da separação. Em tais casos a diálise é o método mais conveniente. O saco de diálise contendo 
a mistura é colocado em um grande recipiente (béquer, cuba etc.), contendo água ou solução 
tampão, e submetido à agitação magnética. No caso de proteínas, ou outras moléculas sensíveis, 
o sistema todo é colocado em geladeira ou câmara fria. O saco de diálise deve estar 
completamente cheio, caso contrário, a água penetra para o seu interior, por osmose, causando 
aumento do volume. Isto é, em geral, indesejável e deve ser evitado. 
 
Parte experimental 
 
 
 O amido é constituído por amilose e amilopectina, cujos pesos moleculares são de até 500.000 e 
1000.000, respectivamente. Devido aos seus altos pesos moleculares estes compostos não passam 
através da membrana do saco de diálise. As amilases são enzimas que ocorrem na saliva e no 
pâncreas. Hidrolisam ligações glicosídicas do tipo (1 4). Atuam no meio da macromolécula, 
produzindo, na clivagem inicial, oligossacarídeos de seis ou sete unidades de glicose, que 
posteriormente são degradados à maltotriose e maltose. A ação prolongada da -amilase salivar 
sobre a maltotriose produz maltose e glicose livre. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 O curso da reação pode ser acompanhado pela degradação dos polissacarídeos (reação com o 
iodo) ou pelo aumento do poder redutor (reações com a antrona ou reagente de Benedict). O 
reagente da Antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor liberado pela 
diluição do H2SO4 é suficiente para que ocorra a reação. No caso de oligo e polissacarídeo, o 
H2SO4 atua como catalisador de hidrólise convertendo-os a monossacarídeos (hexoses e 
pentoses) e também atua como agente desidratante levando à formação de hidroximetilfurfural e 
furfural que, em presença de Antranol, dão produtos de condensação coloridos. 
 
 
 
Reagentes Cloreto de sódio 0,1%, tamponado com tampão fosfato 0,02 M pH 6,8 Amido solúvel 
2% Saliva Solução de iodo 0,05 N em 3% KI, contendo ácido tricloroacético 5% Reagente de 
antrona: solução de antrona 0,2% em ácido sulfúrico concentrado (conservar na geladeira) 
 
Técnica - Preparar 7 tubos de ensaio contendo 4 gotas de iodo e 3 mL de água, para 
efetuar o teste com o iodo. Para o teste com antrona preparar 7 tubos de ensaio contendo 2 mL de 
reagente de antrona em cada um deles. 
 
- Preparar dois cálices contendo 50 mL de solução tampão em cada um. Preparar dois sacos de 
diálise, contendo 5 mL de solução de amido e 4 mL de solução tampão e colocá-los em cada um 
dos respectivos cálices. Identificá-los como controle (C) e amostra (A). 
 
Amilose e/ou Amilopectina 
α-amilase salivar 
 
 37° C 
Oligossacarídeos + 
Maltotriose + Maltose + Glicose 
P á g i n a | 61 
 
 
- A seguir adicionar 1 mL de água no controle (C) e 1 mL de saliva na amostra (A). Homogeneizar 
e imediatamente retirar 1 mL de dentro do saco de diálise, para o teste do iodo e 1 mL de fora, 
tanto no controle como na amostra. Este é o tempo zero. Fechar os sacos com prendedores e 
colocá-los nos respectivos cálices. A partir daí, nos tempos 5, 10 e 15 minutos, retirar 1 mL de 
dentro do saco de diálise para o teste do iodo e 1 mL de fora (dialisado) para o teste de antrona 
apenas no cálice referente à amostra (A). Decorridos 20 minutos, repetir o procedimento anterior, 
inclusive no cálice referente ao controle (C). Analisar os resultados obtidos.